第五章酶分子的化學(xué)修飾：

1、第五章 酶分子的化學(xué)修飾：自然界本身就存在著酶分子改造修飾過程,如酶原激活、可逆共價(jià)調(diào)節(jié)等。非共價(jià)修飾：添加劑；甘油、多糖、聚乙二醇等多羥基化合物表面活性劑，牛乳過氧化物酶活力在3-4天完全喪失，添加表面活性劑B2，維持獲利10天上；蛋白質(zhì)間的非共價(jià)連接-淀粉酶70半衰期5民，抗體保護(hù)，16h.從廣義上說，凡通過化學(xué)基團(tuán)的引入或除去而使蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，都可稱為酶的化學(xué)修飾。從狹義上說，酶的化學(xué)修飾則是指在較溫和的條件下，以可控制的方式使一種蛋白質(zhì)同某些化學(xué)試劑起特異反應(yīng)，從而引起單個(gè)氨基酸殘基或其功能基團(tuán)發(fā)生共價(jià)的化學(xué)改變。50年代，化學(xué)修飾用于研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。為了考察蛋白

2、質(zhì)中氨基酸殘基的各種不同狀態(tài)和確定哪些殘基處于活性部位并為蛋白質(zhì)的特定功能所必需。20世紀(jì)70年代末以來,有關(guān)用合成高分子如聚乙二醇()及其衍生物進(jìn)行蛋白質(zhì)化學(xué)修飾，目的是用于生物醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)方面。意義：1 基礎(chǔ)酶學(xué)的研究；活性部位的研究氨基酸順序分析中，胰酶對(duì)精氨酸和賴氨酸具有高度特異性,故常用此酶水解蛋白質(zhì),以制備肽碎片.為防止精氨酸和賴氨酸相互干擾的問題,可利用選擇性化學(xué)修飾劑修飾賴氨酸和精氨酸,使水解局限在其中一個(gè)殘基的肽鍵上；測定酶分子中某種氨基酸的數(shù)量。探索酶的作用機(jī)理和催化反應(yīng)歷程2 提高生物活性(包括某些在修飾后對(duì)效應(yīng)物的反應(yīng)性能改變)；3 增強(qiáng)在不良環(huán)境中的穩(wěn)定性；4 針對(duì)

3、特異性反應(yīng)降低生物識(shí)別能力解除免疫原性；5 產(chǎn)生新的催化能力。第一節(jié)酶分子的修飾方法一、酶的表面修飾（一）小分子修飾：利用小分子化合物對(duì)酶的側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定性的關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)對(duì)穩(wěn)定性而言并非最合適的，蛋白質(zhì)表面的一半基團(tuán)由非極性氨基酸組成,蛋白球體的非極性表面原子簇與水接觸不利于酶的穩(wěn)定.因此,利用小分子化合物使蛋白球表面親水化以提高酶的穩(wěn)定性。酶分子表面的功能基：羧基、氨基、巰基、羥基、咪唑基等乙酰咪唑、鹵代乙酸、N-乙基馬來酰亞胺、碳化二亞胺、焦碳酸二乙酯、四硝基甲烷、N-鹵代琥珀酰亞胺等酶分子表面的親水化提高穩(wěn)定性。廣泛應(yīng)用的小分子化合物主要：氨基葡萄糖

4、、乙酸酐、硬脂酸、鄰苯二酸酐、乙酸-N-丁二酯亞胺酯等第一個(gè)用化學(xué)修飾穩(wěn)定酶的成功實(shí)驗(yàn)是在50年代用小分子修飾的。-胰凝乳蛋白酶表面的氨基用乙醛酸修飾成親水性更強(qiáng)的一NHCH2COOH后，穩(wěn)定性在60可提高1000倍。馬肝醇脫氫酶的賴氨酸的乙基化、糖基化和甲基化都能增加其活力，同時(shí)酶穩(wěn)定性也提高許多，底物專一性也有所改變。穩(wěn)定性及一定催化特性的改變。（二）大分子修飾 可溶性大分子，如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚丙烯酸(PAA)、聚氨基酸、葡聚糖、環(huán)糊精、肝素等。PEG類修飾劑應(yīng)用最廣，具兩親性、無免疫原性和毒性。多采用單甲氧基聚乙二醇（MPEG）PEG修飾的L-天冬酰胺酶免

