第11章動物細(xì)胞培養(yǎng)生物制藥

1、第第11章章 動物細(xì)胞動物細(xì)胞培養(yǎng)與生物制藥培養(yǎng)與生物制藥11.1 動物細(xì)胞培養(yǎng)的特點動物細(xì)胞培養(yǎng)的特點11.1.1 動物細(xì)胞特點動物細(xì)胞特點v無細(xì)胞壁無細(xì)胞壁v倍增時間長，生長緩慢倍增時間長，生長緩慢v培養(yǎng)中需氧量少，對攪拌敏感培養(yǎng)中需氧量少，對攪拌敏感v多以聚集體存在多以聚集體存在v原代細(xì)胞培養(yǎng)原代細(xì)胞培養(yǎng)50代即開始退化代即開始退化v細(xì)胞連接復(fù)雜細(xì)胞連接復(fù)雜v11.1.2 動物細(xì)胞培養(yǎng)定義動物細(xì)胞培養(yǎng)定義v 動物細(xì)胞與組織培養(yǎng)是從動物體內(nèi)取出動物細(xì)胞與組織培養(yǎng)是從動物體內(nèi)取出細(xì)胞或者組織，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在細(xì)胞或者組織，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在無菌、適溫和豐富的營養(yǎng)條件下，使離體無菌、

2、適溫和豐富的營養(yǎng)條件下，使離體細(xì)胞或者組織生存、生長并維持結(jié)構(gòu)和功細(xì)胞或者組織生存、生長并維持結(jié)構(gòu)和功能的一門技術(shù)。能的一門技術(shù)。v是動物細(xì)胞工程的基礎(chǔ)。是動物細(xì)胞工程的基礎(chǔ)。v11.1.2 動物細(xì)胞培養(yǎng)定義動物細(xì)胞培養(yǎng)定義v 動物細(xì)胞與組織培養(yǎng)是從動物體內(nèi)取出動物細(xì)胞與組織培養(yǎng)是從動物體內(nèi)取出細(xì)胞或者組織，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在細(xì)胞或者組織，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在無菌、適溫和豐富的營養(yǎng)條件下，使離體無菌、適溫和豐富的營養(yǎng)條件下，使離體細(xì)胞或者組織生存、生長并維持結(jié)構(gòu)和功細(xì)胞或者組織生存、生長并維持結(jié)構(gòu)和功能的一門技術(shù)。能的一門技術(shù)。動物細(xì)胞培養(yǎng)是動物細(xì)胞工程的基礎(chǔ)動物細(xì)胞培養(yǎng)是動物細(xì)胞工程的

3、基礎(chǔ)v體外培養(yǎng)分類體外培養(yǎng)分類:v1)原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)(初代培養(yǎng)初代培養(yǎng))v 指將機體取出的細(xì)胞或組織進行實效指將機體取出的細(xì)胞或組織進行實效培養(yǎng)的過程培養(yǎng)的過程.v 實效培養(yǎng)的細(xì)胞一般增殖實效培養(yǎng)的細(xì)胞一般增殖10代左右代左右.v 原代培養(yǎng)的細(xì)胞稱為原代細(xì)胞原代培養(yǎng)的細(xì)胞稱為原代細(xì)胞.v2)傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)(繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng))v 由初代培養(yǎng)產(chǎn)生的能進行無限次傳代培由初代培養(yǎng)產(chǎn)生的能進行無限次傳代培v養(yǎng)的細(xì)胞群稱養(yǎng)的細(xì)胞群稱細(xì)胞系細(xì)胞系.v 體外培養(yǎng)的細(xì)胞與體內(nèi)的起源細(xì)胞在形體外培養(yǎng)的細(xì)胞與體內(nèi)的起源細(xì)胞在形態(tài)和功能方面都存在一定的差異態(tài)和功能方面都存在一定的差異,甚至經(jīng)過甚至經(jīng)過長期穩(wěn)定的傳

