第十章 發(fā)酵染菌及其控制

1、主講：鮑成滿第十章第十章 發(fā)酵染菌及其防治發(fā)酵染菌及其防治知識目標知識目標l掌握染菌對發(fā)酵過程的影響；掌握染菌對發(fā)酵過程的影響；l掌握發(fā)酵異常現(xiàn)象及原因分析掌握發(fā)酵異?，F(xiàn)象及原因分析l掌握雜菌污染的途徑掌握雜菌污染的途徑能力目標：能力目標：l能夠發(fā)現(xiàn)種子培養(yǎng)和發(fā)酵的異?，F(xiàn)象；能夠發(fā)現(xiàn)種子培養(yǎng)和發(fā)酵的異?，F(xiàn)象；l能進行染菌的檢查和判斷、發(fā)酵染菌原因能進行染菌的檢查和判斷、發(fā)酵染菌原因分析；分析；l能雜菌污染的挽救與處理措施。能雜菌污染的挽救與處理措施。第一節(jié)第一節(jié) 染菌對發(fā)酵的影響染菌對發(fā)酵的影響第二節(jié)第二節(jié) 發(fā)酵染菌的分析發(fā)酵染菌的分析第三節(jié)第三節(jié) 雜菌污染的途徑和防止染菌雜菌污染的途徑和防止

2、染菌第一節(jié)第一節(jié) 染菌對發(fā)酵的影響染菌對發(fā)酵的影響 純種培養(yǎng)要求必須防止雜菌污染，為防純種培養(yǎng)要求必須防止雜菌污染，為防止染菌，采取措施：止染菌，采取措施：密閉式發(fā)酵罐、無密閉式發(fā)酵罐、無 菌空氣、無菌室、培養(yǎng)菌空氣、無菌室、培養(yǎng)基和設(shè)備滅菌、無菌操作基和設(shè)備滅菌、無菌操作 染菌率的統(tǒng)計染菌率的統(tǒng)計 以發(fā)酵罐染菌批（次）為基準，染菌罐以發(fā)酵罐染菌批（次）為基準，染菌罐批（次）應(yīng)包括染菌重消的重復(fù)染菌批批（次）應(yīng)包括染菌重消的重復(fù)染菌批（次）在內(nèi)。整個發(fā)酵周期中，無論前期（次）在內(nèi)。整個發(fā)酵周期中，無論前期或后期染菌，均作或后期染菌，均作“染菌染菌”論處。論處。發(fā)酵（罐）染菌批（次）發(fā)酵（罐）染

3、菌批（次）總投罐批（次）總投罐批（次）染菌率（染菌率（%） = = 100% 100% 一一 染菌對不同發(fā)酵過程的影響染菌對不同發(fā)酵過程的影響 青霉素發(fā)酵：發(fā)酵前、中、后期都很容易青霉素發(fā)酵：發(fā)酵前、中、后期都很容易感染能產(chǎn)青霉素酶的雜菌，能使青霉素迅速感染能產(chǎn)青霉素酶的雜菌，能使青霉素迅速破壞，使發(fā)酵一無所獲。破壞，使發(fā)酵一無所獲。檸檬酸發(fā)酵：產(chǎn)酸后，發(fā)酵液檸檬酸發(fā)酵：產(chǎn)酸后，發(fā)酵液pHpH很低，很低，不易染菌，主要防止前期染菌。但對于不易染菌，主要防止前期染菌。但對于能在較低能在較低pHpH發(fā)酵液中生長的雜菌來講，發(fā)酵液中生長的雜菌來講，其對檸檬素發(fā)酵危害也很大，如青霉菌。其對檸檬素發(fā)酵危

