芝麻素通過抑制NF-kB的激活和調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白表達(dá)從而抑制鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞凋亡

1、芝麻素通過抑制NF-kBNF-kB的激活和調(diào)節(jié)Bcl-2Bcl-2家族蛋白表達(dá)從而抑制鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的INS-1INS-1細(xì)胞凋亡14營養(yǎng)研 黃玲艷 M14831芝麻素結(jié)構(gòu)式分子式:C20H18O6分子量:354.36摘要引言材料與方法結(jié)果與討論結(jié)論STZ:STZ:鏈脲佐菌素，鏈脲佐菌素，一種一種誘導(dǎo)動物誘導(dǎo)動物實驗性糖尿病實驗性糖尿病的廣泛使用的化學(xué)物的廣泛使用的化學(xué)物質(zhì)，可以通過增加活性氧產(chǎn)生誘導(dǎo)質(zhì)，可以通過增加活性氧產(chǎn)生誘導(dǎo)胰島胰島細(xì)胞損傷細(xì)胞損傷INS-1INS-1：胰島素分泌細(xì)胞：胰島素分泌細(xì)胞BaxBax：促凋亡因子：促凋亡因子Bcl-2Bcl-2：抗凋亡因子：抗凋亡因子NF-kB

2、NF-kB：凋亡共同：凋亡共同途徑的調(diào)節(jié)器途徑的調(diào)節(jié)器摘要糖尿病患者可因多種因素導(dǎo)致氧化應(yīng)激，導(dǎo)致胰島糖尿病患者可因多種因素導(dǎo)致氧化應(yīng)激，導(dǎo)致胰島細(xì)胞受損和細(xì)胞受損和胰島素分泌障礙。胰島素分泌障礙。在目前的研究中，我們評估芝麻素對脲鏈霉素在目前的研究中，我們評估芝麻素對脲鏈霉素(STZ)誘導(dǎo)誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制。細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制。在用在用芝麻素芝麻素濃度濃度(0.1，1.0，10.0mol/L)與培養(yǎng)與培養(yǎng)INS-1細(xì)胞細(xì)胞24h后，后，暴露暴露STZ（3mmol/L）12h。芝麻素有效提高了。芝麻素有效提高了STZ導(dǎo)致細(xì)胞損導(dǎo)致細(xì)胞損傷（通過傷（通過MTT測定）和胰島素

3、分泌能力，抑制測定）和胰島素分泌能力，抑制STZ誘導(dǎo)的細(xì)胞誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（由流式細(xì)胞儀，用膜聯(lián)蛋白凋亡（由流式細(xì)胞儀，用膜聯(lián)蛋白V和碘化丙啶雙染色）和碘化丙啶雙染色）。摘要免疫印跡分析表明，芝麻素顯著免疫印跡分析表明，芝麻素顯著抑制抑制STZ誘導(dǎo)的核因子誘導(dǎo)的核因子NF-kB活化活化，顯著，顯著下調(diào)下調(diào)Bax蛋白蛋白和和上調(diào)上調(diào)Bcl-2蛋白蛋白。芝麻素與。芝麻素與INS-1細(xì)細(xì)胞的預(yù)培養(yǎng)導(dǎo)致胞的預(yù)培養(yǎng)導(dǎo)致總抗氧化能力的顯著提高總抗氧化能力的顯著提高，并伴有顯著，并伴有顯著減少細(xì)減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化的總產(chǎn)物胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化的總產(chǎn)物，如活性氧和丙二醛。，如活性氧和丙二醛?？傊@些研究表明，芝麻素

4、有效抑制總之，這些研究表明，芝麻素有效抑制STZ導(dǎo)致導(dǎo)致INS-1細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡，這可能歸因于，至少部分地，是對這可能歸因于，至少部分地，是對NF-kB活化的抑制和活化的抑制和Bcl-2家家族蛋白的表達(dá)調(diào)控。本研究將提供一個用芝麻素及其它抗氧化族蛋白的表達(dá)調(diào)控。本研究將提供一個用芝麻素及其它抗氧化劑治療糖尿病的潛在可能。劑治療糖尿病的潛在可能。引言糖尿病是心血管疾病的主要危險因素之一，其特點(diǎn)是絕對或相糖尿病是心血管疾病的主要危險因素之一，其特點(diǎn)是絕對或相對的胰島素對的胰島素缺乏缺乏導(dǎo)致慢性高血糖癥。導(dǎo)致慢性高血糖癥。臨床研究證明，一系列因素如肥胖和運(yùn)動缺乏是胰島素抵抗的臨床研究證明，一系列