4、代培養(yǎng)后還會產(chǎn)生一些變異長期穩(wěn)定的傳代培養(yǎng)后還會產(chǎn)生一些變異.11.1.3 動物細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)展歷史動物細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)展歷史v1907，美國的哈里森使用蓋玻片懸滴培養(yǎng)，美國的哈里森使用蓋玻片懸滴培養(yǎng)蛙胚神經(jīng)組織細(xì)胞蛙胚神經(jīng)組織細(xì)胞,開創(chuàng)了動物組織培養(yǎng)的開創(chuàng)了動物組織培養(yǎng)的先河先河.v1923年法國的卡勒爾設(shè)計的卡氏培養(yǎng)瓶成年法國的卡勒爾設(shè)計的卡氏培養(yǎng)瓶成功地培養(yǎng)的雞胚心肌組織功地培養(yǎng)的雞胚心肌組織.11.1.3 動物細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)展歷史動物細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)展歷史v1951年厄爾利開發(fā)了動物細(xì)胞體外培養(yǎng)的年厄爾利開發(fā)了動物細(xì)胞體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基培養(yǎng)基.v卡瑞樂將無菌技術(shù)引入組織培養(yǎng)卡瑞樂將無菌技術(shù)引入組織培養(yǎng).v近

5、年來近年來,雜交瘤細(xì)胞體外懸浮培養(yǎng)產(chǎn)生單克雜交瘤細(xì)胞體外懸浮培養(yǎng)產(chǎn)生單克隆抗體隆抗體.11.1.4 生長特性生長特性v體外培養(yǎng)的細(xì)胞據(jù)之生長方式體外培養(yǎng)的細(xì)胞據(jù)之生長方式:v1)貼附生長型貼附生長型v 細(xì)胞必須貼附在某一固相表面才能生存細(xì)胞必須貼附在某一固相表面才能生存和生長和生長. 如人胚肺細(xì)胞，如人胚肺細(xì)胞，Hela細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，神細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞v據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài):v成纖維細(xì)胞型細(xì)胞成纖維細(xì)胞型細(xì)胞v 細(xì)胞貼壁后成梭形細(xì)胞貼壁后成梭形, ,形狀大多排列疏松形狀大多排列疏松, ,v有較大的細(xì)胞間隙有較大的細(xì)胞間隙. .如人胚肺細(xì)胞如人胚肺細(xì)胞. .v上皮型細(xì)

6、胞上皮型細(xì)胞v 類似于上皮細(xì)胞類似于上皮細(xì)胞. .如如Hela細(xì)胞細(xì)胞(宮頸癌細(xì)宮頸癌細(xì)胞胞)v注意注意:v 實際情況下實際情況下,所培養(yǎng)的細(xì)胞并不一定期所培養(yǎng)的細(xì)胞并不一定期呈現(xiàn)出某一種典型的形態(tài)形式呈現(xiàn)出某一種典型的形態(tài)形式,而多呈現(xiàn)一而多呈現(xiàn)一些過度形態(tài)些過度形態(tài).v2)懸浮生長型細(xì)胞懸浮生長型細(xì)胞v 非貼附型細(xì)胞非貼附型細(xì)胞,常在培養(yǎng)液中懸浮生長常在培養(yǎng)液中懸浮生長. 如血液白細(xì)胞，淋巴組織細(xì)胞等如血液白細(xì)胞，淋巴組織細(xì)胞等v游走型細(xì)胞游走型細(xì)胞v 細(xì)胞在支持物上分散生長、胞質(zhì)常有偽細(xì)胞在支持物上分散生長、胞質(zhì)常有偽足和突起伸出、在培養(yǎng)器皿上位置不固定、足和突起伸出、在培養(yǎng)器皿上位置不

