熱原檢測及其消除方式討論

1、熱原檢測方法及其消除方式討論目錄熱原及其本質3定義3本質3二、熱原發(fā)熱的機理4三、熱原的檢測方法41.家兔法42.細菌內毒素檢測法53.單核細胞激活實驗法（檢測疫苗類生物制品）64.白細胞系法7（1）THP一1細胞法7（2）MonoaM一6細胞法7（3）28SC細胞法75.體外人全血法7四、熱原消除方式81.蒸餾法去除熱原82.離子交換法除去熱原83. 酸堿處理法除熱原84高溫法85.活性炭吸附法96.超濾法9五、結論9熱原檢測方法及其消除方式討論摘 要 本文較深入探討了熱原的本質及其作用機理，由此對多種檢測方法和消除方式進行分析。其中，檢測方法有家兔法、細菌內毒素檢測法、單核細胞激活實驗法、

2、白細胞系法和體外人全血法；消除方式包括蒸餾法 、高溫法 、活性炭吸附法 和超濾法。新老方法并存，每一項檢測方法和消除方式都有其自身的優(yōu)勢和缺陷。隨著科技的發(fā)展，未來熱原的種類和作用機理將被研究清楚，而對應的檢測方法和消除方式也將得到更新和升級。關鍵詞 熱原；檢測 ；消除 100多年前,即研發(fā)了注射劑之后，非腸道醫(yī)用制品中的熱原對人體的危害即熱原反應已經人所共知;臨床上主要表現(xiàn)為如下癥狀有:發(fā)熱,寒顫,惡心,嘔吐,頭痛等癥狀。并且，熱原能夠導致機體發(fā)熱、腰及關節(jié)痛、膚色灰白、白細胞下降、血管通透性增強，嚴重者造成昏迷甚至休克、死亡。為此，凡非腸道使用制品包括藥品、生

3、物制品(包括基因工程產品和基因治療相關產品)和醫(yī)療器械裝置(體內使用者)都應進行熱原檢查。參考文獻 譚德講.熱原和熱原檢測方法的研究進展J.藥物分析雜志，2004,24(6)：653-658.總之，為了達到藥品的安全效果，對于藥品的熱原檢測和消除是及其重要和必要。熱原及其本質定義熱原(pyrogen)系指由微生物產生的能引起恒溫動物異常升高的致熱性物質。目前,對于熱原國內外仍未有完全統(tǒng)一的認識,但從國內外文獻報道中普遍認為:它是指細菌內毒素的脂多糖。歐洲藥典委員會副主席JVanNoordwijk提出:“嚴格地講,不是每一種熱原都具有脂多糖的結構,但所有已知的細菌內毒素脂多糖都有熱原活性”。在藥

4、品生產質量管理規(guī)范(GMP)條件下，藥品生產的質量控制一般可以接受的觀點是:不存在細菌內毒素意味著不存在熱原。 鄭茂恩.熱原檢測方法介紹J.中國獸藥雜志，2011,45(5)：51-53.本質人體發(fā)熱的物質有內源性和外源性兩大類。熱原檢測主要是對外源性的熱原進行總量控制,使其對機體不產生危害的影響。研究較多、較深人的外源性熱原物質主要有2類:即革蘭氏陰性菌的內毒素和革蘭氏陽性菌的脂磷壁酸。這也是產品中常見的熱原物質。內毒素主要是革蘭氏陰性菌細胞壁外表層結構成分,即多糖、脂質和蛋白組成的復合體。其發(fā)熱部位主要是脂多糖中由脂化的葡萄糖胺二糖為單位,通過焦磷酸醋鍵組成的一種獨特的糖脂化合物，即脂質A

5、。革蘭氏陽性菌內致熱物質在最近幾年才有了深人的認識。由于一段時間內,人們雖然發(fā)現(xiàn)革蘭氏陽性菌造成發(fā)熱,但在提取后,其致熱性減弱或消失閣,故一直無法確定主要是何種物質引起的發(fā)熱。2001年,經過改進提取方法困和隨后的結構拆分測定,終于確認革蘭氏陽性菌中與革蘭氏陰性菌內毒素相對應的發(fā)熱物質是脂磷壁酸。不同革蘭氏陽性菌中的脂磷壁酸結構不同,其致熱活性也有很大差異圖;這與不同陰性菌的內毒素致熱活性不同相類似。Dieninger等人根據(jù)金葡菌的UrA結構構建了D一Ala-IJA分子結構,其分子有6個磷酸聚甘油單位組成的骨架和龍膽二糖與酞基碳鏈組成的附著臂組成,相對分子質量為2248.90。該結構中的龍膽