4、害也很大，如青霉菌。谷氨酸發(fā)酵：周期短，產(chǎn)酸快，培養(yǎng)谷氨酸發(fā)酵：周期短，產(chǎn)酸快，培養(yǎng)基不太豐富，不易染菌，主要防噬菌體?；惶S富，不易染菌，主要防噬菌體。一旦受到噬菌體污染，其蔓延迅速，難一旦受到噬菌體污染，其蔓延迅速，難以防治，而且容易造成連續(xù)污染。以防治，而且容易造成連續(xù)污染。 疫苗發(fā)酵：現(xiàn)在疫苗多采用深層培養(yǎng)，疫苗發(fā)酵：現(xiàn)在疫苗多采用深層培養(yǎng)，這是一類不加提純而直接使用的產(chǎn)品，這是一類不加提純而直接使用的產(chǎn)品，在其深層培養(yǎng)過程中，一旦污染雜菌，在其深層培養(yǎng)過程中，一旦污染雜菌，不論死菌、活菌或內(nèi)外毒素，都應(yīng)全部不論死菌、活菌或內(nèi)外毒素，都應(yīng)全部廢棄。廢棄。 肌苷、肌苷酸發(fā)酵：生產(chǎn)菌為多

5、種營肌苷、肌苷酸發(fā)酵：生產(chǎn)菌為多種營養(yǎng)缺陷型，生產(chǎn)能力差，培養(yǎng)基營養(yǎng)豐養(yǎng)缺陷型，生產(chǎn)能力差，培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，易受到各種生長較快的雜菌污染，富，易受到各種生長較快的雜菌污染，如芽孢桿菌，而且染菌后培養(yǎng)基中營養(yǎng)如芽孢桿菌，而且染菌后培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分迅速消耗，嚴重抑制生長菌生長和成分迅速消耗，嚴重抑制生長菌生長和產(chǎn)物的生成。產(chǎn)物的生成。二二 不同時間發(fā)生染菌對發(fā)酵的影響不同時間發(fā)生染菌對發(fā)酵的影響 種子培養(yǎng)期染菌：培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，容易種子培養(yǎng)期染菌：培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，容易染菌，而且種子染菌對發(fā)酵危害較大，應(yīng)嚴染菌，而且種子染菌對發(fā)酵危害較大，應(yīng)嚴格控制種子污染。格控制種子污染。發(fā)酵前期染菌：較容易染菌

6、，污染后雜菌發(fā)酵前期染菌：較容易染菌，污染后雜菌迅速繁殖，與生產(chǎn)菌爭奪營養(yǎng)成分和氧，嚴迅速繁殖，與生產(chǎn)菌爭奪營養(yǎng)成分和氧，嚴重抑制生產(chǎn)菌的生長繁殖，最終導(dǎo)致產(chǎn)物的重抑制生產(chǎn)菌的生長繁殖，最終導(dǎo)致產(chǎn)物的積累大大減少，甚至造成發(fā)酵失敗。積累大大減少，甚至造成發(fā)酵失敗。發(fā)酵中期染菌：發(fā)酵中期染菌： 危害極大，不但影響生產(chǎn)菌的繼續(xù)生長，危害極大，不但影響生產(chǎn)菌的繼續(xù)生長，還會嚴重干擾生產(chǎn)菌的產(chǎn)物合成代謝，減少還會嚴重干擾生產(chǎn)菌的產(chǎn)物合成代謝，減少產(chǎn)物的生成。而且由于營養(yǎng)成分大量消耗，產(chǎn)物的生成。而且由于營養(yǎng)成分大量消耗，發(fā)酵產(chǎn)物正在大量積累，一般挽救處理困難，發(fā)酵產(chǎn)物正在大量積累，一般挽救處理困難，危