7、固定、呈游走和變形運動。如巨噬細(xì)胞。呈游走和變形運動。如巨噬細(xì)胞。v多形型細(xì)胞多形型細(xì)胞v 一般分為胞體和突起兩部分。此類細(xì)胞一般分為胞體和突起兩部分。此類細(xì)胞不常見，如神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。不常見，如神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。11.2 體外培養(yǎng)細(xì)胞基本技術(shù)體外培養(yǎng)細(xì)胞基本技術(shù)v體外培養(yǎng)特點體外培養(yǎng)特點v體外培養(yǎng)工具體外培養(yǎng)工具v體外培養(yǎng)條件體外培養(yǎng)條件v體外細(xì)胞生長增殖過程體外細(xì)胞生長增殖過程v培養(yǎng)方法培養(yǎng)方法v大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)11.2.1 體外培養(yǎng)特點體外培養(yǎng)特點v1)營養(yǎng)條件苛刻營養(yǎng)條件苛刻v除一般的營養(yǎng)物質(zhì)外除一般的營養(yǎng)物質(zhì)外,還要血清還要血清.v2)適應(yīng)性差適應(yīng)性差, 對環(huán)境

8、對環(huán)境敏感敏感v包括對包括對PH、溶解氧、二氧化碳等。、溶解氧、二氧化碳等。v3)培養(yǎng)時間長，易污染培養(yǎng)時間長，易污染v主要是生長緩慢主要是生長緩慢;顯著的污染是培養(yǎng)基的顯著的污染是培養(yǎng)基的PH迅速改變迅速改變.11.2.2 體外培養(yǎng)工具體外培養(yǎng)工具v空心纖維空心纖維:v 是一種由醋酸纖維素和硝酸纖維素混合是一種由醋酸纖維素和硝酸纖維素混合物所織成的可透性濾膜物所織成的可透性濾膜,外徑外徑1/3-1/4mm.v微球微球:v 直徑小、密度大的固體顆粒，常通過攪直徑小、密度大的固體顆粒，常通過攪拌使無懸浮狀態(tài)的細(xì)胞顆粒表面單層生長。拌使無懸浮狀態(tài)的細(xì)胞顆粒表面單層生長。11.2.3 體外培養(yǎng)條件體

9、外培養(yǎng)條件v溫度：溫度：37度度vpH：7.2-7.4v氣體：氣體：氧，二氧化碳，氮氣氧，二氧化碳，氮氣v營養(yǎng)條件：營養(yǎng)條件：培養(yǎng)基培養(yǎng)基 需要多種氨基酸，維生素，輔酶，核酸，需要多種氨基酸，維生素，輔酶，核酸，嘌呤，嘧啶，激素和生長因子，其中多種成嘌呤，嘧啶，激素和生長因子，其中多種成分可以由血清提供分可以由血清提供關(guān)于培養(yǎng)基關(guān)于培養(yǎng)基v1）天然培養(yǎng)基）天然培養(yǎng)基v 多為動物體液或組織提取液，主要有血多為動物體液或組織提取液，主要有血清、雞胚汁、組織提取液。清、雞胚汁、組織提取液。v 常配制成常配制成0.5%溶液溶液,偏酸性偏酸性v2）合成培養(yǎng)基）合成培養(yǎng)基v 據(jù)細(xì)胞種類和生長條件不同而異據(jù)

10、細(xì)胞種類和生長條件不同而異v 合成培養(yǎng)基中常要添加一部分天然培養(yǎng)合成培養(yǎng)基中常要添加一部分天然培養(yǎng)基基.多加入小牛血清多加入小牛血清v3)無血清培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基v 加入適宜的促細(xì)胞生長因子加入適宜的促細(xì)胞生長因子,保證細(xì)胞的保證細(xì)胞的良好生長良好生長.v 此外此外,動物細(xì)胞培養(yǎng)還必需一些溶液動物細(xì)胞培養(yǎng)還必需一些溶液. 如如v平衡鹽水平衡鹽水: :維持滲透壓維持滲透壓; ;調(diào)控酸調(diào)控酸/ /堿平衡堿平衡vPHPH調(diào)整液調(diào)整液:3.7%/5.6%/7.4%NaCO:3.7%/5.6%/7.4%NaCO3 3、HEPESHEPESv0.02%EDTA0.02%EDTA溶液：對細(xì)胞進行非酶性解離溶