5、疫原性顯著降低、半衰期延長。1三氯均嗪法2.N-羥基琥珀酰亞胺法右旋糖苷修飾-淀粉酶：60,t1/2：3.5min；修飾后：175天然過氧化氫酶在6h內(nèi)很快從血液中出去，PEG修飾后，酶活力在血液循環(huán)中可保持72hMPEG修飾過氧化氫酶，有機(jī)溶液中的溶解性和酶活提高，三氯乙烷中酶活是原來的200倍，水溶液中為原來的15-20倍。穩(wěn)定性增加；提高在非水相中的催化能力；免疫原性與抗原性降低、延長半衰期。（三）交聯(lián)修飾使用雙功能或多功能試劑如戊二醛等將酶蛋白分子之間、亞基之間或分子內(nèi)不同肽鏈部分間進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)?？莶輻U菌蛋白酶交聯(lián)酶晶體，其酶活提高13倍。葡聚糖二乙醛交聯(lián)青霉素G?；?，55下的半衰期

6、提高9倍。可使酶分子活性結(jié)構(gòu)加固井可提高其穩(wěn)定性，增加了酶在非水溶液中的使用價(jià)值。（四）固定化修飾二、酶分子的內(nèi)部修飾（一） 非催化活性基團(tuán)的修飾改變酶的動(dòng)力學(xué)特征、改變酶對(duì)特殊底物的束縛能力。胰凝乳蛋白酶，Met192氧化成亞砜，該酶對(duì)含芳香族或大體積脂肪族的專一性底物的Km提高2-3倍。（二） 蛋白質(zhì)主鏈的修飾豬胰島素B鏈的丙氨酸天冬氨酸有限水解切去10個(gè)氨基酸后，酶活提高5.5倍類蛋白的合成蛋白分解產(chǎn)物(小肽或低分子蛋白)可以在一定條件下重新組合生成類蛋白。1 水解反應(yīng)能改進(jìn)熱變性蛋白質(zhì)的溶解性,也有助于分解和除去雜質(zhì)，除臭，脫色，提高風(fēng)味。2 改善氨基酸組成；提高營養(yǎng)價(jià)值。導(dǎo)入蛋白質(zhì)中

7、缺乏的某些必須氨基酸。3 提高蛋白食品的功能性質(zhì)。凝膠性，起泡性，乳化性、穩(wěn)定性等。（三） 催化活性基團(tuán)的修飾蛋白質(zhì)工程化學(xué)突變：將一種氨基酸側(cè)鏈化學(xué)轉(zhuǎn)化為另一種新的氨基酸側(cè)鏈的方法?？莶輻U菌蛋白酶活性部位的Ser轉(zhuǎn)化為半胱氨酸，對(duì)肽或酯無水解能力但保留或酯水解能力。轉(zhuǎn)化為硒代半胱氨酸。?；D(zhuǎn)移酶及氧化還原酶的活力。（四） 肽鏈伸展后的修飾脲及鹽酸胍處理，酶處于肽鏈充分伸展，提供了化學(xué)修飾內(nèi)部基團(tuán)的可能性。修飾后，適當(dāng)條件下，重新折疊。（五） 與輔因子相關(guān)的修飾1依賴輔助因子的酶 輔因子共價(jià)結(jié)合在酶上NAD共價(jià)結(jié)合到醇脫氫酶，活力為原來的40%,但解決了輔因子循環(huán)利用的問題。 引入新的或修飾過

8、的具有強(qiáng)反應(yīng)的輔因子許多酶含有輔酶或輔基，是酶的活性基團(tuán)。由于種類有限，限制了酶的功能。修飾輔因子，可創(chuàng)造出多種多樣的新酶。1988年Kaiser將黃素共結(jié)合在木瓜蛋白酶上,從而將蛋白酶轉(zhuǎn)變成氧化原酶。2.金屬酶中的金屬取代酶分子中的金屬取代可以改變酶的專一性、穩(wěn)定性及其抑制作用。用鈷取代羧肽酶活性必需的鋅，結(jié)果肽酶活性和酯酶活性都升高；但如用錳或鎘取代鋅時(shí)，其肽酶活性升高，酯酶活性卻下降。?；被崴饷富钚圆课恢械匿\被鉆取代時(shí)，酶的底物專一性和最適pH都有改變。鋅酶對(duì)N-氯-乙酰丙氨酸的最適pH為8.5，鈷酶7.0。鈷酶對(duì)另外三種底物的活力降低。5定點(diǎn)突變與化學(xué)修飾結(jié)合法第二節(jié) 酶蛋白側(cè)鏈

