熱原檢測及其消除方式討論

1、熱原檢測方法及其消除方式討論目錄熱原及其本質(zhì)3定義3本質(zhì)3二、熱原發(fā)熱的機(jī)理4三、熱原的檢測方法41.家兔法42.細(xì)菌內(nèi)毒素檢測法53.單核細(xì)胞激活實(shí)驗(yàn)法（檢測疫苗類生物制品）64.白細(xì)胞系法7（1）THP一1細(xì)胞法7（2）MonoaM一6細(xì)胞法7（3）28SC細(xì)胞法75.體外人全血法7四、熱原消除方式81.蒸餾法去除熱原82.離子交換法除去熱原83. 酸堿處理法除熱原84高溫法85.活性炭吸附法96.超濾法9五、結(jié)論9熱原檢測方法及其消除方式討論摘 要 本文較深入探討了熱原的本質(zhì)及其作用機(jī)理，由此對多種檢測方法和消除方式進(jìn)行分析。其中，檢測方法有家兔法、細(xì)菌內(nèi)毒素檢測法、單核細(xì)胞激活實(shí)驗(yàn)法、

2、白細(xì)胞系法和體外人全血法；消除方式包括蒸餾法 、高溫法 、活性炭吸附法 和超濾法。新老方法并存，每一項(xiàng)檢測方法和消除方式都有其自身的優(yōu)勢和缺陷。隨著科技的發(fā)展，未來熱原的種類和作用機(jī)理將被研究清楚，而對應(yīng)的檢測方法和消除方式也將得到更新和升級。關(guān)鍵詞 熱原；檢測 ；消除 100多年前,即研發(fā)了注射劑之后，非腸道醫(yī)用制品中的熱原對人體的危害即熱原反應(yīng)已經(jīng)人所共知;臨床上主要表現(xiàn)為如下癥狀有:發(fā)熱,寒顫,惡心,嘔吐,頭痛等癥狀。并且，熱原能夠?qū)е聶C(jī)體發(fā)熱、腰及關(guān)節(jié)痛、膚色灰白、白細(xì)胞下降、血管通透性增強(qiáng)，嚴(yán)重者造成昏迷甚至休克、死亡。為此，凡非腸道使用制品包括藥品、生

3、物制品(包括基因工程產(chǎn)品和基因治療相關(guān)產(chǎn)品)和醫(yī)療器械裝置(體內(nèi)使用者)都應(yīng)進(jìn)行熱原檢查。參考文獻(xiàn) 譚德講.熱原和熱原檢測方法的研究進(jìn)展J.藥物分析雜志，2004,24(6)：653-658.總之，為了達(dá)到藥品的安全效果，對于藥品的熱原檢測和消除是及其重要和必要。熱原及其本質(zhì)定義熱原(pyrogen)系指由微生物產(chǎn)生的能引起恒溫動物異常升高的致熱性物質(zhì)。目前,對于熱原國內(nèi)外仍未有完全統(tǒng)一的認(rèn)識,但從國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道中普遍認(rèn)為:它是指細(xì)菌內(nèi)毒素的脂多糖。歐洲藥典委員會副主席JVanNoordwijk提出:“嚴(yán)格地講,不是每一種熱原都具有脂多糖的結(jié)構(gòu),但所有已知的細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖都有熱原活性”。在藥

4、品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(GMP)條件下，藥品生產(chǎn)的質(zhì)量控制一般可以接受的觀點(diǎn)是:不存在細(xì)菌內(nèi)毒素意味著不存在熱原。 鄭茂恩.熱原檢測方法介紹J.中國獸藥雜志，2011,45(5)：51-53.本質(zhì)人體發(fā)熱的物質(zhì)有內(nèi)源性和外源性兩大類。熱原檢測主要是對外源性的熱原進(jìn)行總量控制,使其對機(jī)體不產(chǎn)生危害的影響。研究較多、較深人的外源性熱原物質(zhì)主要有2類:即革蘭氏陰性菌的內(nèi)毒素和革蘭氏陽性菌的脂磷壁酸。這也是產(chǎn)品中常見的熱原物質(zhì)。內(nèi)毒素主要是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外表層結(jié)構(gòu)成分,即多糖、脂質(zhì)和蛋白組成的復(fù)合體。其發(fā)熱部位主要是脂多糖中由脂化的葡萄糖胺二糖為單位,通過焦磷酸醋鍵組成的一種獨(dú)特的糖脂化合物，即脂質(zhì)A

