木瓜蛋白酶的提取

1、木瓜蛋白酶的提取、分離純化及其生物學(xué)研究綜述及實(shí)驗(yàn)方法13生物技術(shù)第二大組第二小組組員：王玓玥（組長(zhǎng)）、王子賀、王思瑤、王宇濤、王守鑫、譚國(guó)棟一、 研究背景： 在經(jīng)濟(jì)飛速發(fā)展的今天，人們的生活水平已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不只在于吃飽穿暖，食品的安全和營(yíng)養(yǎng)問(wèn)題受到人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注，綠色健康的生活也成為大家共同的追求，木瓜蛋白酶以它自身耐熱及特殊結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)被廣泛的用于食品行業(yè)，如何分離純化得到高純度低成本的木瓜蛋白酶則是人們現(xiàn)在研究的重點(diǎn)，本小組便也以此為研究主題展開(kāi)實(shí)驗(yàn)。二、 木瓜蛋白酶基本介紹： 木瓜蛋白酶，又稱(chēng)木瓜酶，是一種蛋白水解酶。木瓜蛋白酶是番木瓜中含有的一種低特異性蛋白水解酶，廣泛地存在于番木瓜的根

2、、莖、葉和果實(shí)內(nèi)，其中在未成熟的乳汁中含量最豐富。木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，屬于巰基蛋白酶，它具有酶活高、熱穩(wěn)定性好、天然衛(wèi)生安全等特點(diǎn)，這種蛋白水解酶，分子量為23406，由一種單肽鏈組成，含有212個(gè)氨基酸殘基。至少有三個(gè)氨基酸殘基存在于酶的活性中心部位，他們分別是Cys25、His159和Asp158，當(dāng)Cys25被氧化劑氧化或與金屬離子結(jié)合時(shí)，酶的活力被抑制，而還原劑半胱氨酸（或亞硫酸鹽）或EDTA能恢復(fù)酶的活力 木瓜蛋白酶是一種在酸性、中性、堿性環(huán)境下均能分解蛋白質(zhì)的蛋白酶。它的外觀為白色至淺黃色的粉末，微有吸濕性；木瓜蛋白酶溶于水和甘油，水溶液為無(wú)色或淡黃色，有時(shí)呈乳白色；幾

3、乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有機(jī)溶劑。木瓜蛋白酶是一種含巰基(-SH)肽鏈內(nèi)切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有較廣泛的特異性，對(duì)動(dòng)植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有較強(qiáng)的水解能力，但幾乎不能分解蛋白胨。木瓜蛋白酶的最適合PH值67(一般39.5皆可)，在中性或偏酸性時(shí)亦有作用，等電點(diǎn)（pI）為8.75；木瓜蛋白酶的最適合溫度5565(一般1085皆可)，耐熱性強(qiáng)，在90時(shí)也不會(huì)完全失活；受氧化劑抑制，還原性物質(zhì)激活。 。另外六個(gè)半胱氨酸殘基形成了三對(duì)二硫鍵,且都不在活性部位。純木瓜蛋白酶制品可含有：（1）木瓜蛋白酶，分子量21000，約占可溶性蛋白質(zhì)的10%；（2）木瓜凝乳蛋白酶，分子量26000，約占

4、可溶性蛋白質(zhì)的45%；（3）溶菌酶，分子量25000，約占可溶性蛋白質(zhì)的20%；及纖維素酶等不同的酶。因此在食品、醫(yī)藥、飼料、日化、皮革及紡織等行業(yè)得到廣泛應(yīng)用，是一類(lèi)巰基蛋白酶, 廣泛地存在于番木瓜的莖葉和果實(shí)中, 未成熟的乳汁中含量最高.因其含量高、穩(wěn)定性好、蛋白水解能力強(qiáng), 對(duì)多種蛋白質(zhì)均具有很好的降解作用, 目前已被廣泛應(yīng)用于各個(gè)行業(yè).在食品中, 木瓜蛋白酶被用于肉類(lèi)嫩化、啤酒澄清和魚(yú)類(lèi)加工等工藝中.由于此酶為純天然產(chǎn)物, 其開(kāi)發(fā)前景廣闊.運(yùn)用蛋白質(zhì)分離純化的一般方法可將其制備出來(lái)并進(jìn)行活力鑒定。三、 木瓜蛋白酶的提取1、過(guò)去的常規(guī)提取方法（1）、烘干法：在番木瓜漿液中加入保護(hù)劑，然后