7、害性很大。故在實際生產(chǎn)中應(yīng)做到早發(fā)現(xiàn)危害性很大。故在實際生產(chǎn)中應(yīng)做到早發(fā)現(xiàn)快處理。快處理。發(fā)酵后期染菌：發(fā)酵后期染菌： 發(fā)酵后期產(chǎn)物積累較多，營養(yǎng)接近耗盡，發(fā)酵后期產(chǎn)物積累較多，營養(yǎng)接近耗盡，此時染菌影響相對小些，一般可繼續(xù)發(fā)酵；此時染菌影響相對小些，一般可繼續(xù)發(fā)酵；若污染嚴重，可采取提前放罐來減少損失。若污染嚴重，可采取提前放罐來減少損失。三三 染菌程度對發(fā)酵的影響染菌程度對發(fā)酵的影響 染菌程度越大，即進入發(fā)酵罐的雜菌染菌程度越大，即進入發(fā)酵罐的雜菌數(shù)目越多，對發(fā)酵的危害越大數(shù)目越多，對發(fā)酵的危害越大 染少量雜菌，有時可以容忍。染少量雜菌，有時可以容忍。 四四 染菌對產(chǎn)物提取和產(chǎn)品質(zhì)量的影響

8、染菌對產(chǎn)物提取和產(chǎn)品質(zhì)量的影響 菌體自溶，發(fā)酵液發(fā)粘、發(fā)臭，過濾菌體自溶，發(fā)酵液發(fā)粘、發(fā)臭，過濾困難困難第二節(jié)第二節(jié) 發(fā)酵染菌的分析發(fā)酵染菌的分析一一 發(fā)酵染菌的異常現(xiàn)象發(fā)酵染菌的異?，F(xiàn)象 指由于發(fā)酵染菌導(dǎo)致發(fā)酵過程中某些物理參指由于發(fā)酵染菌導(dǎo)致發(fā)酵過程中某些物理參數(shù)、化學參數(shù)或生物參數(shù)發(fā)生于原有規(guī)律不同數(shù)、化學參數(shù)或生物參數(shù)發(fā)生于原有規(guī)律不同的改變。的改變。1 1 種子培養(yǎng)染菌后的異?，F(xiàn)象種子培養(yǎng)染菌后的異?，F(xiàn)象2 2 發(fā)酵染菌后的異?，F(xiàn)象發(fā)酵染菌后的異?，F(xiàn)象1 1 種子培養(yǎng)染菌后的異?，F(xiàn)象種子培養(yǎng)染菌后的異?，F(xiàn)象 菌體濃度異常：包括菌體濃度逐漸降菌體濃度異常：包括菌體濃度逐漸降低和菌體濃度

9、迅速升高低和菌體濃度迅速升高 理化指標異常：雜菌生長則導(dǎo)致宏觀理化指標異常：雜菌生長則導(dǎo)致宏觀理化指標發(fā)生變化，如溫度、理化指標發(fā)生變化，如溫度、pHpH值等值等 代謝異常：碳源、氮源消耗速度發(fā)生代謝異常：碳源、氮源消耗速度發(fā)生變化。變化。2 2 發(fā)酵染菌后的異?，F(xiàn)象發(fā)酵染菌后的異?，F(xiàn)象 菌體濃度異常：發(fā)酵中菌體或菌絲濃菌體濃度異常：發(fā)酵中菌體或菌絲濃度是固有規(guī)律在變化度是固有規(guī)律在變化 pHpH值過高或過低：值過高或過低：pHpH值變化是所有值變化是所有代謝的綜合反映，固定發(fā)酵階段代謝的綜合反映，固定發(fā)酵階段pHpH值值具有一定規(guī)律具有一定規(guī)律 溶解氧和二氧化碳水平異常：可以斷溶解氧和二氧化

10、碳水平異常：可以斷定是發(fā)生染菌現(xiàn)象定是發(fā)生染菌現(xiàn)象 泡沫過多：污染噬菌體非常容易產(chǎn)生泡沫過多：污染噬菌體非常容易產(chǎn)生過多泡沫過多泡沫 代謝異常：營養(yǎng)物質(zhì)的利用和產(chǎn)物的代謝異常：營養(yǎng)物質(zhì)的利用和產(chǎn)物的生成出現(xiàn)異?，F(xiàn)象。生成出現(xiàn)異?，F(xiàn)象。二二 染菌的檢查與判斷染菌的檢查與判斷1. 1.染菌的檢查染菌的檢查 顯微鏡檢查法（最簡單、最直接、最顯微鏡檢查法（最簡單、最直接、最經(jīng)常）經(jīng)常） 平板劃線培養(yǎng)或斜面培養(yǎng)檢查法；平板劃線培養(yǎng)或斜面培養(yǎng)檢查法； 平板制好后，應(yīng)先保溫平板制好后，應(yīng)先保溫2424小時，確定無小時，確定無菌菌 肉湯培養(yǎng)基檢查法（酚紅變色肉湯培養(yǎng)基檢查法（酚紅變色pH6.8-pH6.8-8