11、液：對細(xì)胞進行非酶性解離v抗生素抗生素: :防止微生物污染防止微生物污染v 如青如青- -鏈霉素、卡那霉素等鏈霉素、卡那霉素等11.2.4 體外細(xì)胞生長增殖過程體外細(xì)胞生長增殖過程v原代培養(yǎng)期原代培養(yǎng)期v 細(xì)胞活躍，分裂但不旺盛細(xì)胞活躍，分裂但不旺盛v傳代培養(yǎng)期傳代培養(yǎng)期v 細(xì)胞增殖旺盛，可細(xì)胞增殖旺盛，可10-50次增殖次增殖v衰退期衰退期v 細(xì)胞基本不增殖，并開始衰退凋亡細(xì)胞基本不增殖，并開始衰退凋亡11.3 培養(yǎng)方法培養(yǎng)方法v1）懸滴培養(yǎng)法）懸滴培養(yǎng)法v 1907年哈里森創(chuàng)立。年哈里森創(chuàng)立。v2）旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法）旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法v 1933-1934蓋爾和劉易斯建立蓋爾和劉易斯建立v3)灌注小

12、室培養(yǎng)法灌注小室培養(yǎng)法v 1912年伯羅設(shè)計年伯羅設(shè)計v4)培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法v5)培養(yǎng)板培養(yǎng)法培養(yǎng)板培養(yǎng)法11.4 現(xiàn)代動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)現(xiàn)代動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)v依培養(yǎng)過程而言：依培養(yǎng)過程而言：v 原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)v依培養(yǎng)方法而言：依培養(yǎng)方法而言：v 貼壁培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、v 多孔載體培養(yǎng)、微囊化培養(yǎng)、多孔載體培養(yǎng)、微囊化培養(yǎng)、v 中空纖維法中空纖維法v、原代培養(yǎng)技術(shù)、原代培養(yǎng)技術(shù)v組織塊原代培養(yǎng)組織塊原代培養(yǎng)v組織消化培養(yǎng)（單層培養(yǎng)法）組織消化培養(yǎng)（單層培養(yǎng)法）v（1）組織塊原代培養(yǎng)技術(shù)）組織塊原代培養(yǎng)技術(shù)v剪切：剪切：剪碎、

13、剪碎、Hanks液清洗、（青鏈霉素液清洗、（青鏈霉素 殺菌）、殺菌）、1mm3碎塊、靜置沉降碎塊、靜置沉降v擺布：擺布：培養(yǎng)瓶底部單層擺布組織小塊培養(yǎng)瓶底部單層擺布組織小塊(間隔間隔 0.5cm）v風(fēng)干：風(fēng)干：倒轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶（塞瓶）于倒轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶（塞瓶）于36.5C溫箱溫箱 培養(yǎng)培養(yǎng)2小時小時(不超過不超過4小時小時)v培養(yǎng)培養(yǎng):加入少許培養(yǎng)液覆蓋組織后靜置培養(yǎng)加入少許培養(yǎng)液覆蓋組織后靜置培養(yǎng)關(guān)于關(guān)于Hanks液液vHanks液的配制液的配制v依次加入上述試劑至依次加入上述試劑至800 mL蒸餾水中，溶蒸餾水中，溶解后定容至解后定容至 1000 mL。v高壓滅菌高壓滅菌10min 后后,4C貯存貯存

14、.vHanks液的作用液的作用v是一種常見的是一種常見的BSS液液(平衡鹽溶液平衡鹽溶液)v(2)組織消毒培養(yǎng)技術(shù)組織消毒培養(yǎng)技術(shù)v準(zhǔn)備：準(zhǔn)備：用品消毒、洗手、用品消毒、洗手、75%擦拭手至肘部擦拭手至肘部v剪切：剪切：剪碎、剪碎、Hanks液清洗、（青鏈霉素殺菌液清洗、（青鏈霉素殺菌 30-60min）、）、2-3mm3碎塊碎塊v消化：消化：加入加入30-50倍組織體積的倍組織體積的0.25%的胰蛋的胰蛋 白酶溶液，于白酶溶液，于37C水浴或溫箱消化并水浴或溫箱消化并 每每10min左右搖動一次（最好使用磁力左右搖動一次（最好使用磁力 攪拌器）攪拌器）. 消化時間依組織塊大小而異消化時間依組