5、將漿液離心，取上清液放置于鼓風(fēng)干燥箱中，在5560烘干，粉碎后即得到粗酶制品。乙引等用這種方法所獲得的酶得率為23.1%，但此法不利于酶活的保持，其酶活力僅為0.16×105U/g，且產(chǎn)品的純度較低。（2）單寧沉淀法：乙引等用單寧沉淀法提取了木瓜蛋白酶。先將番木瓜乳汁離心，于上清液中緩慢加入已溶解的單寧溶液，不斷攪拌，使溶液中單寧達(dá)到一定濃度。靜置，沉淀單寧-酶復(fù)合物，調(diào)節(jié)pH值，沉淀后進(jìn)行真空干燥，得到酶制品。結(jié)果表明，這種方法生產(chǎn)的酶得率較低，僅有7.3%，但酶活力較高，為3.53×105U/g。但是這種方法存在環(huán)境污染等問(wèn)題。2、目前較為常見(jiàn)的提取方法（1）、超濾法：

6、譚晶等用超濾技術(shù)分離木瓜蛋白酶。先將中空纖維超濾膜洗凈，經(jīng)過(guò)處理后，控制一定壓力和流量，進(jìn)行超濾。木瓜蛋白酶是大分子物質(zhì)，在超濾過(guò)程中被截留，而水及小分子雜質(zhì)透過(guò)膜，從而達(dá)到分離和純化的目的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，超濾后木瓜蛋白酶的活力是超濾前的1.22倍，蛋白質(zhì)含量為超濾前的2.8倍，說(shuō)明超濾后木瓜蛋白酶的純度有所增加。但由于木瓜蛋白酶屬于大分子物質(zhì)，在超濾過(guò)程中會(huì)在膜表面聚積而產(chǎn)生濃差極化現(xiàn)象，使超濾速率逐漸下降影響酶得率。（2）、鹽析法：王麗彬等曾用硫酸銨沉淀法分離木瓜蛋白酶。在粗酶液中加入一定濃度的硫酸銨溶液進(jìn)行鹽析，然后調(diào)pH值，離心取沉淀，干燥，得酶產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用該法制備的木瓜蛋白

7、酶純度相對(duì)較高，酶的比活力達(dá)到了1184U/mg，適宜作為化妝品成分。但這種方法由于用了大量的鹽，使酶中灰分增加，同時(shí)降低了木瓜蛋白酶的活性。因此，鹽析法并不是理想的木瓜蛋白酶提取方法。（3）、絮凝法：絮凝法是在木瓜乳膠水提取液中添加某種化合物，該化合物能與木瓜蛋白酶生成難溶性的復(fù)合物，從而使酶從溶液中沉淀析出。何繼芹等研究了用絮凝技術(shù)純化木瓜蛋白酶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在適宜的條件下進(jìn)行絮凝處理，可使木瓜蛋白酶在這步的收率達(dá)9597%。但這種方法提取專(zhuān)一性不強(qiáng)，制得的木瓜蛋白酶純度不高，雜質(zhì)含量較高。（4）、超聲波法：超聲波提取法作為一種新型的提取技術(shù)已經(jīng)比較廣泛地應(yīng)用于天然植物有效成分的提取。超