5、因素如肥胖和運(yùn)動缺乏是胰島素抵抗的危險因素，這種狀態(tài)導(dǎo)致機(jī)體不能有效利用胰島素還不得不產(chǎn)危險因素，這種狀態(tài)導(dǎo)致機(jī)體不能有效利用胰島素還不得不產(chǎn)生更多的胰島素。當(dāng)胰島不能分泌身體需求的胰島素時，多余生更多的胰島素。當(dāng)胰島不能分泌身體需求的胰島素時，多余的葡萄糖會積聚在血管中，最終導(dǎo)致的葡萄糖會積聚在血管中，最終導(dǎo)致2 2型糖尿病。型糖尿病。先前研究表明，高血糖能誘導(dǎo)胰島細(xì)胞凋亡從而加速胰島功能先前研究表明，高血糖能誘導(dǎo)胰島細(xì)胞凋亡從而加速胰島功能障礙障礙；胰島素抵抗和胰島功能障礙是胰島素抵抗和胰島功能障礙是2 2型糖尿病的兩個主要因素。型糖尿病的兩個主要因素。先前研究表明，當(dāng)先前研究表明，當(dāng)細(xì)胞

6、凋亡顯著時，胰島和細(xì)胞凋亡顯著時，胰島和細(xì)胞仍正常細(xì)胞仍正常，提，提示示細(xì)胞的凋亡是胰島功能障礙的根本原因。細(xì)胞的凋亡是胰島功能障礙的根本原因。機(jī)體不能有效利用胰島素還機(jī)體不能有效利用胰島素還不得不產(chǎn)生更多的胰島素不得不產(chǎn)生更多的胰島素胰島不能分泌身體所需胰島不能分泌身體所需的胰島素，多余的積聚的胰島素，多余的積聚在血液中在血液中引言人們普遍認(rèn)識到人們普遍認(rèn)識到高血糖是通過活性氧介導(dǎo)導(dǎo)致高血糖是通過活性氧介導(dǎo)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡，這是，這是糖尿病患者常見的病理機(jī)制。糖尿病患者常見的病理機(jī)制。引言基于糖尿病、氧化應(yīng)激和基于糖尿病、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系，抗氧化劑對細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系，抗氧化

7、劑對細(xì)細(xì)胞的作用受到了更多的關(guān)注。胞的作用受到了更多的關(guān)注。芝麻素（芝麻素（98%）是芝麻種子的一種主要的）是芝麻種子的一種主要的木質(zhì)素木質(zhì)素，有強(qiáng)效的抗，有強(qiáng)效的抗氧化能力，已被證明對高血壓和高血脂有益。先前研究表明，芝氧化能力，已被證明對高血壓和高血脂有益。先前研究表明，芝麻素能提高胰島素抵抗和改善糖尿病，而其機(jī)制還不清楚。麻素能提高胰島素抵抗和改善糖尿病，而其機(jī)制還不清楚。本研究中，我們驗證了芝麻素對本研究中，我們驗證了芝麻素對STZ誘導(dǎo)誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞凋亡的影響細(xì)胞凋亡的影響及及其機(jī)制，為芝麻素治療糖尿病及其并發(fā)癥提供依據(jù)。其機(jī)制，為芝麻素治療糖尿病及其并發(fā)癥提供依據(jù)。大量研究表明，