15、織塊大小而異v離心、計數(shù)：離心、計數(shù)：rpm500-1000、5min；倒置顯；倒置顯 微鏡下計數(shù)。若密度過大，加培養(yǎng)液調(diào)微鏡下計數(shù)。若密度過大，加培養(yǎng)液調(diào) 節(jié)（單層覆蓋瓶底）節(jié)（單層覆蓋瓶底）v培養(yǎng)：培養(yǎng)：向無菌全盛培養(yǎng)基上接種消化后的單層向無菌全盛培養(yǎng)基上接種消化后的單層 細(xì)胞，于細(xì)胞，于37C溫箱或溫箱或CO2培養(yǎng)箱（瓶培養(yǎng)箱（瓶 塞用透氣無菌棉塞）中培養(yǎng)。塞用透氣無菌棉塞）中培養(yǎng)。v監(jiān)控：監(jiān)控：1-2天后鏡檢（細(xì)胞形態(tài)）；培養(yǎng)液天后鏡檢（細(xì)胞形態(tài)）；培養(yǎng)液PH 值值(正常呈桃紅色，正常呈桃紅色，PH7.2-7.4；若發(fā)；若發(fā) 黃，說明偏酸，更換培養(yǎng)液）黃，說明偏酸，更換培養(yǎng)液）磁力攪拌

16、器磁力攪拌器 CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱v、傳代培養(yǎng)技術(shù)、傳代培養(yǎng)技術(shù)v 有有80-90%或剛剛?cè)繀R合的細(xì)胞是傳或剛剛?cè)繀R合的細(xì)胞是傳代培養(yǎng)的最佳時期。代培養(yǎng)的最佳時期。傳代培養(yǎng)技術(shù)過程：傳代培養(yǎng)技術(shù)過程：v1. 吸除培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。吸除培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。v2. 加入胰蛋白酶和加入胰蛋白酶和EDTA混合液少許?；旌弦荷僭S。v3. 消化消化25分鐘。當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞分鐘。當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞 間隙增大后，立即終止消化。間隙增大后，立即終止消化。v4. 清洗：向瓶內(nèi)注入清洗：向瓶內(nèi)注入Hanks液數(shù)毫升把殘液數(shù)毫升把殘 余消化液沖掉。余消化液沖掉。 注意加注意加Hanks液沖洗細(xì)胞時，動作要

17、輕，以液沖洗細(xì)胞時，動作要輕，以免把已松動的細(xì)胞沖掉流失，如用胰蛋白酶免把已松動的細(xì)胞沖掉流失，如用胰蛋白酶液單獨消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用液單獨消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用Hanks液沖洗，直接加入培養(yǎng)液。液沖洗，直接加入培養(yǎng)液。傳代培養(yǎng)技術(shù)過程：傳代培養(yǎng)技術(shù)過程：v5. 制備細(xì)胞懸液：用吸管吸取營養(yǎng)液輕輕制備細(xì)胞懸液：用吸管吸取營養(yǎng)液輕輕 反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，使之從瓶壁脫離。反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，使之從瓶壁脫離。v6. 計數(shù)后，分瓶置溫箱中培養(yǎng)。計數(shù)后，分瓶置溫箱中培養(yǎng)。 原代培養(yǎng)原代培養(yǎng) 傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)v、貼壁培養(yǎng)技術(shù)、貼壁培養(yǎng)技術(shù)v（1）材料：）材料：表面要求帶凈正電荷和高度的表面要

18、求帶凈正電荷和高度的v 表面活性。如：表面活性。如：v玻璃玻璃主要用明礬主要用明礬-硅硼酸玻璃；硅硼酸玻璃；v塑料塑料常用聚苯乙烯；常用聚苯乙烯；v金屬金屬不銹鋼和鈦是最理想的；不銹鋼和鈦是最理想的；v微載體微載體天然葡聚糖聚合物。天然葡聚糖聚合物。v（2）培養(yǎng)體系）培養(yǎng)體系v轉(zhuǎn)瓶、中空纖維、玻璃珠、微載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶、中空纖維、玻璃珠、微載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶系統(tǒng)的搖床或轉(zhuǎn)瓶機轉(zhuǎn)瓶系統(tǒng)的搖床或轉(zhuǎn)瓶機v 、貼壁培養(yǎng)技術(shù)、貼壁培養(yǎng)技術(shù)v（3）過程）過程v（4）生長特性）生長特性v 游離期：細(xì)胞呈懸浮態(tài)游離期：細(xì)胞呈懸浮態(tài)v 吸附期：多數(shù)細(xì)胞吸附期：多數(shù)細(xì)胞2424小時內(nèi)能貼壁小時內(nèi)能貼壁v 繁殖期：細(xì)胞分裂繁