8、聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)，一方面賦予溶劑對(duì)細(xì)胞壁更大的滲透力，并強(qiáng)化細(xì)胞內(nèi)外的質(zhì)量傳輸，另一方面破壞細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)含物更易釋放，從而強(qiáng)化了提取過(guò)程。超聲波形成的微射流效應(yīng)也是提高提取率的一個(gè)重要原因。肖貴平曾用超聲波法提取木瓜蛋白酶。選擇新鮮的番木瓜，清洗后切塊破碎，稱(chēng)取果肉，打漿；果漿在一定條件下進(jìn)行超聲波處理，離心、除雜、過(guò)濾后，上清液進(jìn)行超濾濃縮，收集酶液樣品。結(jié)果表明：超聲功率300W，超聲時(shí)間200s，果漿質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%，這時(shí)酶活力是未經(jīng)超聲波處理的1.71倍。采用超聲波提取工藝得到的粗酶液的含量較低，含有較多雜質(zhì)，經(jīng)膜分離初步純化濃縮后，還需作進(jìn)一步純化處理，這有待于進(jìn)一步深入研究，以

9、提高酶的活性和純度。 （5）、親和膜色譜法：親和膜色譜技術(shù)是一種20世紀(jì)80年代末發(fā)展起來(lái)的生物大分子分離純化的新技術(shù)，把膜分離與親和分離結(jié)合起來(lái)，使之兼具膜分離與親和分離的特點(diǎn)。聶華麗等以尼龍膜為基質(zhì)，鍵合殼聚糖進(jìn)行表面改性處理，以降低尼龍膜的非特異性吸附，并偶聯(lián)染料配體Cibacron Blue F3GA，得到一種新型的親和膜色譜材料，并用其對(duì)木瓜蛋白酶進(jìn)行分離。結(jié)果表明，該親和膜具有良好的色譜性能，對(duì)木瓜蛋白酶有較高的吸附量（235.3mg/g），使用該親和膜對(duì)木瓜粉中的木瓜蛋白酶進(jìn)行分離純化，純化倍數(shù)可達(dá)46.5倍。親和膜色譜與傳統(tǒng)的膜分離、親和色譜相比，不僅具有純化倍數(shù)高、壓降小，分

10、析時(shí)間短、生物大分子在分離過(guò)程中變性機(jī)率小，允許較快的加料速度等特點(diǎn)，而且比柱親和色譜更易實(shí)現(xiàn)規(guī)模化純化分離。 （6）、雙水相萃取：雙水相萃取是利用物質(zhì)在不相溶的兩水相間分配系數(shù)的差異進(jìn)行萃取的方法。Sarote N等人用雙水相法提取了木瓜蛋白酶，結(jié)果表明，用8%的聚乙二醇和15%的硫酸銨組成的雙水相體系對(duì)木瓜蛋白酶的提取效果最好，酶的比活力可達(dá)1659U/mg，收率為86.2%。雙水相萃取具有目標(biāo)產(chǎn)物收率高、易于連續(xù)化操作、不存在有機(jī)溶劑殘留、分離過(guò)程經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，在木瓜蛋白酶的制備中應(yīng)有一席之地，但我國(guó)目前尚無(wú)這類(lèi)報(bào)道。隨著木瓜蛋白酶應(yīng)用的不斷開(kāi)發(fā)，對(duì)木瓜蛋白酶的純度要求也越來(lái)越高。因此迫切

11、需要特異性更大的制備木瓜蛋白酶的方法。開(kāi)發(fā)雙水相萃取技術(shù)，作為有效的高純度木瓜蛋白酶的分離提取方法，是很有意義的。四、木瓜蛋白酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用：1、作為肉類(lèi)嫩化劑：老齡畜禽肉煮熟后，口感粗糙、堅(jiān)硬，而加入嫩肉粉后，肉質(zhì)就會(huì)變的松軟、嫩化。嫩肉粉的主要成分之一是木瓜蛋白酶，一方面因?yàn)槟竟系鞍酌甘且环N半胱氨?；鞍酌福芙到饧≡w維和結(jié)締組織的蛋白酶。它將肌動(dòng)球蛋白和膠原蛋白降解成小分子的多肽甚至氨基酸，令其肌絲和筋腱絲斷裂，使肉類(lèi)變得嫩滑爽脆，從而使肉類(lèi)蛋白質(zhì)因結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)化而易于消化吸收；另一方面，由于嫩化劑比較充分的發(fā)揮作用是在肉品被蒸煮的期間，溫度較高，而木瓜蛋白酶最適合溫度5560，熱穩(wěn)定