6、二糖(核心)對LTA的活性影響不大;磷酸聚甘油骨架只有在D一丙氨酸存在時,可以加強脂附著端的作用;N一乙酞氨基葡萄糖基團可以忽略其作用;用L一丙氨酸取代D一丙氨酸可使其活性降低至少10倍,說明有立體異構選擇性。LTA的附著臂結構也對LTA的致熱性有影響,具有2個酞基的LTA比僅有一個酞基的LTA的致熱性強。此外,隨著基因工程產品和基因治療相關產品的增多,人們也開始關注病毒類物質的致熱作用,并且證明多聚核昔酸類物質確有致熱活性圖,但因檢測方法的限制等原因,至今研究還未透徹。 二、熱原發(fā)熱的機理其實，幾乎所有的外源性發(fā)熱物質均通過刺激免疫細胞分泌細胞因子而最終導致機體發(fā)熱。首先是外源性熱原進人機體

7、后刺激免疫細胞產生內源性熱原如IL一6,NTaF、IL一1等細胞因子,這些因子通過終板血管器們直接或間接進人下丘腦視前區(qū)等中樞系統(tǒng)后,一方面通過升溫介質和神經整合作用使體溫上升(正調節(jié)),另一方面又通過內源性解熱物質作用于腹中隔(vSA)和中杏仁核(MAN)等體溫負調節(jié)中樞限制體溫升高(負調節(jié)),這兩方面相互作用的結果決定了調定點上移(或下移)的水平、發(fā)熱幅度和時程,傳統(tǒng)上把體溫調節(jié)中樞僅局限于下丘腦視前區(qū)(PO/AH)的觀點應予以修正閉。在這些因子中,IL一6和中樞內的PG一2E被認為是介導發(fā)熱的下游和終端介質。至于一些細胞因子最終是否能通過血腦屏障直接作用于體溫調節(jié)中樞,還沒有確切定論。圖

8、2顯示了熱原物質致發(fā)熱的機理和臨床表現(xiàn)癥狀。三、熱原的檢測方法1.家兔法注射制品誕生后不久,人們就發(fā)現(xiàn)熱原反應現(xiàn)象,并開始探討、研究其檢測控制的方法。第二次世界大戰(zhàn)中,因靜脈注射輸液需求量增大,客觀上要求藥典規(guī)定熱原試驗,以保證其安全性。經過FDA、NIH和14個藥廠協(xié)作研究,在1942年USP12版開始收載了家兔法。其基本概念是每千克體重的家兔靜脈注射10mL,在10而n之內,家兔不應有發(fā)熱反應,亦相當于人的致熱最低閉值。當時的USP規(guī)定:3只家兔有1只體溫升高)0.6或3只總和>1.4,則重復取5只家兔試驗,8只家兔中體溫升高0.6以上的家兔不多于3只,8只兔升溫總和不超過3,7,認

9、為合格。1900年美國藥典委員會、美國FDA生物評價進行了一次協(xié)作研究和評價,并進而對家兔熱原法提出如下修訂建議:(l)在注射藥品后1一3h之間,每隔30min記錄一次體溫,以便能記錄到最高升溫點。(2)家兔體重不影響內毒素劑量對體溫的反應,故建議繼續(xù)按家兔每千克體重給藥計算給藥劑量(在此之前,美國藥典論壇曾提出,按人體每千克體重計算給藥劑量)。(3)應重新評價家兔接受了熱原制品后休息14d重復使用的規(guī)定,應增加休息時間或不允許重復使用。(4)根據(jù)人體的致熱閩值5.0Eu·kg將體溫升高由0.6降至0.5。1993年UsP22版第八增補本和以后各版本均根據(jù)這一協(xié)作研究的結論,對該方法