9、的小分子修飾一、巰基的化學(xué)修飾巰基在維持亞基間的相互作用和酶催化過程中起著重要作用。是最容易反應(yīng)的側(cè)鏈基團(tuán)。因此開發(fā)了許多修飾巰基的特異性修飾劑。烷基化試劑和其它一些鹵代酸和鹵代酰氨是重要的巰基修飾試劑. 烷基化試劑：一種重要的巰基修飾試劑，特別是碘乙酸和碘乙酰胺、巰基乙醇。其他鹵代乙酸用來修飾巰基。但也會(huì)和咪唑基結(jié)合。 有機(jī)汞試劑：對(duì)氯汞苯甲酸(pCMB)或（PMB）專一性最強(qiáng)，修飾產(chǎn)物在250nm處有最大吸收。5，5-二硫代-雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）(Ellman 試劑)也是最常用的巰基修飾劑，它與琉基反應(yīng)形成二硫鍵，釋放出1個(gè)2-硝基-5-硫苯甲酸陰離子，此陰離子在412nm處有

10、最大吸收因此能夠通過光吸收的變化跟蹤反應(yīng)程度。定量酶分子中巰基數(shù)目最常用的試劑。N乙基馬來酰亞胺是一種反應(yīng)專一性很強(qiáng)的疏基修飾劑，與巰基形成對(duì)酸穩(wěn)定的衍生物反應(yīng)產(chǎn)物在300 nm處有最大吸收。二、氨基的化學(xué)修飾賴氨酸的-NH2反應(yīng)活性很高，容易被選擇性修飾。 氨基的烷基化已經(jīng)成為一種重要的賴氨酸修飾方法，這些試劑包括有鹵代乙酸、芳香鹵、芳香族磺酸。碘代乙酸（反應(yīng)條件的控制）三硝基苯磺酸（TNBS），與賴氨酸殘基反應(yīng)，420nm，367nm能產(chǎn)生特定的光吸收。在蛋白質(zhì)序列分析中氨基的化學(xué)修飾非常重要。用于多肽鏈N-末端殘基的測定的化學(xué)修飾方法最常用的有2,4-二硝基氟苯（DNFB）法(又稱san

11、ger試劑)丹磺酞氯(DNS)法，苯異硫氰酸酯(PITC)法。 磷酸毗哆醛(PLP)是一種非常專一的賴氨酸修飾試劑，可逆反應(yīng)生成的席夫堿可通過硼氫化鈉還原來固定，反應(yīng)可通過325nm處光吸收定量。三、羧基的化學(xué)修飾水溶性的碳二亞胺類特定修飾酶的羧基已成為最普通的標(biāo)準(zhǔn)方法，它在比較溫和的條件下就可以進(jìn)行。但是在一定條件下，絲氨酸、半胱氨酸和酪氨酸也可以反應(yīng)。一、 咪唑基的化學(xué)修飾組氨酸殘基位于許多酶的活性中心，常用的修飾劑有焦碳酸二乙酯(DPC)和碘代乙酸DPC在近中性PH下對(duì)組氨酸殘基有較好的專一性，產(chǎn)物在240nm處有最大吸收，可跟蹤反應(yīng)和定量。除組氨酸的咪唑基外，DPC還可能修飾半胱氨酸巰