12、性強(qiáng)，在90時(shí)也不會(huì)完全失活，因此常用于生產(chǎn)嫩肉粉。雷昌貴等人以新鮮牛肉為原料，研究了木瓜蛋白酶對(duì)牛肉肌原纖維小片化指數(shù)（MFI）及剪切力的影響，結(jié)果表明濃度為0.007%的木瓜蛋白酶溶液對(duì)牛肉的嫩化效果最佳，主要是由于木瓜蛋白酶促進(jìn)Z線的裂解，使肌原纖維小片化指數(shù)（MFI）發(fā)生顯著性增加，剪切力隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)顯著降低。B.M. Naveena等人曾研究了各類(lèi)植物蛋白酶對(duì)水牛肉的嫩化作用，結(jié)果表明，利用木瓜蛋白酶處理過(guò)的水牛肉，其肌原纖維蛋白溶解度顯著增加，剪切力值顯著減少。木瓜蛋白酶由于其良好的蛋白水解能力，可將其用于多方面。在海洋捕撈中低值魚(yú)和小雜魚(yú)占有很大的比例，如不好好利用就會(huì)造成

13、很大的浪費(fèi)，我們可以利用木瓜蛋白酶生產(chǎn)濃縮水解蛋白，而且這樣得到的蛋白優(yōu)于整魚(yú)肉或魚(yú)蛋白濃縮物，具有水溶性好、低脂、低灰分、高蛋白等特點(diǎn)。木瓜蛋白酶還可以用于由于阻止食品的褐變，回收屠宰的動(dòng)物骨頭中殘存的碎肉等。2、作為啤酒品質(zhì)改良劑：主要用于改良啤酒品質(zhì)。木瓜蛋白酶能水解啤酒內(nèi)的蛋白質(zhì)，部分水解一些已形成的復(fù)合物，產(chǎn)生更多的多肽或氨基酸，保證啤酒在冷凍過(guò)程中的高清澈度，同時(shí)改善啤酒口感及原有多肽和氨基酸的組成和比例，有效地改良啤酒品質(zhì)。據(jù)報(bào)道，對(duì)冷凍貯存過(guò)程中的啤酒加入濃度為0.08mg/100mL的木瓜蛋白酶時(shí)澄清效果最佳，能提高游離氨基酸含量，可使渾濁度降低68.75%，游離氨基酸蘇氨酸

14、、纈氨酸和精氨酸分別增加了8.2倍、0.2倍和1.1倍。3、作為餅干松化劑：在餅干、糕點(diǎn)中使用木瓜蛋白酶可以通過(guò)破壞巰基，降低面團(tuán)筋度、提高餅干疏松度，使其成型性好，餅色油潤(rùn)，減少次品率、提高成品率；此外還可減少油脂和糖的用量。適用于各種風(fēng)味的高、中、低檔餅干、糕點(diǎn)及面包的制造。4、用于調(diào)味品生產(chǎn)：啤酒酵母菌是啤酒工業(yè)的一個(gè)附產(chǎn)物，通過(guò)木瓜蛋白酶分解而提取香味濃郁的酵母抽提物，經(jīng)調(diào)味后可制得酵母調(diào)味醬，它作為一種優(yōu)良的調(diào)味品提高了酵母菌的價(jià)值和利用率。5、用于營(yíng)養(yǎng)保健品工業(yè)：木瓜蛋白酶用于保健食品主要有兩種途徑：一種途徑是輔助消化，可做成腸溶片，口服以達(dá)到消除消化紊亂的目的；另一種途徑是將一些