10、進行了較大的修訂,如將家兔最高升溫0.6的限度降為0.5;復試后的8只家兔升溫總和不得超過3.5降為不得超過3.3度等。其后對該檢測方法及判定標準幾乎沒有大的變動。因此，直到現(xiàn)在家兔熱原檢查法各國藥典用于控制藥品熱原含量的方法，被稱為“黃金法則”。這是由于，家兔發(fā)熱機制可能與人體發(fā)熱機制相似: 即外致熱原( 如細菌、病毒、真菌等) 進入人體后能刺激免疫細胞分泌內致熱原( 主要為細胞因子: 如 IL 1 蓮、IL 6 TNF )，這些炎性因子可對人體體溫調定點產生直接或間接的作用，引起體溫升高。但家兔法存在固有的缺陷。其中最大的缺陷是家兔法不能定量，結果重復性差，費用高及使用活體動物進行體內實驗

11、而產生的倫理道德問題等 高華.兔全血法檢測熱原的可行性探討J.藥物分析雜志，2011,31(8)：1552-1555.。2.細菌內毒素檢測法由于家兔法仍具有檢測時間長、影響因素對、成本高等局限性,所以一直以來,人們都在尋找檢測熱原的更為簡便有效的方法。1956年Bang發(fā)現(xiàn)細菌懸液與賞血細胞溶解產物會產生凝集。1968年,uven和Bang以此為原理,建立起盆試驗法,即后來人們所稱的內毒素檢查法。該法當時可檢測到血漿內的0.5gn/mL內毒素濃度,其靈敏度明顯高于家兔法,對于檢測大輸液中的內毒素非常重要。1977年FDA制備賞試劑參考品,正式開展LAL試驗。到1980年,USP20版正式收載該

12、方法。BET法是以節(jié)肢動物賞的血細胞溶解物與微量細菌內毒素產生凝集反應為基礎的。該法快速、簡便、可定量、可標準化、費用較低、易于推廣普及,對內毒素的檢測比家兔法靈敏10一100倍。在最近的25年中被許多國家的藥典收載并應用,在美國已經取代了大約50%的家兔試驗。但它的缺點在應用中也逐步顯露出來,主要是(1)該方法所用機理不能完全反映哺乳動物對熱原的反應,研究發(fā)現(xiàn),來自不同細菌的內毒素對哺乳動物致熱活性差別很大,從沒有致熱性到很強致熱性,這種差異與其凝集活性的差異沒有相關性,故BET法實際能夠檢測到的僅僅是內毒素對堂血細胞的凝集活性,而不是內毒素對人體的發(fā)熱活性或化學概念上的含量。(2)該方法對

13、一些酶抑制劑、鈣鎂離子鰲合劑和內毒素以外的熱原物質很難進行檢測。(3)現(xiàn)代研究也發(fā)現(xiàn),某些制品,尤其是生物制品和抗生素，與內毒素之間還存在協(xié)同作用，而這種協(xié)同作用是內毒素法無法檢測到的。但隨著國際間的協(xié)作、協(xié)調研究的進行,現(xiàn)在細菌內毒素測試法已經基本協(xié)調統(tǒng)一了。并且因內毒素在自然界普遍存在,在注射液中比其他熱原物質往往更容易存在,毒性更大而且穩(wěn)定,所以該檢測方法至今被廣泛使用。因此，細菌內毒素法則只能特異性地檢測出革蘭氏陰性菌來源的細菌內毒素，不適用于檢測其他種類( 如革蘭氏陽性菌、真菌來源) 的熱原物質; 對成分復雜的品種( 如蛋白、疫苗、中藥注射液等) 應用范圍有限; 鱟資源的日趨貧乏。3