11、.48.4） 雙層平板培養(yǎng)法檢查雙層平板培養(yǎng)法檢查2.2.檢查法的不足檢查法的不足 以上以上3 3種檢查法未發(fā)現(xiàn)染菌，還不能肯種檢查法未發(fā)現(xiàn)染菌，還不能肯定未被染菌定未被染菌 原因是以上檢查法只能檢查雜菌濃度原因是以上檢查法只能檢查雜菌濃度較大的染菌情況（較大的染菌情況（11個個/ml/ml）三三 染菌原因的分析染菌原因的分析 造成發(fā)酵染菌的原因有很多，歸納起來造成發(fā)酵染菌的原因有很多，歸納起來有：種子帶菌、無菌空氣帶菌、設(shè)備滲漏、有：種子帶菌、無菌空氣帶菌、設(shè)備滲漏、原輔料滅菌不徹底、操作失誤和技術(shù)管理原輔料滅菌不徹底、操作失誤和技術(shù)管理不善。不善。 項目項目 百分率百分率%總空氣系統(tǒng)有菌總

12、空氣系統(tǒng)有菌 19.96種子帶菌或懷疑種子帶菌種子帶菌或懷疑種子帶菌 9.64夾套穿孔夾套穿孔 12.36盤管穿孔盤管穿孔 5.89接種管穿孔接種管穿孔 0.39閥門滲漏閥門滲漏 1.45攪拌軸密封滲漏攪拌軸密封滲漏 2.09罐蓋漏罐蓋漏 1.54其它設(shè)備滲漏其它設(shè)備滲漏 10.13操作原因操作原因 10.15接種時罐壓跌零接種時罐壓跌零 0.19培養(yǎng)基滅菌不透培養(yǎng)基滅菌不透 0.79泡沫冒頂泡沫冒頂 0.48原因不明原因不明 24.94幾幾家家抗抗生生素素工工廠廠發(fā)發(fā)酵酵染染菌菌原原因因 返回 項目項目 百分率百分率%管理不善管理不善 25. 08閥門滲漏閥門滲漏 23.30盤管穿孔盤管穿孔

13、 14.20種子帶菌種子帶菌 14.15空氣系統(tǒng)有菌空氣系統(tǒng)有菌 10.0其它其它 7.49原因不明原因不明 5.78 上海第三制藥廠染菌原因分析上海第三制藥廠染菌原因分析 返回 管理不善而染菌的有管理不善而染菌的有31個罐批，占個罐批，占25.08。經(jīng)分析有下列原因：經(jīng)分析有下列原因： 項目項目 百分率百分率%進罐前未做設(shè)備嚴密度檢查進罐前未做設(shè)備嚴密度檢查 25.8接種違反操作規(guī)程接種違反操作規(guī)程 25.8檢修質(zhì)量缺乏驗收制度檢修質(zhì)量缺乏驗收制度 19.35操作不熟練操作不熟練 19.35配料違反工藝規(guī)程配料違反工藝規(guī)程 6.45調(diào)度不當調(diào)度不當 3.25上海第四制藥廠鏈霉素發(fā)酵染菌原因分