15、含有特殊蛋白源的動(dòng)植物分解制成各種營(yíng)養(yǎng)保健液。方富永等采用木瓜蛋白酶酶解巴非蛤貝肉，結(jié)果表明酶解液中游離氨基酸含量豐富，約為923.0mg/100ml（色氨酸未計(jì)），其中必需氨基酸占33.0%。巴非蛤貝肉經(jīng)復(fù)合蛋白酶水解，適當(dāng)調(diào)配可制作營(yíng)養(yǎng)豐富、海鮮風(fēng)味濃郁、具有一定保健功能的口服液。3.6用于寵物食品生產(chǎn)用木瓜蛋白酶對(duì)寵物食品進(jìn)行處理，可以減少寵物食品的黏稠性，改善口感，增加風(fēng)味。由于木瓜蛋白酶還具有驅(qū)蟲(chóng)效果，也可以用番木瓜汁來(lái)驅(qū)除哺乳動(dòng)物宿主腸道內(nèi)的線蟲(chóng)。另外，木瓜蛋白酶還可以應(yīng)用到化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域。如洗衣粉等洗滌劑中加入木瓜蛋白酶能快速地清洗衣物中的血漬和汗?jié)n。此外，木瓜蛋白酶還可以促進(jìn)

16、中藥成分的有效煎出，用于輔助Rh血型的鑒定，還可用于腫瘤的輔助治療等。目前，木瓜蛋白酶被廣泛地應(yīng)用于食品行業(yè)，如肉類(lèi)、啤酒、調(diào)味品等的生產(chǎn)。隨著我國(guó)人民生活水平的提高，人們對(duì)食品安全和食品營(yíng)養(yǎng)的問(wèn)題越來(lái)越關(guān)注，而木瓜蛋白酶可用來(lái)生產(chǎn)安全、營(yíng)養(yǎng)的食品，如具有保健功能的口服液等，具有良好的市場(chǎng)前景。同時(shí)，為了滿(mǎn)足各行各業(yè)對(duì)木瓜蛋白酶的需求，尤其是食品與醫(yī)藥行業(yè)，研究如何分離純化得到成本低、純度高的木瓜蛋白酶就很有意義。因此，對(duì)木瓜蛋白酶的提取和分離純化技術(shù)進(jìn)行深入的研究，提取高質(zhì)量的木瓜蛋白酶具有重要的實(shí)用價(jià)值。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容： 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、 熟悉木瓜蛋白酶的粗提方法和原理。2、 掌握鹽析和雙水相

17、萃取法的原理和步驟。3、 掌握酶活力測(cè)定的方法，并評(píng)定木瓜蛋白酶的活性。4、 學(xué)會(huì)分析總結(jié)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素。 二、實(shí)驗(yàn)原理根據(jù)木瓜蛋白酶的分子量及特性，通過(guò)離心烘干等技術(shù)獲得木瓜蛋白酶的粗產(chǎn)物。再根據(jù)粗產(chǎn)物在雙水相中分配系數(shù)的差異進(jìn)行進(jìn)一步的提純。最后在紫外分光光度計(jì)中測(cè)取酶的吸光度，通過(guò)OD值換算酶的活性。四、 技術(shù)線路：木瓜乳汁粗提 有機(jī)試劑提取乙醇提取超聲波提取標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)蛋白含量SDS-page標(biāo)準(zhǔn)曲線法雙水相法鹽析法雙水相法鹽析法雙水相法鹽析法雙水相法鹽析法提純雙水相法鹽析法SDS-PAGE標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)酶活實(shí)驗(yàn)一：木瓜蛋白酶的粗提：1、有機(jī)溶劑提取法：1)實(shí)驗(yàn)原理：根據(jù)木瓜蛋白酶在不

18、同相的分配系數(shù)不同。2）實(shí)驗(yàn)步驟：稱(chēng)取700g木瓜乳汁,加入350m l水,拌勻,用40%NH4OH調(diào)pH至9. 0,攪拌1h, 抽濾,濾液加入冷無(wú)水乙醇,使乙醇濃度為60%,攪拌均勻,置低溫冰箱30m in, 2500r/m in離心15 m in,取沉淀,干燥。 2、超聲波提取法：1)實(shí)驗(yàn)原理：木瓜蛋白酶是由植物細(xì)胞合成的具有催化活性和高度專(zhuān)一性的特殊蛋白質(zhì).超聲波提取法作為一種新型的提取技術(shù)已經(jīng)比較廣泛地運(yùn)用于天然植物有效成分的提取.在研究超聲波提取木瓜蛋白酶的工藝中,發(fā)現(xiàn)超聲波可以有效提高酶的提取率.超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng),一方面賦予溶劑對(duì)細(xì)胞壁更大的滲透力,并強(qiáng)化細(xì)胞內(nèi)外的質(zhì)量傳輸,另