12、基等。用連四硫酸鈉或連四硫酸鉀對(duì)SH進(jìn)行可逆地保護(hù)。二、 吲哚基的化學(xué)修飾色氨酸殘基一般位于酶分子內(nèi)部，而且比巰基和氨基等一些親核基團(tuán)的反應(yīng)性差。N-溴代琥珀酰亞胺(NBS)，通過280 nm處光吸收的減少跟蹤反應(yīng)，但是酪氨酸存在時(shí)能與修飾劑反應(yīng)干擾光吸收的測定2-羥基-5-硝基芐溴(HNBB)和4-硝基苯硫氯對(duì)吲哚基修飾比較專一。但易于巰基作用，修飾時(shí)應(yīng)對(duì)巰基進(jìn)行保護(hù)。三、 甲硫基的化學(xué)修飾四、 二硫鍵的化學(xué)修飾通常是通過還原的方法。二硫蘇糖醇（DTT）巰基乙醇作為二硫鍵的還原劑五、 酚基的化學(xué)修飾四硝基甲烷（TNM），是最常用的酪氨酸殘基的修飾劑，在溫和條件下可高度專一的酪氨酸酚基。蘇氨酸

13、和絲氨酸殘基的專一性化學(xué)修飾研究得相對(duì)比較少，它們的羥基一般都可被修飾酚羥基的修飾試劑所修飾，只是反應(yīng)的條件要更嚴(yán)格一些，而一旦反應(yīng)，生成的產(chǎn)物要比與酚羥基生成的產(chǎn)物更穩(wěn)定。二異丙基氟磷酸（DFP）對(duì)絲氨酸有高度反應(yīng)性。苯甲基璜酰氯（PMSF）也能與絲氨酸殘基作用六、 胍基的化學(xué)修飾精氨酸殘基含有1個(gè)強(qiáng)堿性的胍基，在結(jié)合帶有陰離子底物的酶的活性部位中起著重要作用。丁二酮、1，2-環(huán)己二酮苯乙二醛：反應(yīng)在碳酸氫鹽緩沖液中反應(yīng)較快，并且，在該條件下與-氨基不反應(yīng)。4-羥基-3-硝基苯乙二醛（405nm）和對(duì)硝基苯乙二醛（340nm）具有光吸收性質(zhì)。并且對(duì)硝基苯乙二醛的產(chǎn)物具有旋光性，特別適合于精氨

14、酸的定量。第三節(jié) 酶蛋白側(cè)鏈的大分子修飾一 、PEG簡介聚乙二醇（PolyethyleneGlycol，PEG） HO(CH2CH2O)nH HOCH2CH2OCH2CH2OHn。線性分子，具有良好的生物相容性和水溶性，在體內(nèi)無毒性、無殘留、無免疫原性， 具有兩親性，既可以溶解于水，又可以溶解于絕大多數(shù)的有機(jī)溶劑; 無毒，免疫原性低 其優(yōu)異的生物相容性也已經(jīng)通過美國FDA認(rèn)證; 分子量范圍很寬，從幾百到數(shù)十萬，選擇余地大; 適合用作修飾劑或修飾劑出發(fā)原料的PEG的相對(duì)分子質(zhì)量一般為50020000 可以將它的許多優(yōu)良性質(zhì):如親水性，柔性、抗凝血性、抗巨噬細(xì)吞噬性等等，賦予修飾后的生物分子。為避

15、免在修飾過程中發(fā)生交聯(lián)和團(tuán)聚，通常采用單甲氧基聚聚乙二醇(mPEG)作為修飾劑。二、 PEG的活化1.第一代PEG衍生物缺點(diǎn)：反應(yīng)選擇性低，修飾后蛋白藥物的抗原性和半衰期改進(jìn)效果不明顯，容易引發(fā)蛋白質(zhì)的交聯(lián)與團(tuán)聚，衍生物與藥物反應(yīng)形成的連接鍵穩(wěn)定性不高。 蛋白質(zhì)或肽類分子上的反應(yīng)性官能團(tuán)多呈親核性，其親核活性通常按下列順序依次遞減:巰基>-氨基>-氨基>基>羧基。蛋白質(zhì)或多肽分子最容易與修飾劑發(fā)生作用的位點(diǎn)是分子表面賴氨酸殘基上的-氨基。傳統(tǒng)的PEG隨機(jī)修飾多以賴氨酸的-氨基為修飾目標(biāo)。在蛋白質(zhì)類分子表面往往有多個(gè)lys殘基，當(dāng)PEG衍生物無選擇性的和-氨基反應(yīng)時(shí)，不同