5、。革蘭氏陽性菌內(nèi)致熱物質(zhì)在最近幾年才有了深人的認(rèn)識。由于一段時間內(nèi),人們雖然發(fā)現(xiàn)革蘭氏陽性菌造成發(fā)熱,但在提取后,其致熱性減弱或消失閣,故一直無法確定主要是何種物質(zhì)引起的發(fā)熱。2001年,經(jīng)過改進(jìn)提取方法困和隨后的結(jié)構(gòu)拆分測定,終于確認(rèn)革蘭氏陽性菌中與革蘭氏陰性菌內(nèi)毒素相對應(yīng)的發(fā)熱物質(zhì)是脂磷壁酸。不同革蘭氏陽性菌中的脂磷壁酸結(jié)構(gòu)不同,其致熱活性也有很大差異圖;這與不同陰性菌的內(nèi)毒素致熱活性不同相類似。Dieninger等人根據(jù)金葡菌的UrA結(jié)構(gòu)構(gòu)建了D一Ala-IJA分子結(jié)構(gòu),其分子有6個磷酸聚甘油單位組成的骨架和龍膽二糖與酞基碳鏈組成的附著臂組成,相對分子質(zhì)量為2248.90。該結(jié)構(gòu)中的龍膽

6、二糖(核心)對LTA的活性影響不大;磷酸聚甘油骨架只有在D一丙氨酸存在時,可以加強(qiáng)脂附著端的作用;N一乙酞氨基葡萄糖基團(tuán)可以忽略其作用;用L一丙氨酸取代D一丙氨酸可使其活性降低至少10倍,說明有立體異構(gòu)選擇性。LTA的附著臂結(jié)構(gòu)也對LTA的致熱性有影響,具有2個酞基的LTA比僅有一個酞基的LTA的致熱性強(qiáng)。此外,隨著基因工程產(chǎn)品和基因治療相關(guān)產(chǎn)品的增多,人們也開始關(guān)注病毒類物質(zhì)的致熱作用,并且證明多聚核昔酸類物質(zhì)確有致熱活性圖,但因檢測方法的限制等原因,至今研究還未透徹。 二、熱原發(fā)熱的機(jī)理其實(shí)，幾乎所有的外源性發(fā)熱物質(zhì)均通過刺激免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子而最終導(dǎo)致機(jī)體發(fā)熱。首先是外源性熱原進(jìn)人機(jī)體

7、后刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性熱原如IL一6,NTaF、IL一1等細(xì)胞因子,這些因子通過終板血管器們直接或間接進(jìn)人下丘腦視前區(qū)等中樞系統(tǒng)后,一方面通過升溫介質(zhì)和神經(jīng)整合作用使體溫上升(正調(diào)節(jié)),另一方面又通過內(nèi)源性解熱物質(zhì)作用于腹中隔(vSA)和中杏仁核(MAN)等體溫負(fù)調(diào)節(jié)中樞限制體溫升高(負(fù)調(diào)節(jié)),這兩方面相互作用的結(jié)果決定了調(diào)定點(diǎn)上移(或下移)的水平、發(fā)熱幅度和時程,傳統(tǒng)上把體溫調(diào)節(jié)中樞僅局限于下丘腦視前區(qū)(PO/AH)的觀點(diǎn)應(yīng)予以修正閉。在這些因子中,IL一6和中樞內(nèi)的PG一2E被認(rèn)為是介導(dǎo)發(fā)熱的下游和終端介質(zhì)。至于一些細(xì)胞因子最終是否能通過血腦屏障直接作用于體溫調(diào)節(jié)中樞,還沒有確切定論。圖