19、一方面破壞細(xì)胞壁,使細(xì)胞內(nèi)含物更易釋放,從而強(qiáng)化了提取過(guò)程.超聲波形成的微射流效應(yīng)也是提高提取率的一個(gè)重要原因。2）實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：試驗(yàn)材料：番木瓜;酪蛋白;L -酪氨酸;CCl3 COOH、Na2CO3、Na2HPO4 12H2O、NaH2PO4 2H2O、NaAC、HAC、NaOH、HCl、NaCl、CuSO4、EDTA、Cys、Vc.儀器設(shè)備：721型分光光度計(jì);UV -2000型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì);JY92 -超聲波細(xì)胞粉碎機(jī);PHS -3C型精密pH計(jì);TDL-5型低速臺(tái)式大容量離心機(jī);梅特勒-托利多PL202 -S電子天平;HH -6數(shù)顯恒溫水浴鍋;Tianfeng-Tp10 -20實(shí)驗(yàn)

20、型超濾裝置。操作步驟：酶液制備:選擇新鮮的番木瓜,清洗去皮、籽、瓤后,切塊破碎,稱(chēng)取果肉,加入一定量的4蒸餾水進(jìn)行打漿;果漿在一定條件下進(jìn)行超聲波處理,4000 r min-1離心15min;除雜過(guò)濾后,上清液選用截留分子質(zhì)量為20000 u的PP中空纖維膜進(jìn)行超濾濃縮,收集酶液樣品,冰箱保存?zhèn)溆?為保持樣品的活性,超聲波處理前先預(yù)冷至0 -4 ,超聲波處理時(shí)采用冰浴冷卻,整個(gè)過(guò)程中料液的溫度盡量控制在低溫狀態(tài).重復(fù)3次.佳提取工藝條件為超聲波功率300W,超聲處理時(shí)間200 s,果漿質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%;經(jīng)超聲波強(qiáng)化提取,酶活力提高到原先的1.71倍;在以酪蛋白為底物、pH 7.5和40條件下,木

21、瓜蛋白酶的Km值和Vm值分別為1.4709 mg mL-1和5.5252g mL-1 min-1;最適溫度為70 -80 ,最適pH值為5.4 -6.6;該酶在40以下,pH為5.4 -6.0時(shí)酶活力相對(duì)穩(wěn)定;EDTA、Cys和Vc對(duì)酶活力具有激活作用,CuSO4和ZnCl2具有抑制作用,而KCl、NaCl、CaCl2、MgSO4對(duì)酶活力的影響不大。3、乙醇提取法：新鮮青番木瓜取皮切碎加30%冰水搗碎過(guò)慮取濾液離心15min（3500r/min，4）取上清棄沉淀加入酶活保護(hù)劑（L-cys和EDTA添加量分別為0.04mol/L和0.004mol/L）加入乙醇量45%調(diào)Ph為7.0靜置過(guò)夜離心2

22、0min(5500r/min)取沉淀測(cè)酶活真空冷凍干燥粉碎得粗酶。實(shí)驗(yàn)二：蛋白濃度測(cè)定（Bradford法）：1、實(shí)驗(yàn)原理：蛋白與染料結(jié)合顯色的原理設(shè)計(jì)的?？捡R斯亮藍(lán)G-250染料在一定濃度的酸性乙醇溶液中顯淡紅色,當(dāng)與蛋白質(zhì)結(jié)合后,產(chǎn)生的藍(lán)色溶液在595nm處有最大光吸收,吸光度值與蛋白濃度成正比,因此可通過(guò)檢測(cè)595nm的光吸收值的大小來(lái)計(jì)算蛋白的含量。2、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：1）試劑配置：（1）Bradford貯存液：稱(chēng)取350mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于100ml 95%乙醇,加入200ml磷酸,置于暗處,室溫下可長(zhǎng)期保存;（2）、Bradford工作液：在425ml雙蒸水中加入15ml 95%