8、抗氧化劑的補(bǔ)充能有效提高機(jī)體抗氧化能力大量研究表明，抗氧化劑的補(bǔ)充能有效提高機(jī)體抗氧化能力和減少和減少細(xì)胞的氧化損傷，顯著改善糖尿病及其并發(fā)癥。細(xì)胞的氧化損傷，顯著改善糖尿病及其并發(fā)癥。材料與方法細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞活力測定細(xì)胞活力測定胰島素分泌測定胰島素分泌測定細(xì)胞凋亡測定細(xì)胞凋亡測定蛋白質(zhì)印跡分析蛋白質(zhì)印跡分析細(xì)胞內(nèi)活性氧水平測定細(xì)胞內(nèi)活性氧水平測定生化分析生化分析數(shù)據(jù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)統(tǒng)計細(xì)胞培養(yǎng)大鼠胰島素分泌大鼠胰島素分泌細(xì)胞系細(xì)胞系INS-1細(xì)胞培養(yǎng)在含有細(xì)胞培養(yǎng)在含有50umol/L 巰基巰基乙醇，乙醇，1mmol/L鈉丙酮酸鹽，鈉丙酮酸鹽，2mmol/L谷氨酰胺，谷氨酰胺，100IU /

9、mL青霉素，青霉素，100ug/ mL鏈霉素和鏈霉素和10胎牛血清的胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)培養(yǎng)基?？諝鉂穸然?。空氣濕度95，5CO 2，溫度，溫度371。細(xì)胞活力測定：MTTMTT 41011胰島素分泌測定細(xì)胞凋亡測定蛋白質(zhì)印跡分析蛋白濃度用蛋白質(zhì)測定試劑盒測定，牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)化為肌動蛋白或組蛋白H2A水平細(xì)胞內(nèi)活性氧水平測定細(xì)胞內(nèi)活性氧水平通過流式細(xì)胞儀分析測定，用二氯二乙酸酯，細(xì)胞內(nèi)活性氧水平通過流式細(xì)胞儀分析測定，用二氯二乙酸酯，為活性氧敏感探針。為活性氧敏感探針。 生化分析TACTAC由三價鐵還原抗由三價鐵還原抗氧化能力測定氧化能力測定（FRAPFRAP法）法）MDA

10、MDA由試劑盒測定硫由試劑盒測定硫代巴比妥酸物質(zhì)的代巴比妥酸物質(zhì)的含量含量數(shù)據(jù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)以平均值標(biāo)準(zhǔn)差標(biāo)示。數(shù)據(jù)先進(jìn)行單向方差分析（數(shù)據(jù)以平均值標(biāo)準(zhǔn)差標(biāo)示。數(shù)據(jù)先進(jìn)行單向方差分析（ANOVAANOVA），），隨后進(jìn)行隨后進(jìn)行dennettsdennetts檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析。檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析。0 0的值被認(rèn)為是統(tǒng)計學(xué)的值被認(rèn)為是統(tǒng)計學(xué)顯著。用顯著。用SPSS 21.0SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果與討論INS-1INS-1細(xì)胞細(xì)胞存活率存活率的影響的影響INS-1INS-1細(xì)胞細(xì)胞胰島素分泌胰島素分泌的影響的影響INS-1INS-1細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡的影響的影響NF-kBNF-k

11、B 活化和活化和BaxBax、Bcl-2Bcl-2蛋白蛋白表達(dá)的影響表達(dá)的影響細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)活性氧活性氧產(chǎn)生的影響產(chǎn)生的影響INS-1INS-1細(xì)胞細(xì)胞TACTAC和和MDAMDA含量的影響含量的影響芝麻素芝麻素對對芝麻素對INS-1INS-1細(xì)胞存活率的影響經(jīng)經(jīng)MTTMTT測定法測定，暴露于測定法測定，暴露于STZSTZ（3mmol/L3mmol/L）12h 12h 顯著地減少顯著地減少INS-1INS-1細(xì)胞細(xì)胞存活率，而存活率，而1.0umol/L1.0umol/L和和10.0umol/L10.0umol/L芝麻素預(yù)培養(yǎng)芝麻素預(yù)培養(yǎng)24h24h能顯著提高能顯著提高INS-INS-1 1細(xì)胞