8、2顯示了熱原物質(zhì)致發(fā)熱的機(jī)理和臨床表現(xiàn)癥狀。三、熱原的檢測方法1.家兔法注射制品誕生后不久,人們就發(fā)現(xiàn)熱原反應(yīng)現(xiàn)象,并開始探討、研究其檢測控制的方法。第二次世界大戰(zhàn)中,因靜脈注射輸液需求量增大,客觀上要求藥典規(guī)定熱原試驗(yàn),以保證其安全性。經(jīng)過FDA、NIH和14個藥廠協(xié)作研究,在1942年USP12版開始收載了家兔法。其基本概念是每千克體重的家兔靜脈注射10mL,在10而n之內(nèi),家兔不應(yīng)有發(fā)熱反應(yīng),亦相當(dāng)于人的致熱最低閉值。當(dāng)時的USP規(guī)定:3只家兔有1只體溫升高)0.6或3只總和>1.4,則重復(fù)取5只家兔試驗(yàn),8只家兔中體溫升高0.6以上的家兔不多于3只,8只兔升溫總和不超過3,7,認(rèn)

9、為合格。1900年美國藥典委員會、美國FDA生物評價(jià)進(jìn)行了一次協(xié)作研究和評價(jià),并進(jìn)而對家兔熱原法提出如下修訂建議:(l)在注射藥品后1一3h之間,每隔30min記錄一次體溫,以便能記錄到最高升溫點(diǎn)。(2)家兔體重不影響內(nèi)毒素劑量對體溫的反應(yīng),故建議繼續(xù)按家兔每千克體重給藥計(jì)算給藥劑量(在此之前,美國藥典論壇曾提出,按人體每千克體重計(jì)算給藥劑量)。(3)應(yīng)重新評價(jià)家兔接受了熱原制品后休息14d重復(fù)使用的規(guī)定,應(yīng)增加休息時間或不允許重復(fù)使用。(4)根據(jù)人體的致熱閩值5.0Eu·kg將體溫升高由0.6降至0.5。1993年UsP22版第八增補(bǔ)本和以后各版本均根據(jù)這一協(xié)作研究的結(jié)論,對該方法

10、進(jìn)行了較大的修訂,如將家兔最高升溫0.6的限度降為0.5;復(fù)試后的8只家兔升溫總和不得超過3.5降為不得超過3.3度等。其后對該檢測方法及判定標(biāo)準(zhǔn)幾乎沒有大的變動。因此，直到現(xiàn)在家兔熱原檢查法各國藥典用于控制藥品熱原含量的方法，被稱為“黃金法則”。這是由于，家兔發(fā)熱機(jī)制可能與人體發(fā)熱機(jī)制相似: 即外致熱原( 如細(xì)菌、病毒、真菌等) 進(jìn)入人體后能刺激免疫細(xì)胞分泌內(nèi)致熱原( 主要為細(xì)胞因子: 如 IL 1 蓮、IL 6 TNF )，這些炎性因子可對人體體溫調(diào)定點(diǎn)產(chǎn)生直接或間接的作用，引起體溫升高。但家兔法存在固有的缺陷。其中最大的缺陷是家兔法不能定量，結(jié)果重復(fù)性差，費(fèi)用高及使用活體動物進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

11、而產(chǎn)生的倫理道德問題等 高華.兔全血法檢測熱原的可行性探討J.藥物分析雜志，2011,31(8)：1552-1555.。2.細(xì)菌內(nèi)毒素檢測法由于家兔法仍具有檢測時間長、影響因素對、成本高等局限性,所以一直以來,人們都在尋找檢測熱原的更為簡便有效的方法。1956年Bang發(fā)現(xiàn)細(xì)菌懸液與賞血細(xì)胞溶解產(chǎn)物會產(chǎn)生凝集。1968年,uven和Bang以此為原理,建立起盆試驗(yàn)法,即后來人們所稱的內(nèi)毒素檢查法。該法當(dāng)時可檢測到血漿內(nèi)的0.5gn/mL內(nèi)毒素濃度,其靈敏度明顯高于家兔法,對于檢測大輸液中的內(nèi)毒素非常重要。1977年FDA制備賞試劑參考品,正式開展LAL試驗(yàn)。到1980年,USP20版正式收載該