23、乙醇,30ml 85% 磷酸和30 ml Bradford貯存液。混勻后用Whatman 1號(hào)濾紙過(guò)濾,棕色瓶保存,可使用數(shù)周,但在使用前需要再過(guò)濾。標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白（BSA）配制成濃度為200ug/ml的溶液。2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定：（1）、在若干潔凈試管中分別加入200ug/ml的標(biāo)準(zhǔn)品0ul、10ul, 20ul, 30ul, 40ul, 50ul 和75ul,用雙蒸水補(bǔ)足至200ul；（2）、各管中加入2ml工作液,振蕩混勻,室溫放置5min,在595nm處測(cè)定吸光值；（3）、每個(gè)樣本做三個(gè)平行。以每管中BSA的ug數(shù)為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3）樣品蛋白含量測(cè)定：（1）、將

24、待測(cè)樣品稀釋n和m倍,配制成濃度約為0.0250.075mg/ml的溶液；（2）、取稀釋過(guò)的樣品200ul加入試管中,加入2ml工作液,振蕩均勻,室溫放置5min,在595nm處測(cè)定吸光值；（3）、每個(gè)樣本做三個(gè)平行。將測(cè)得的吸光值扣去空白后,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的蛋白質(zhì)量,再按照各自的稀釋倍數(shù)推算出蛋白濃度,取平均值后即為樣品的蛋白濃度。實(shí)驗(yàn)三：木瓜蛋白酶的提純1、鹽析法：實(shí)驗(yàn)原理：鹽析法是指在藥物溶液中加入大量的無(wú)機(jī)鹽，使某些高分子物質(zhì)的溶解度降低沉淀析出，而與其他成分分離的方法。鹽析法主要用于蛋白質(zhì)的分離純化。常作鹽析的無(wú)機(jī)鹽有氯化鈉、硫酸鈉、硫酸鎂、硫酸銨等。 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：1） 初步采集

25、處理在未成熟的新鮮木瓜上縱向切口約510個(gè),切口約12 mm,收集乳汁,按11量加入蒸餾水,攪拌1 h,NaOH調(diào)節(jié)至pH9.0,抽濾,濾液備用。2） 硫酸銨分級(jí)沉淀上述濾液中緩緩加入硫酸銨粉末至終濃度為20%,4老化30 min,8 000r/min離心5 min,棄沉淀。上清繼續(xù)加硫酸銨粉末至終濃度為40%,收集沉淀,4老化30 min,8 000r/min離心5 min,收集沉淀,4用50 mmol/L,pH4.0的醋酸緩沖液透析除鹽。3） SP-sephadex C 50柱色譜上述透析產(chǎn)物在室溫條件下上SP-sephadex C50柱(1.1 cm×20cm)進(jìn)行梯度洗脫,洗

26、脫液是含01.5 mol/L NaCl的醋酸緩沖液(50 mmol/L,pH 4.0),流速為0.5 mL/min。分部收集,檢測(cè)酶活力并收集有酶活力的洗脫液,4用pH6.8、0.001 mol/L磷酸鹽緩沖液(BPS)透析。4） 羥基磷灰石柱色譜上述透析產(chǎn)物室溫條件下上羥基磷灰石柱(1.1 cm×20 cm)梯度洗脫,洗脫液是0.0010.05 mol/L BPS(pH 6.8),流速為0.5 mL/min。分部收集,檢測(cè)酶活力并收集有酶活的洗脫液,超濾除鹽濃縮,即得純酶。2、雙水相萃取法提純實(shí)驗(yàn)原理： 兩種親水性高聚物或一種高聚物與鹽類(lèi)在水中能形成兩層互不相溶的勻相水溶液,即雙水