14、析上海第四制藥廠鏈霉素發(fā)酵染菌原因分析 項目項目 百分率百分率%空氣系統(tǒng)有菌空氣系統(tǒng)有菌 26.00接種接種 11.00管理問題管理問題 7.80外界帶入雜菌（取樣、補料）外界帶入雜菌（取樣、補料） 8.20設(shè)備穿孔設(shè)備穿孔 7.60停電罐壓跌零停電罐壓跌零 1.60蒸汽壓力不足或蒸汽量不足蒸汽壓力不足或蒸汽量不足 0.60操作違反規(guī)程操作違反規(guī)程 1.60種子帶菌種子帶菌 0.60原因不明原因不明 35.00一般染菌原因分析一般染菌原因分析 不同染菌時間分析不同染菌時間分析 不同染菌類型分析不同染菌類型分析 不同染菌幅度分析不同染菌幅度分析（1 1）染菌的時間分析）染菌的時間分析種子培養(yǎng)階段

15、：種子，滅菌，操作；種子培養(yǎng)階段：種子，滅菌，操作；發(fā)酵前期：種子，滅菌，操作；發(fā)酵前期：種子，滅菌，操作；發(fā)酵后期：空氣，補料，設(shè)備滲漏，泡沫發(fā)酵后期：空氣，補料，設(shè)備滲漏，泡沫（2 2）染菌的雜菌種類分析：）染菌的雜菌種類分析：雜菌是耐熱的芽孢桿菌（滅菌、死角）雜菌是耐熱的芽孢桿菌（滅菌、死角）雜菌是不耐熱菌（種子帶菌、空氣帶菌，設(shè)雜菌是不耐熱菌（種子帶菌、空氣帶菌，設(shè)備滲漏，管理操作等）備滲漏，管理操作等）雜菌是真菌雜菌是真菌（3 3）染菌的規(guī)模分析）染菌的規(guī)模分析大批量發(fā)酵罐染菌：種子、空氣；大批量發(fā)酵罐染菌：種子、空氣； 前期：種子帶菌，滅菌問題；前期：種子帶菌，滅菌問題； 中后期：

16、空氣帶菌；中后期：空氣帶菌；部分發(fā)酵罐染菌：部分發(fā)酵罐染菌：個別發(fā)酵罐連續(xù)染菌：設(shè)備滲漏個別發(fā)酵罐連續(xù)染菌：設(shè)備滲漏第三節(jié)第三節(jié) 雜菌污染的途徑和防止染菌雜菌污染的途徑和防止染菌一一種子帶菌及防治種子帶菌及防治二二空氣帶菌及防治空氣帶菌及防治三三培養(yǎng)基和設(shè)備滅菌不徹底導(dǎo)致染菌及防治培養(yǎng)基和設(shè)備滅菌不徹底導(dǎo)致染菌及防治四四操作失誤和設(shè)備滲漏導(dǎo)致的染菌及防治操作失誤和設(shè)備滲漏導(dǎo)致的染菌及防治五五噬菌體污染及防治噬菌體污染及防治六六染菌的挽救與處理染菌的挽救與處理1 1、種子帶菌的防治、種子帶菌的防治 菌種在培養(yǎng)或保存過程中受污染（試菌種在培養(yǎng)或保存過程中受污染（試管塞，查看的時候要注意）管塞，查看

17、的時候要注意） 培養(yǎng)基及用具滅菌要徹底，應(yīng)防止假培養(yǎng)基及用具滅菌要徹底，應(yīng)防止假壓壓 菌種在轉(zhuǎn)接過程中受污染：操作不當，菌種在轉(zhuǎn)接過程中受污染：操作不當，管理不嚴；（緩沖間）管理不嚴；（緩沖間）2 2、無菌空氣帶菌及其防止：、無菌空氣帶菌及其防止： 流程設(shè)計，介質(zhì)滅菌流程設(shè)計，介質(zhì)滅菌3 3、培養(yǎng)基和設(shè)備滅菌不徹底導(dǎo)致染菌及防治、培養(yǎng)基和設(shè)備滅菌不徹底導(dǎo)致染菌及防治 原料性狀：淀粉質(zhì)原料，升溫過快或原料性狀：淀粉質(zhì)原料，升溫過快或混合不均勻，易結(jié)塊，團塊中包埋的混合不均勻，易結(jié)塊，團塊中包埋的活菌不易殺滅；可升溫前攪拌和加淀活菌不易殺滅；可升溫前攪拌和加淀粉酶粉酶 實罐滅菌時未充分排除罐內(nèi)空氣