19、殖期：細(xì)胞分裂v 退化期：細(xì)胞密度達到一定后，隨著營退化期：細(xì)胞密度達到一定后，隨著營v 養(yǎng)消耗和代謝物積累，開始退化。養(yǎng)消耗和代謝物積累，開始退化。、大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)、大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)v懸液培養(yǎng)，使用微球懸液培養(yǎng)，使用微球載體載體v 在液體培養(yǎng)體系中加入一定量的微球載在液體培養(yǎng)體系中加入一定量的微球載體，讓培養(yǎng)細(xì)胞貼壁在載體上。待細(xì)胞培體，讓培養(yǎng)細(xì)胞貼壁在載體上。待細(xì)胞培養(yǎng)到一定量時再將細(xì)胞消化下來轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)代養(yǎng)到一定量時再將細(xì)胞消化下來轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)代培養(yǎng)。培養(yǎng)。11.5 動物細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用動物細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用v 1962年開始，用于生物醫(yī)學(xué)研究，生年開始，用于生物醫(yī)學(xué)研究，生產(chǎn)酶制劑，生長因子，疫苗，單抗等產(chǎn)

20、酶制劑，生長因子，疫苗，單抗等。v 如：纖溶酶原激活劑（如：纖溶酶原激活劑（t-PA）、神經(jīng)生）、神經(jīng)生長因子（長因子（NGF）、）、 乙肝疫苗（乙肝疫苗（HbsAg）、）、干擾素（干擾素（IFN）、白介素（）、白介素（IL）等）等.11.5.1病毒疫苗生產(chǎn)病毒疫苗生產(chǎn)DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)基胎牛血清胎牛血清其他成分其他成分錐形瓶逐級錐形瓶逐級放大培養(yǎng)放大培養(yǎng)加堿（碳酸加堿（碳酸氫鈉）氫鈉）加糖（葡萄加糖（葡萄糖）糖）灌注培養(yǎng)液灌注培養(yǎng)液微載體微載體5L種子種子罐培養(yǎng)罐培養(yǎng)培養(yǎng)液培養(yǎng)液50L生生物物反反應(yīng)應(yīng)器器接種狂犬接種狂犬病毒病毒出液口出液口收獲病毒收獲病毒Vero細(xì)胞和狂犬病毒的培養(yǎng)工藝細(xì)胞

21、和狂犬病毒的培養(yǎng)工藝定義：定義：由病毒或誘生劑刺激機體細(xì)胞產(chǎn)生的具有由病毒或誘生劑刺激機體細(xì)胞產(chǎn)生的具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的糖蛋白?？共《?、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的糖蛋白。 種類：種類：IFN-白細(xì)胞產(chǎn)生；白細(xì)胞產(chǎn)生； IFN-成纖維細(xì)胞產(chǎn)生；成纖維細(xì)胞產(chǎn)生； IFN-致敏致敏T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞產(chǎn)生11.5.2 11.5.2 干擾素（干擾素（IFNIFN）生產(chǎn)生產(chǎn)抗病毒作用：抗病毒作用：干擾素不直接作用于病毒，而是作干擾素不直接作用于病毒，而是作用于鄰近的細(xì)胞，使其產(chǎn)生抗病毒蛋白，這些抗用于鄰近的細(xì)胞，使其產(chǎn)生抗病毒蛋白，這些抗病毒蛋白降解病毒病毒蛋白降解病毒mRNA、抑制蛋白合成。、抑制

