疑難問題交流

1、疑難問題交流限制性內(nèi)切酶相關(guān)問題限制性內(nèi)切酶相關(guān)問題重組重組DNA分子導入細胞的問題分子導入細胞的問題PCR技術(shù)中的一些相關(guān)問題技術(shù)中的一些相關(guān)問題(1)限制性內(nèi)切酶能夠識別和切割單鏈DNA，例如有些酶能夠識別和切割非回文序列，但這種酶在基因工程應用不夠廣泛（一）限制性內(nèi)切酶能否切割單鏈？（一）限制性內(nèi)切酶能否切割單鏈？(2)基因工程中的限制性內(nèi)切酶主要主要是識別和切割雙鏈DNA，因為大多數(shù)限制內(nèi)切酶是以二聚體二聚體的形式與DNA結(jié)合，酶與DNA形成穩(wěn)定的化合物，產(chǎn)生反應，也有部分酶是以單體單體的形式與DNA結(jié)合（二）限制酶識別序列的方向性（二）限制酶識別序列的方向性05全國理綜全國理綜限制性

2、內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶的識別序列和切點是的識別序列和切點是GGATCC，限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶的識別序列和切點是的識別序列和切點是GATC。在質(zhì)粒上有酶。在質(zhì)粒上有酶的一個切點，在目的基因的兩側(cè)各有的一個切點，在目的基因的兩側(cè)各有1個酶個酶的切點。的切點。請畫出質(zhì)粒被限制酶請畫出質(zhì)粒被限制酶切割后所形成的黏性末端。切割后所形成的黏性末端。請畫出目的基因兩側(cè)被限制酶請畫出目的基因兩側(cè)被限制酶切割后所形成的黏性末端。切割后所形成的黏性末端。在在DNA連接酶的作用下，上述兩種不同限制酶切割后形成的連接酶的作用下，上述兩種不同限制酶切割后形成的黏性末端能否連接起來？為什么？黏性末端能否連接起來？為什么？

3、答案：可以連接。因為由兩種不同限制酶切割后形成的黏性末端是可以連接。因為由兩種不同限制酶切割后形成的黏性末端是相同的（或是可以互補的）。相同的（或是可以互補的）。有人質(zhì)疑：有人質(zhì)疑：此時得到的目的基因與質(zhì)粒被限制酶此時得到的目的基因與質(zhì)粒被限制酶切割后所形成的黏性切割后所形成的黏性末端是無法進行堿基配對末端是無法進行堿基配對 這種情況根本不會出現(xiàn)這種情況根本不會出現(xiàn) DNA分子的兩條脫氧核苷酸長鏈是反向平行的，一條鏈是分子的兩條脫氧核苷酸長鏈是反向平行的，一條鏈是53方向，另一條是方向，另一條是35方向。在一般表示方向。在一般表示DNA分子分子堿基序列的圖中，上邊一條鏈是堿基序列的圖中，上邊一

4、條鏈是53方向，下邊一條是方向，下邊一條是35方向。限制性內(nèi)切酶的識別序列也是有方向性的，方向。限制性內(nèi)切酶的識別序列也是有方向性的，通常寫出的限制酶的識別序列是專指通常寫出的限制酶的識別序列是專指53那條鏈上的堿那條鏈上的堿基序列。在上面的例題中，限制性內(nèi)切酶基序列。在上面的例題中，限制性內(nèi)切酶的識別序列和的識別序列和切點就是切點就是5GGATCC3，限制性內(nèi)切酶，限制性內(nèi)切酶的識別序的識別序列和切點是列和切點是5GATC3。所以上圖畫的序列中，目的。所以上圖畫的序列中，目的基因所在的基因所在的DNA序列，只有左邊具有一個限制性內(nèi)切酶序列，只有左邊具有一個限制性內(nèi)切酶的識別序列和切點，右邊的

5、那個序列是的識別序列和切點，右邊的那個序列是5CTAG3，不能被限制性內(nèi)切酶不能被限制性內(nèi)切酶識別和切割，因此上述設(shè)想的那種識別和切割，因此上述設(shè)想的那種情況不會出現(xiàn)。情況不會出現(xiàn)。 下圖表示限制酶切割某DNA的過程，從圖中可知，該限制酶能識別的堿基序列及切點是ACTTAAG，切點在C和T之間BCTTAAG，切點在G和A之間CGAATTC，切點在G和A之間DCTTAAC，切點在C和T之間C CaCl2法制備感受態(tài)細胞及轉(zhuǎn)化過程：細菌處于0，CaCl2的低滲溶液中，菌細胞膨脹成球形，制成感受態(tài)，經(jīng)42短時間熱沖擊處理能提高轉(zhuǎn)化的效率。其中的鈣離子的作用機理（假說）：其中的鈣離子的作用機理（假說）

6、：（1）改變了細胞壁的通透性（用氯化鈣處理大腸桿菌，增加大腸桿菌細胞壁的通性）：使細胞壁局部原生質(zhì)化，增加細胞壁的通透性（2）改變了細胞膜的通透性 低溫的CaCl2溶液中，（1）Ca2+會使細胞膜磷脂雙分子層形成液晶結(jié)構(gòu)液晶結(jié)構(gòu)，當42度度熱熱刺激短暫處理細菌細胞時，細胞膜的液晶結(jié)構(gòu)會發(fā)生劇烈擾動，并隨機出現(xiàn)許多間隙間隙，為DNA分子提供進入細胞的通道。（2）促使細胞外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核核酸酶酸酶解離開來，離開所在區(qū)域，同時Ca2+能與加入的DNA分子結(jié)合，形成抗脫氧核抗脫氧核糖核酸酶糖核酸酶的羥基磷酸鈣復合物，并粘附在細菌細胞膜的外表面上 實驗一細菌感受態(tài)的制備和質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化實驗目的實驗目

7、的通過實驗學會感受態(tài)細胞的制備方法和DNA轉(zhuǎn)化的最基本操作,以及如何提高轉(zhuǎn)化效率的思路.本實驗綜合因素較多,難度較大,是分子生物學中的一個很關(guān)鍵的實驗手段.實驗原理實驗原理轉(zhuǎn)化是指某一細胞系由于接受了外源DNA,而導致其原來的遺傳性狀發(fā)生改變,這種遺傳性狀包括遺傳型和表型的改變.感受態(tài)是受體菌能接受外源DNA能力的一種生理狀態(tài).用用CaCl2處理細菌處理細菌,改變細胞膜的結(jié)構(gòu)改變細胞膜的結(jié)構(gòu),使質(zhì)粒DNA能夠穿過細菌細胞膜進入細胞.然后在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化處理過的細菌,轉(zhuǎn)化成功的細菌可以在選擇性培養(yǎng)基上生長形成菌落. （1）利用PCR技術(shù)擴增特異性的片段，需要知道該片段兩端的一小段序列。因為PCR過程中必須需要引物（2）引物的長度一般在15-30bp之間16-24最佳，不可超過38bp；可擴增的長度以200-500bp