12、方法。BET法是以節(jié)肢動物賞的血細(xì)胞溶解物與微量細(xì)菌內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)為基礎(chǔ)的。該法快速、簡便、可定量、可標(biāo)準(zhǔn)化、費(fèi)用較低、易于推廣普及,對內(nèi)毒素的檢測比家兔法靈敏10一100倍。在最近的25年中被許多國家的藥典收載并應(yīng)用,在美國已經(jīng)取代了大約50%的家兔試驗(yàn)。但它的缺點(diǎn)在應(yīng)用中也逐步顯露出來,主要是(1)該方法所用機(jī)理不能完全反映哺乳動物對熱原的反應(yīng),研究發(fā)現(xiàn),來自不同細(xì)菌的內(nèi)毒素對哺乳動物致熱活性差別很大,從沒有致熱性到很強(qiáng)致熱性,這種差異與其凝集活性的差異沒有相關(guān)性,故BET法實(shí)際能夠檢測到的僅僅是內(nèi)毒素對堂血細(xì)胞的凝集活性,而不是內(nèi)毒素對人體的發(fā)熱活性或化學(xué)概念上的含量。(2)該方法對

13、一些酶抑制劑、鈣鎂離子鰲合劑和內(nèi)毒素以外的熱原物質(zhì)很難進(jìn)行檢測。(3)現(xiàn)代研究也發(fā)現(xiàn),某些制品,尤其是生物制品和抗生素，與內(nèi)毒素之間還存在協(xié)同作用，而這種協(xié)同作用是內(nèi)毒素法無法檢測到的。但隨著國際間的協(xié)作、協(xié)調(diào)研究的進(jìn)行,現(xiàn)在細(xì)菌內(nèi)毒素測試法已經(jīng)基本協(xié)調(diào)統(tǒng)一了。并且因內(nèi)毒素在自然界普遍存在,在注射液中比其他熱原物質(zhì)往往更容易存在,毒性更大而且穩(wěn)定,所以該檢測方法至今被廣泛使用。因此，細(xì)菌內(nèi)毒素法則只能特異性地檢測出革蘭氏陰性菌來源的細(xì)菌內(nèi)毒素，不適用于檢測其他種類( 如革蘭氏陽性菌、真菌來源) 的熱原物質(zhì); 對成分復(fù)雜的品種( 如蛋白、疫苗、中藥注射液等) 應(yīng)用范圍有限; 鱟資源的日趨貧乏。3

14、.單核細(xì)胞激活實(shí)驗(yàn)法（檢測疫苗類生物制品）目前，英國藥典、歐洲藥典均已收錄了單核細(xì)胞激活實(shí)驗(yàn)，用于熱原檢測。其中對熱原敏感的HL-60 單核細(xì)胞進(jìn)行激活實(shí)驗(yàn)，可以實(shí)現(xiàn) HL-60 單核細(xì)胞激活實(shí)驗(yàn)與中國藥典收載的內(nèi)毒素檢測方法測定結(jié)果一致。該方法適用于流感疫苗、凍干甲型肝炎減毒活疫苗、凍干人用狂犬病疫苗、麻腮風(fēng)聯(lián)合減毒活疫苗、麻疹腮腺炎聯(lián)合減毒活疫苗、雙價(jià)腎綜合征出血熱滅活疫苗和 A 群 C 群腦膜炎球菌多糖疫苗這 7 類疫苗熱原的檢測。該方法作為家兔法和細(xì)菌內(nèi)毒素法兩種經(jīng)典熱原檢測方法的補(bǔ)充方法，不僅檢測熱原的種類多，而且該方法靈敏度高，可以對熱原進(jìn)行定量檢測。但該方法仍存在檢測成本較高，對