22、蛋白合成。干擾素作用具有宿主特異性，而無病毒特異性。干擾素作用具有宿主特異性，而無病毒特異性。11.5.2 11.5.2 干擾素（干擾素（IFNIFN）生產(chǎn)生產(chǎn)干擾素作用機制示意圖干擾素作用機制示意圖v干擾素的生產(chǎn)：干擾素的生產(chǎn)： 傳統(tǒng)方法：傳統(tǒng)方法：從人血液中的白細(xì)胞內(nèi)提取從人血液中的白細(xì)胞內(nèi)提取 每每300L300L血液才能提取血液才能提取1mg 1mg 基因工程：基因工程：將干擾素基因轉(zhuǎn)移到大腸桿將干擾素基因轉(zhuǎn)移到大腸桿菌中菌中. .每千克培養(yǎng)液可提取每千克培養(yǎng)液可提取20-40 mg20-40 mg細(xì)胞細(xì)胞IFN誘生劑誘生劑產(chǎn)生特異性因子，產(chǎn)生特異性因子，使阻抑蛋白滅活使阻抑蛋白滅活干

23、擾素干擾素基因解除抑制基因解除抑制IFN基因活化產(chǎn)生干擾素基因活化產(chǎn)生干擾素干擾素產(chǎn)生機制干擾素產(chǎn)生機制:干擾素生產(chǎn)車間干擾素生產(chǎn)車間v11.5.3單克隆抗體生產(chǎn)單克隆抗體生產(chǎn)v1、何謂單克隆抗體？、何謂單克隆抗體？ 通過通過B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)細(xì)胞雜交瘤技術(shù), 獲得特異性針獲得特異性針對某一種抗原決定簇的細(xì)胞克隆，產(chǎn)生均對某一種抗原決定簇的細(xì)胞克隆，產(chǎn)生均一性的抗體一性的抗體. 單克隆抗體技術(shù)的核心是用單克隆抗體技術(shù)的核心是用骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞(myeloma cell)與經(jīng)特定抗源免疫刺激的與經(jīng)特定抗源免疫刺激的B淋巴淋巴細(xì)胞細(xì)胞(antigen stimulated B lymphobla

24、st)融合得融合得到到雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞(hybridoma cell)，雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞既能象骨髓瘤細(xì)胞那樣在體外無限增殖，又具既能象骨髓瘤細(xì)胞那樣在體外無限增殖，又具有有B B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體的能力淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體的能力。因此，。因此，單克隆抗體技術(shù)又稱為雜交瘤技術(shù)單克隆抗體技術(shù)又稱為雜交瘤技術(shù)(hybridoma technology ）。）。Niels K. Jerne G. Kohler C. Milstein 2、雜交瘤技術(shù)的基本原理、雜交瘤技術(shù)的基本原理3、雜交瘤細(xì)胞的制備、雜交瘤細(xì)胞的制備（1）骨髓瘤細(xì)胞選擇及選擇性培養(yǎng)基）骨髓瘤細(xì)胞選擇及選擇性培養(yǎng)基骨髓瘤細(xì)

25、胞本身不能分泌抗體骨髓瘤細(xì)胞本身不能分泌抗體 選擇次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖選擇次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型（激酶缺陷型（HGPRT-HGPRT-） 胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-TK-）HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)基:次黃嘌呤（次黃嘌呤（hypoxanthine，H）氨基喋呤（氨基喋呤（aminopterin， A）胸腺嘧啶脫氧核苷（胸腺嘧啶脫氧核苷（thymidine， T）（2）免疫小鼠）免疫小鼠 程序程序:取取68周齡周齡BalbC雌鼠，基礎(chǔ)免疫雌鼠，基礎(chǔ)免疫2周，靜脈再加強免疫一次，周，靜脈再加強免疫一次，35天后用于融合。天后用于融合。 免疫時是否采用佐劑和事先處理

