細胞的原代培養(yǎng)(共4頁)

1、精選優(yōu)質文檔-傾情為你奉上細胞原代培養(yǎng)【實驗目的】1. 理解細胞原代培養(yǎng)原理2. 熟悉細胞原代培養(yǎng)方法與過程3. 了解細胞原代培養(yǎng)的應用 4. 獨立進行細胞原代培養(yǎng)操作【實驗原理】1、 原代培養(yǎng)實驗原理 細胞培養(yǎng)是生物學和醫(yī)學研究中最常用的手段之一，可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)兩種。原代培養(yǎng)是直接從生物體獲取組織或器官的一部分進行培養(yǎng)，即組織直接從機體獲取后,通過組織塊長出單層細胞,或者用酶消化或機械方法將組織分散成單個細胞開始培養(yǎng),在首次傳代前的培養(yǎng)可認為是原代培養(yǎng)。由于培養(yǎng)的細胞剛剛從活體組織分離出來，故更接近于生物體內的生活狀態(tài)。這一方法可為研究生物體細胞的生長，代謝，繁殖提供有力的手段。同

2、時也為以后傳代培養(yǎng)創(chuàng)造條件。原代培養(yǎng)的過程指動物的組織或器官從機體取出后，經機械法或各種酶類（常用胰蛋白酶）和鰲合劑（常用EDTA)處理，使之分散成單個細胞,加入適量培養(yǎng)基，置于合適的培養(yǎng)容器中，在無菌、適當溫度和一定條件下，使之生存、生長和繁殖的過程。原代培養(yǎng)的方法有：a. 組織塊法:在平皿中用彎頭剪把組織盡量剪碎，每個組織塊小于1mm3大小。用Hanks液洗滌23次，自然沉淀。用吸管吸去上清液。將組織塊貼于培養(yǎng)瓶進行培養(yǎng)。b. 酶消化法: 將1mm3大小的組織塊放入1個三角瓶內加入1030ml的0.125%的胰蛋白酶。370C磁棒攪拌消化2030分鐘。然后終止消化。用幾層無菌紗布過濾。取過

3、濾液，離心800rpm 510分鐘收集細胞。棄上清，加入帶有雙抗的培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)瓶培養(yǎng) 。 【實驗儀器、材料、試劑及用品】1.儀器：熒光顯微鏡，CO2培養(yǎng)箱2.材料：孕鼠3.試劑：(1) 培養(yǎng)液：為DMEM，添加10新生牛血清(NBS)、青霉素100 u ml 、鏈霉素100ugml。(2)消化液：為0.125胰蛋白酶0.02EDTA混合消化液。4.用品：鑷子，剪刀，培養(yǎng)瓶，試管，移液管，巴斯德吸管，廢液缸，75酒精棉球，酒精燈、小指管?！緦嶒灢襟E】(一)小鼠胚胎的準備:1. 取懷孕1618d的母鼠，斷頸處死，置于75%的酒精中。2. 無菌條件下暴露子宮。3. 用鑷子提起近子宮頸端，分離子宮

4、系膜， 剪斷子宮角。4. 取出整個子宮，置于盛有PBS或未添加血清的DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿內。用PBS洗滌3次，棄除表面殘余血跡。 5. 沿子宮系膜側剪開子宮，取出帶有胎膜的胚胎，置于另一盛有PBS或未添加血清的DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿內。充分洗滌，清洗表面。 6. 用小鑷子撕破胎膜，取出胎鼠，棄除胎膜。用PBS洗滌3次。7. 去除胚胎頭部、內臟和四肢。將軀干部置于另一盛有PBS或未添加血清的DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿內。用PBS至少洗滌3次，充分棄除紅細胞。(二)小鼠胚胎成纖維細胞的培養(yǎng)：1.用無菌眼科小剪刀或剃須刀片將鼠胚軀干剪(切)成1mm3以下的碎塊，吸置于離心管內。2.室溫下靜置1min。

5、棄上層液，留下胚胎組織碎塊。 3.添加胎牛血清接種到培養(yǎng)瓶內。每5-30個鼠胚的組織塊可使用1個100ml的培養(yǎng)瓶。靜置5min后，倒置加入適量培養(yǎng)液，并倒置在37、5CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4.2-3小時后,將培養(yǎng)瓶翻轉過來，使培養(yǎng)液覆蓋植塊。繼續(xù)在37、5CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5.培養(yǎng)開始的前兩天不要晃動培養(yǎng)瓶。第三天見植塊附著在培養(yǎng)瓶壁，周圍生長出細胞。補充培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，每天倒置在顯微鏡下觀察。過4天后在倒置顯微鏡下觀察拍片?！緦嶒灲Y果】圖二 小鼠胚胎成纖維細胞原代培養(yǎng)【結果分析】 從照片來看，細胞原代培養(yǎng)較成功，大部分細胞活性較好，呈梭形附著與瓶壁上，密度適中，死細胞

6、較少?？衫^續(xù)進行后續(xù)傳代培養(yǎng)。【注意事項】1.原代培養(yǎng)材料的選擇,盡量選取胚胎或幼小的生物體組織或者繁殖能力較強的組織，如腫瘤組織等。2.要注意無菌操作。其要求應高于外科手術。3.運用消化法時胰酶溫度應小于370C，濃度只需平時消化細胞濃度的一半。因為此過程不像消化培養(yǎng)細胞時的110分鐘，而是至少20分鐘，先消化下來的細胞在此胰酶消化液中可存活10分鐘以上。如果胰酶作用過強，則這些細胞膜易被損傷而不易生存。4.如使用組織塊法，則應待組織塊略干燥，能粘附于瓶壁時再使之與培養(yǎng)液接觸。翻轉培養(yǎng)瓶時要輕，勿使組織塊漂浮起來。如果組織塊沒有粘壁，則細胞不易生長，既使生長也因沒有貼在瓶壁上，而無法收集到。

7、【思考題】一、如何提高原代細胞培養(yǎng)的成功率？答：1. 在選擇材料的時候一定要注意選取比較健康的小鼠。在處理胚胎的時候要干凈利落。不要把胳膊等部位的細胞混進去了。2. 操作一定要無菌，不能污染。在剪碎細胞的時候，一定要注意盡量剪得碎一點。3. .運用消化法時胰酶溫度應小于37，濃度只需平時消化細胞濃度的一半4. 如使用組織塊法，則應待組織塊略干燥，能粘附于瓶壁時再使之與培養(yǎng)液接觸。翻轉培養(yǎng)瓶時要輕，勿使組織塊漂浮起來。5. 取材和原代細胞制作時，要用鋒利的器械，如手術刀或剃須刀片切碎組織，盡可能減少對細胞的機械損傷。二、為克服微生物污染應采取那些措施？答：超凈工作臺紫外線處理30分鐘, 用肥皂洗手, 穿鞋套，用洗滌液拭擦雙手消毒。用75%酒精擦雙手、移液器消毒