15、細(xì)胞的要求較高等不足之處。 董閃閃.單核細(xì)胞激活實(shí)驗(yàn)在疫苗類生物制品熱原檢測中的應(yīng)用研究J.中國藥師，2016,19(10)：870-873.4.白細(xì)胞系法（1）THP一1細(xì)胞法THP一l細(xì)胞是一種人源單核細(xì)胞系,來源于急性白血病病人的外周血中。用該細(xì)胞檢測熱原物質(zhì)具有靈敏度高、可定量、能檢測出的熱原種類多、應(yīng)用范圍比較廣、不涉及使用實(shí)驗(yàn)動物的優(yōu)點(diǎn)。（2）MonoaM一6細(xì)胞法Mon0MaC一6(簡寫為MM6)細(xì)胞與其他單核細(xì)胞相比是一種更加成熟的細(xì)胞，并且是唯一能表達(dá)功能和表型特征的成熟單核細(xì)胞,來源于單核細(xì)胞性自血病病人的外周血中。研究發(fā)現(xiàn)MM6細(xì)胞也可用于熱原檢測,該方法具有靈敏度高、可

16、用于檢測的熱原種類多、應(yīng)用范圍廣、可定量、方法穩(wěn)定性高的優(yōu)點(diǎn)。從已有研究結(jié)果來看,它比THP一1細(xì)胞法有更好的可靠性。MonoaM一6細(xì)胞法作為熱原檢測替代方法,該方法已得到國際上的論證和推薦。（3）28SC細(xì)胞法28SC細(xì)胞為人源單核細(xì)胞系,該細(xì)胞用于熱原檢測的特點(diǎn)為靈敏度高,能檢測出的熱原種類多,最重要的是它也能比較好地模擬人體對熱原的反應(yīng)。5.體外人全血法 賀慶.新的熱原檢測方法細(xì)胞法介紹J.藥物分析雜志，2008,28(3)：494-497.體外人全血法熱原檢測方法是近年來國內(nèi)外正在研究的一種熱原檢測新方法，具有檢測范圍廣泛，靈敏度高，不同個體學(xué)業(yè)的結(jié)果差異小等優(yōu)點(diǎn)。以體外人全血熱原檢

17、測方法能檢測出細(xì)菌內(nèi)毒素和非內(nèi)毒素兩大類致熱物質(zhì)。家兔法存在不易標(biāo)準(zhǔn)化、不易定量、重復(fù)性和靈敏度差、受某些藥品本身的藥理活性及理化性質(zhì)的影響較大等缺點(diǎn)。鱟實(shí)驗(yàn)法只能檢測出細(xì)菌內(nèi)毒素,對某些產(chǎn)品進(jìn)行檢查時會得出假陰性結(jié)果,此外鱟資源也非常有限。因此研究新的熱原檢測方法是一種趨勢。同時研究替代家兔法和盆實(shí)驗(yàn)法的體外方法符合國際上提倡的“3R”(減少、優(yōu)化、替代)原則。該項(xiàng)研究工作在國內(nèi)僅是一個開端,還有很多工作需要進(jìn)一步深人研究。人全血法能檢測出來源于革蘭陽性菌如金黃色葡萄球菌的脂磷壁酸而鱟實(shí)驗(yàn)卻不能。相信在不久的將來,該方法有可能作為法定的檢測方法用于藥品、生物制品和醫(yī)療器械的熱原檢查之中。四、

18、熱原消除方式1.蒸餾法去除熱原熱原雖能溶于水中不揮發(fā)，但有些可隨水蒸氣的霧滴進(jìn)入注射用水中，因此制備注射用水時，原水中的熱原可經(jīng)蒸餾除去，但需多次蒸餾，并加有隔膜裝置，單次蒸餾往往效果不理想。2.離子交換法除去熱原溶液中的熱原也可以被離子交換樹脂所吸附。用離子交換樹脂吸附可除去水中的熱原，并用于大生產(chǎn)。離子交換樹脂除去熱原的原理，是因?yàn)闊嵩镔|(zhì)大分子上有磷酸根與羧酸根，帶有負(fù)電荷，故易被強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂所交換吸附。3. 酸堿處理法除熱原熱原可被強(qiáng)酸或強(qiáng)堿所破壞，所以中藥注射劑生產(chǎn)所用容器具可用酸液或堿液處理，如以重鉻酸鉀硫酸清潔液浸泡或稀氫氧化鈉處理，破壞熱原。4高溫法熱原的耐熱性能良好，6