18、：造實罐滅菌時未充分排除罐內(nèi)空氣：造成假壓，升溫時，應(yīng)打開排氣等閥門成假壓，升溫時，應(yīng)打開排氣等閥門放氣。放氣。 連續(xù)滅菌時，蒸汽壓力波動大，培養(yǎng)連續(xù)滅菌時，蒸汽壓力波動大，培養(yǎng)基未達到滅菌溫度，導(dǎo)致滅菌不徹底基未達到滅菌溫度，導(dǎo)致滅菌不徹底 設(shè)備和管道存在設(shè)備和管道存在“死角死角” 死角：由于操作、設(shè)備結(jié)構(gòu)、安裝死角：由于操作、設(shè)備結(jié)構(gòu)、安裝或人為造成的屏障等原因，引起蒸汽或人為造成的屏障等原因，引起蒸汽不能有效到達或不能充分到達預(yù)定應(yīng)不能有效到達或不能充分到達預(yù)定應(yīng)該到達的局部滅菌部位，從而不能達該到達的局部滅菌部位，從而不能達到徹底滅菌的要求。到徹底滅菌的要求。常見的設(shè)備、管道常見的設(shè)備

19、、管道“死角死角” 發(fā)酵罐的發(fā)酵罐的“死角死角”：不銹鋼襯里破裂造成死：不銹鋼襯里破裂造成死角，發(fā)酵罐罐底膿皰狀積垢。角，發(fā)酵罐罐底膿皰狀積垢。4 4、設(shè)備滲漏引起的染菌及其防止、設(shè)備滲漏引起的染菌及其防止 發(fā)酵設(shè)備、管道、閥門長期使用，由發(fā)酵設(shè)備、管道、閥門長期使用，由于腐蝕、摩擦和振動等原因，造成滲于腐蝕、摩擦和振動等原因，造成滲漏漏 微小滲漏的檢查：加入堿性水，用浸微小滲漏的檢查：加入堿性水，用浸濕酚酞濕酚酞 指示劑的白布擦，有滲漏則指示劑的白布擦，有滲漏則白布顯紅色。白布顯紅色。5 5、操作失誤導(dǎo)致染菌及其防治、操作失誤導(dǎo)致染菌及其防治 滅菌過程中嚴防泡沫升頂，盡可能添滅菌過程中嚴防泡

20、沫升頂，盡可能添加消泡劑防止泡沫大量產(chǎn)生加消泡劑防止泡沫大量產(chǎn)生 傳感器探頭用化學試劑浸泡法滅菌可傳感器探頭用化學試劑浸泡法滅菌可能導(dǎo)致滅菌不徹底。能導(dǎo)致滅菌不徹底。 滅菌過程中嚴防泡沫升頂，盡可能添滅菌過程中嚴防泡沫升頂，盡可能添加消泡劑防止泡沫大量產(chǎn)生加消泡劑防止泡沫大量產(chǎn)生 傳感器探頭用化學試劑浸泡法滅菌可傳感器探頭用化學試劑浸泡法滅菌可能導(dǎo)致滅菌不徹底。能導(dǎo)致滅菌不徹底。6 6、噬菌體污染和防治、噬菌體污染和防治 （1 1）噬菌體污染的預(yù)防）噬菌體污染的預(yù)防 嚴格活菌體排放，切斷噬菌體的糧源嚴格活菌體排放，切斷噬菌體的糧源 做好環(huán)境衛(wèi)生，消滅噬菌體與雜菌做好環(huán)境衛(wèi)生，消滅噬菌體與雜菌 嚴防噬菌體與雜菌進入種子罐或發(fā)酵罐內(nèi)嚴防噬菌體與雜菌進入種子罐或發(fā)酵罐內(nèi) 抑制罐內(nèi)噬菌體的生長抑制罐內(nèi)噬菌體的生長（2 2）污染噬菌體后的處理方法）污染噬菌體