14、.單核細胞激活實驗法（檢測疫苗類生物制品）目前，英國藥典、歐洲藥典均已收錄了單核細胞激活實驗，用于熱原檢測。其中對熱原敏感的HL-60 單核細胞進行激活實驗，可以實現(xiàn) HL-60 單核細胞激活實驗與中國藥典收載的內毒素檢測方法測定結果一致。該方法適用于流感疫苗、凍干甲型肝炎減毒活疫苗、凍干人用狂犬病疫苗、麻腮風聯(lián)合減毒活疫苗、麻疹腮腺炎聯(lián)合減毒活疫苗、雙價腎綜合征出血熱滅活疫苗和 A 群 C 群腦膜炎球菌多糖疫苗這 7 類疫苗熱原的檢測。該方法作為家兔法和細菌內毒素法兩種經典熱原檢測方法的補充方法，不僅檢測熱原的種類多，而且該方法靈敏度高，可以對熱原進行定量檢測。但該方法仍存在檢測成本較高，對

15、細胞的要求較高等不足之處。 董閃閃.單核細胞激活實驗在疫苗類生物制品熱原檢測中的應用研究J.中國藥師，2016,19(10)：870-873.4.白細胞系法（1）THP一1細胞法THP一l細胞是一種人源單核細胞系,來源于急性白血病病人的外周血中。用該細胞檢測熱原物質具有靈敏度高、可定量、能檢測出的熱原種類多、應用范圍比較廣、不涉及使用實驗動物的優(yōu)點。（2）MonoaM一6細胞法Mon0MaC一6(簡寫為MM6)細胞與其他單核細胞相比是一種更加成熟的細胞，并且是唯一能表達功能和表型特征的成熟單核細胞,來源于單核細胞性自血病病人的外周血中。研究發(fā)現(xiàn)MM6細胞也可用于熱原檢測,該方法具有靈敏度高、可

16、用于檢測的熱原種類多、應用范圍廣、可定量、方法穩(wěn)定性高的優(yōu)點。從已有研究結果來看,它比THP一1細胞法有更好的可靠性。MonoaM一6細胞法作為熱原檢測替代方法,該方法已得到國際上的論證和推薦。（3）28SC細胞法28SC細胞為人源單核細胞系,該細胞用于熱原檢測的特點為靈敏度高,能檢測出的熱原種類多,最重要的是它也能比較好地模擬人體對熱原的反應。5.體外人全血法 賀慶.新的熱原檢測方法細胞法介紹J.藥物分析雜志，2008,28(3)：494-497.體外人全血法熱原檢測方法是近年來國內外正在研究的一種熱原檢測新方法，具有檢測范圍廣泛，靈敏度高，不同個體學業(yè)的結果差異小等優(yōu)點。以體外人全血熱原檢

17、測方法能檢測出細菌內毒素和非內毒素兩大類致熱物質。家兔法存在不易標準化、不易定量、重復性和靈敏度差、受某些藥品本身的藥理活性及理化性質的影響較大等缺點。鱟實驗法只能檢測出細菌內毒素,對某些產品進行檢查時會得出假陰性結果,此外鱟資源也非常有限。因此研究新的熱原檢測方法是一種趨勢。同時研究替代家兔法和盆實驗法的體外方法符合國際上提倡的“3R”(減少、優(yōu)化、替代)原則。該項研究工作在國內僅是一個開端,還有很多工作需要進一步深人研究。人全血法能檢測出來源于革蘭陽性菌如金黃色葡萄球菌的脂磷壁酸而鱟實驗卻不能。相信在不久的將來,該方法有可能作為法定的檢測方法用于藥品、生物制品和醫(yī)療器械的熱原檢查之中。四、

18、熱原消除方式1.蒸餾法去除熱原熱原雖能溶于水中不揮發(fā)，但有些可隨水蒸氣的霧滴進入注射用水中，因此制備注射用水時，原水中的熱原可經蒸餾除去，但需多次蒸餾，并加有隔膜裝置，單次蒸餾往往效果不理想。2.離子交換法除去熱原溶液中的熱原也可以被離子交換樹脂所吸附。用離子交換樹脂吸附可除去水中的熱原，并用于大生產。離子交換樹脂除去熱原的原理，是因為熱原物質大分子上有磷酸根與羧酸根，帶有負電荷，故易被強堿性陰離子交換樹脂所交換吸附。3. 酸堿處理法除熱原熱原可被強酸或強堿所破壞，所以中藥注射劑生產所用容器具可用酸液或堿液處理，如以重鉻酸鉀硫酸清潔液浸泡或稀氫氧化鈉處理，破壞熱原。4高溫法熱原的耐熱性能良好，6