27、相體系。早在年,發(fā)現(xiàn),當(dāng)明膠與瓊脂或明膠與可溶性淀粉溶液相混時(shí),會(huì)得到一個(gè)渾濁不透明的溶液,隨之分為兩相。上相富含明膠,下相富含瓊脂或淀粉,且兩相的主要成分都是水。這種現(xiàn)象被稱(chēng)為聚合物的不相溶性,由此產(chǎn)生了雙水相萃取技術(shù)。雙水相萃取與水一有機(jī)相萃取的原理相似,都是基于被分離物質(zhì)在兩相間的選擇性分配。當(dāng)物質(zhì)進(jìn)入雙水相體系后,由于表面性質(zhì)、電荷作用和各種力如疏水鍵、氫鍵和離子鍵等的存在和環(huán)境的影響,使其在上下相中的濃度不同。物質(zhì)在雙水相體系中的分配系數(shù)不是一個(gè)確定的值,它要受許多因素的影響。影響蛋白質(zhì)及細(xì)胞碎片在雙水相體系中分配行為的主要參數(shù)有成相聚合物的種類(lèi)、成相聚合物的分子質(zhì)量和總濃度、無(wú)機(jī)鹽

28、的種類(lèi)和濃度、值、離子環(huán)境等。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：1)試劑：PEG 4000和6000，L-半膚氨酸，二硫蘇糖醇DTT，磷酸二氫鈉和磷酸氫二鉀，30%丙烯酞胺儲(chǔ)液，過(guò)硫酸銨，TEMED，Tris，透析袋（分子截留量3500），填料Sepharose SP Fast Flow，考馬斯亮藍(lán)G-250和考馬斯亮藍(lán)R-250，牛血清白蛋白，N-苯甲酞-DL-精氨酸對(duì)硝基苯胺鹽酸鹽2）儀器：溫控?fù)u床，恒溫混勻儀，電熱恒溫水槽，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，實(shí)驗(yàn)室Ph計(jì)，分析天平，電子天平，高速冷凍離心機(jī)，蛋白電泳系統(tǒng)，恒溫磁力攪拌器，真空冷凍干燥機(jī)，預(yù)裝柱HiTrap SP-FF(1ML)，快速蛋白純化系統(tǒng)3）實(shí)驗(yàn)方法：（

29、1）、粗酶溶液配制：稱(chēng)取45g噴霧干燥的木瓜粗酶粉,在4下溶于半膚氨酸溶液（20Mm Cys，1Mm EDTA, PH 5.7）中。待樣品充分溶解后,將溶液離心(20,000g,4，15minj)，收集上清。將該上清（大約45mg/ml）稀釋成不同的蛋白濃度,作為初始粗酶溶液待用。（2）、雙水相體系配制：按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)稱(chēng)取相應(yīng)量的PEG（4000或6000）,鹽溶液（40%w/w磷酸鹽或40%w/w硫酸銨）和4g酶溶夜，置于15ml刻度離心管中,補(bǔ)加去離子水至總體系質(zhì)量為10g。其中,不同ph值的磷酸鹽溶液由40%（w/w）K2HPO4和40%（w/w）NaH2PO4配制而得。不同PH值的酶溶液由

30、6M HCL 或NaOH調(diào)整而得。將配制好的雙水相體系放入4或20搖床中充分混合2h。將混合均勻的離心管在各自溫度下離心(10,000g，15min), ,以使兩相充分分離。讀取上、下相體積。用注射器分別吸取一定量的上、下相,進(jìn)行蛋白濃度和酶活測(cè)定。同時(shí),將樣品進(jìn)行堿性蛋白非變性電泳和快速蛋白液相色譜（FPLC）檢測(cè),以驗(yàn)證雙水相體系對(duì)木瓜蛋白酶的提純效果.(3)、上相中木瓜蛋白酶與成相聚合物PEG的分離：經(jīng)雙水相體系分離后,木瓜蛋白酶被萃取到富含PEG的上相,因此要將木瓜蛋白酶同成相聚合物PEG分離。本實(shí)驗(yàn)采用離子交換法將木瓜蛋白酶同PEG分開(kāi)。離子交換填料采用Sepharose SP Fast F