26、抗原，要免疫時是否采用佐劑和事先處理抗原，要依抗原性的強弱而定。一般來講可溶性抗原用依抗原性的強弱而定。一般來講可溶性抗原用完全佐劑效果較好?？乖客瑯优c抗原強弱有完全佐劑效果較好。抗原量同樣與抗原強弱有關(guān)關(guān).以以IgG為例為例，第一次為，第一次為loo g，第二次為第二次為50 g，免疫途徑第一次可經(jīng)腹腔注射。對于細(xì)胞性抗免疫途徑第一次可經(jīng)腹腔注射。對于細(xì)胞性抗原不用佐劑，每次腹腔注射原不用佐劑，每次腹腔注射1l06一一1107。（3）脾細(xì)胞的制）脾細(xì)胞的制備備 引頸處死小鼠，用酒精消毒體表；引頸處死小鼠，用酒精消毒體表； 無菌條件下取出脾臟，剃除結(jié)締組織和無菌條件下取出脾臟，剃除結(jié)締組織和

27、脂肪，用脂肪，用5ml5ml無血清培養(yǎng)液沖洗一次；無血清培養(yǎng)液沖洗一次； 把脾臟置于已消毒的把脾臟置于已消毒的9090一一100100目不銹鋼網(wǎng)目不銹鋼網(wǎng)或尼龍紗網(wǎng)中；或尼龍紗網(wǎng)中； 在脾中部切開一小口，用注射器芯從一在脾中部切開一小口，用注射器芯從一端輕輕壓擠，再用無血清培養(yǎng)液沖洗，令細(xì)胞端輕輕壓擠，再用無血清培養(yǎng)液沖洗，令細(xì)胞通過紗網(wǎng)，收集入平皿中，或用注射器向脾臟通過紗網(wǎng)，收集入平皿中，或用注射器向脾臟內(nèi)注入內(nèi)注入3ml3ml無血清培養(yǎng)液，反復(fù)抽吸數(shù)次方法無血清培養(yǎng)液，反復(fù)抽吸數(shù)次方法獲取細(xì)胞，再制成細(xì)胞懸液亦可；獲取細(xì)胞，再制成細(xì)胞懸液亦可；（3）脾細(xì)胞的制）脾細(xì)胞的制備備 把細(xì)胞懸液

28、注入把細(xì)胞懸液注入50ml50ml離心管中，加離心管中，加l0l0一一20ml20ml培養(yǎng)液：輕輕吹打數(shù)次，室溫中置培養(yǎng)液：輕輕吹打數(shù)次，室溫中置5 5分鐘分鐘 離心離心(800(800一一10001000轉(zhuǎn)分轉(zhuǎn)分) )計數(shù)、備用。計數(shù)、備用。（4）細(xì)胞準(zhǔn)備）細(xì)胞準(zhǔn)備 收集骨髓瘤細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)液洗收集骨髓瘤細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)液洗3 3次次(37)(37)，計數(shù)活力細(xì)胞，計數(shù)活力細(xì)胞( (不少于不少于9090) )； 收集小鼠脾細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)液洗收集小鼠脾細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)液洗3 3次次(37)(37)，并計細(xì)胞數(shù)和測定活力細(xì)胞；，并計細(xì)胞數(shù)和測定活力細(xì)胞； 按按1 1：5 5或或1 1

29、：1010混合脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)混合脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞后，離心棄去上清，并以消毒濾紙吸凈多胞后，離心棄去上清，并以消毒濾紙吸凈多余上清。余上清。（5）細(xì)胞融合）細(xì)胞融合 將將1ml 401ml 40的的PEGPEG液一滴滴加入列細(xì)胞液一滴滴加入列細(xì)胞團中，在團中，在6060秒內(nèi)加完，同時并不斷輕微轉(zhuǎn)動秒內(nèi)加完，同時并不斷輕微轉(zhuǎn)動離心管或用手指輕彈離心管；離心管或用手指輕彈離心管； 在不斷轉(zhuǎn)動離心管中加在不斷轉(zhuǎn)動離心管中加1ml1ml無血清培養(yǎng)無血清培養(yǎng)液，液，6060秒鐘內(nèi)加完；秒鐘內(nèi)加完； 于于5 5分鐘內(nèi)慢慢加完分鐘內(nèi)慢慢加完20ml20ml無血清培養(yǎng)液；無血清培養(yǎng)液；此時細(xì)胞對機械損傷非常