16、個(gè)數(shù)的PEG同蛋白質(zhì)的連接物就會(huì)有一系列不同的分子量。而且在很多情況下，PEG 的功能基團(tuán)既能同lys上的氨基反應(yīng)，又能同his上的氨基和cys上的巰基反應(yīng)，這樣形成的PEG復(fù)合物將是一個(gè)很復(fù)雜的混合物。2.第二代PEG衍生物特異性PEG修飾1，疏基修飾 此類PEG 偶聯(lián)劑主要有:PEG-馬來酰亞胺；PEG -乙烯基砜；PEG -碘乙酰胺；PEG -吡啶-二硫醚；。其中，PEG-馬來酰亞胺應(yīng)用較多。2 , N-末端氨基修飾PEG-醛；mPEG-三氟乙磺酸的修飾通常，蛋白質(zhì)N 末端氨基pKa(7.6-8.0)小于蛋白質(zhì)其他的氨基酸，PEG-醛與N PEG-醛與蛋白質(zhì)上N末端氨基反應(yīng)先形成席夫堿，

17、再經(jīng)氰基硼氫化鈉還原后可形成比較穩(wěn)定的亞胺連接體。3、羰基修飾對(duì)于N末端為絲氨酸和蘇氨酸的蛋白質(zhì)，用高碘酸鈉氧化形成醛基，與PEG -ONH2 偶聯(lián)劑發(fā)生特異性反應(yīng)生成。 而末端非絲氨酸和蘇氨酸的蛋白質(zhì)， 可以先通過轉(zhuǎn)氨反應(yīng)生成酮，或者用氨肽酶水解生成絲氨酸或蘇氨酸。4.各種結(jié)構(gòu)的PEG枝形PEG使用2個(gè)(或PEG-SC)連接到賴氨酸的或-氨基上，形成一個(gè)末端而分子量極高的PEG。叉形PEG末端有兩個(gè)活性基團(tuán)。一般情況下，相同分子量的枝形PEG比鏈形PEG修飾的產(chǎn)物有效分子量更大，有效半徑也更大，因此枝形PEG修飾的產(chǎn)物對(duì)酶降解抵抗性更強(qiáng)，并且能夠更好的遮蔽藥物的抗原決定簇；由于枝形PEG的空

18、間位阻較大，不太容易進(jìn)入藥物的活性部位，對(duì)藥物活性的影響相對(duì)較小; 由于具有較大的空間位阻，一般枝形PEG的反應(yīng)活性要低于鏈形PEG，因此所得修飾產(chǎn)物相對(duì)更為均一。第三節(jié) 酶化學(xué)修飾的基本要求一、被修飾酶的性質(zhì)1酶的穩(wěn)定性修飾反應(yīng)條件的確定。2.酶活性中心的狀況哪些氨基酸殘基參與了酶的活性中心；是否需要輔助因子、為何種輔助因子。3.酶側(cè)鏈基團(tuán)的性質(zhì)及反應(yīng)性。用于選擇修飾劑。二、修飾劑的選擇滿足如下要求:一是不引起蛋白質(zhì)的不可逆變性；二是盡可能提高修飾反應(yīng)專一性。依據(jù)試驗(yàn)的目的：1.綜合考慮如下一些問題： 蛋白質(zhì)的種類和修飾位點(diǎn)； 修飾劑對(duì)氨基酸殘基的專一性如何； 期望的修飾度是多少； 反應(yīng)是否

19、需要可逆； 修飾劑的特性：水解穩(wěn)定性和反應(yīng)活性,修飾劑與蛋白質(zhì)的連接鍵的穩(wěn)定性、毒性、免疫原性; 修飾后蛋白質(zhì)的構(gòu)象是否基本保持不變;修飾后是否需要進(jìn)一步分離;是否適合于建立快速、方便、準(zhǔn)確的分析方法;修飾劑的合成是否簡便經(jīng)濟(jì),修飾劑是否價(jià)廉易得等。2.修飾劑的要求 較高的選擇性； 溫和的反應(yīng)條件； 標(biāo)記的殘基穩(wěn)定、易通過降解分離，進(jìn)行鑒定； 反應(yīng)的程度能用簡單的技術(shù)測定。如有特殊的光吸收三、反應(yīng)條件的確定在酶穩(wěn)定的條件下進(jìn)行，盡量不破壞酶的活性基團(tuán)；是有利于選擇性地修飾蛋白質(zhì)。1pH與離子強(qiáng)度pH決定了具有潛在反應(yīng)能力的功能基所處的可反應(yīng)和不可反應(yīng)的離子狀態(tài)。由于它們的解離狀態(tài)不同，反應(yīng)性能

20、也不同。例如：在pH25時(shí)，碘乙酸可以選擇性地與Met的側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生修飾反應(yīng)，而在此pH條件下，可被碘乙酸修飾的基團(tuán)，如巰基、咪唑基和氨基等，都處于非反應(yīng)的狀態(tài)。另一方面，有些修飾試劑在不同pH條件下與同一基團(tuán)可形成不同產(chǎn)物。例如：1，2環(huán)己二酮在pH89時(shí)，與LArg生成N7，N8(1，2二羥基環(huán)已1，2烯)LArg；促在pH11時(shí)，其產(chǎn)物主要是N(1羥基5氧代2，4二氮雜雙環(huán)4菲2內(nèi)翁烯)L鳥氨酸。2.修飾反應(yīng)的溫度和時(shí)間 決定了反應(yīng)的的修飾度 影響反應(yīng)的專一性嚴(yán)嚴(yán)格控制溫度和時(shí)間可以減少以至消除些非專性的修飾反應(yīng)。比如：用聚乳糖作修飾別表面修飾酶(還原劑為氫硼化氰，BH3CN)時(shí)在8時(shí)1

21、0d內(nèi)幾乎無反應(yīng)而當(dāng)溫度從25上升到37時(shí)反應(yīng)速度加快了3倍，而且隨pH的升高而加快；又如：用甲酸氧化酶蛋白的反應(yīng)，在低溫(約10)下修飾反應(yīng)僅限于Cys、胱氨酸和Met殘基上，而在較高溫度下，甲酸可以與Trp、Tyr3酶與修飾劑的比例控制修飾度。四、修飾效果評(píng)價(jià) 修飾度和均一性的分析測定對(duì)修飾反應(yīng)評(píng)價(jià)時(shí)至少有三個(gè)因素必須考慮：第一，有多少修飾劑已經(jīng)結(jié)合到蛋白質(zhì)上；第二，哪些氨基酸被修飾劑修飾，修飾度是多少；第三，修飾物中有多少種不同形式的修飾劑蛋白質(zhì)偶合物，每種各有多少。 測定修飾度方法有直接法和間接法。直接法中以光譜法最簡單和實(shí)用，而且還很容易考察修飾反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。但此法要求修飾蛋白具有特異

22、性光譜或其光譜與修飾劑顯著差異，而符合該條件的修飾劑很少。比較容易實(shí)現(xiàn)的是間接法。間接法中比較普遍的辦法是設(shè)法測定已經(jīng)被修飾的氨基酸的數(shù)目。通常采用“TNBS法”(或稱Habeeb 法)11,12和熒光胺法13,14，這兩種方法已被證明是用來監(jiān)測作用于氨基酸的修飾劑對(duì)蛋白質(zhì)修飾程度的最為有效的方法。另一種途徑是測定已經(jīng)減少的修飾劑的量，如用兩相體系法15、質(zhì)子NMR16,和14C標(biāo)記17來檢測修飾劑的量。 由于修飾反應(yīng)的復(fù)雜性，要準(zhǔn)確測定修飾蛋白的均一性迄今仍然非常困難。質(zhì)譜、核磁共振、SDS-PAGE等都曾先后被嘗試用來分析修飾蛋白的均一性。其中以SDS-PAGE技術(shù)應(yīng)用最為普遍。毛細(xì)管電泳是另一種有用的分析方法，現(xiàn)已經(jīng)越來越多地用于PEG蛋白質(zhì)偶合物分析。最近的研究報(bào)道表明該法可以用于確定修飾蛋白中的每一個(gè)修飾基團(tuán)21,22。此外，毛細(xì)管電泳還可以用于分析碎片化的修飾蛋白確定修飾劑的修飾位點(diǎn)。第四節(jié)化學(xué)修飾對(duì)酶性質(zhì)的影響1 穩(wěn)定性增強(qiáng)l修飾劑分子存在的多個(gè)反應(yīng)基團(tuán)，常與酶形成多點(diǎn)連接。酶表面修飾后親疏水性及電荷的改變，導(dǎo)致穩(wěn)定性增強(qiáng)2