12、存活率細(xì)胞存活率。芝麻素能保護(hù)芝麻素能保護(hù)INS-1細(xì)細(xì)胞免于胞免于STZ誘導(dǎo)的傷害。誘導(dǎo)的傷害。與先前報道抗氧化劑可與先前報道抗氧化劑可保護(hù)保護(hù)INS-1細(xì)胞細(xì)胞結(jié)果結(jié)果一一致致。單獨(dú)芝麻素培育單獨(dú)芝麻素培育24h24h，沒有顯示對沒有顯示對INS-1INS-1細(xì)細(xì)胞存活率有影響（數(shù)胞存活率有影響（數(shù)據(jù)未顯示）據(jù)未顯示）芝麻素對INS-1INS-1細(xì)胞胰島素分泌的影響暴露于暴露于STZ 12h誘導(dǎo)誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞的基本胰島素分泌和血糖刺激胰島素分細(xì)胞的基本胰島素分泌和血糖刺激胰島素分泌顯著減少，而和芝麻素預(yù)培養(yǎng)導(dǎo)致的胰島素分泌能力明顯改善。泌顯著減少，而和芝麻素預(yù)培養(yǎng)導(dǎo)致的胰島素分泌能力明

13、顯改善。芝麻素對INS-1INS-1細(xì)胞凋亡的影響對照組對照組STZSTZ組組0.1umol/L0.1umol/L芝麻素芝麻素0.1umol/L0.1umol/L芝麻素芝麻素0.1umol/L0.1umol/L芝麻素芝麻素膜聯(lián)蛋白膜聯(lián)蛋白V-FITC/PIV-FITC/PI雙雙染，流式細(xì)胞儀測定染，流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡芝麻素對INS-1INS-1細(xì)胞凋亡的影響暴露于暴露于STZSTZ的的INS-1INS-1細(xì)胞細(xì)胞凋亡顯著，而和芝麻素與培養(yǎng)的導(dǎo)致的細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞凋亡顯著，而和芝麻素與培養(yǎng)的導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡顯著降低。凋亡顯著降低。這個結(jié)果與芝麻素預(yù)培這個結(jié)果與芝麻素預(yù)培養(yǎng)組細(xì)胞活力提高、胰

14、養(yǎng)組細(xì)胞活力提高、胰島素分泌能力增加相應(yīng)，島素分泌能力增加相應(yīng)，表明芝麻素對表明芝麻素對INS-1細(xì)胞細(xì)胞的保護(hù)作用可能是通過的保護(hù)作用可能是通過抑制細(xì)胞凋亡實現(xiàn)的。抑制細(xì)胞凋亡實現(xiàn)的。芝麻素對NF-kBNF-kB活化和BaxBax、Bcl-2Bcl-2蛋白表達(dá)的影響STZSTZ誘導(dǎo)誘導(dǎo)NF-kBNF-kB活化顯著提高，表現(xiàn)為活化顯著提高，表現(xiàn)為p65p65亞基核水平的顯著提高，而芝麻亞基核水平的顯著提高，而芝麻素預(yù)處理組導(dǎo)致素預(yù)處理組導(dǎo)致NF-kBNF-kB核移位的抑制。此外，暴露于核移位的抑制。此外，暴露于STZSTZ顯著上調(diào)顯著上調(diào)BaxBax蛋白蛋白和下調(diào)和下調(diào)Bcl-2Bcl-2蛋白

15、，而芝麻素預(yù)處理組顯著逆轉(zhuǎn)蛋白，而芝麻素預(yù)處理組顯著逆轉(zhuǎn)STZSTZ誘導(dǎo)的變化。誘導(dǎo)的變化。芝麻素對細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生的影響暴露于暴露于STZ12h STZ12h 誘導(dǎo)誘導(dǎo)INS-1INS-1細(xì)胞內(nèi)活性氧化物的增加，表現(xiàn)為細(xì)胞的熒光陽細(xì)胞內(nèi)活性氧化物的增加，表現(xiàn)為細(xì)胞的熒光陽性率增加和細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度增加。而芝麻素預(yù)處理組能顯著降低性率增加和細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度增加。而芝麻素預(yù)處理組能顯著降低INS-1INS-1細(xì)細(xì)胞的熒光陽性率和平均胞的熒光陽性率和平均INS-1INS-1細(xì)胞熒光強(qiáng)度細(xì)胞熒光強(qiáng)度。芝麻素能降低芝麻素能降低STZ誘誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)活性氧。導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)活性氧。芝麻素對細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生的影響

16、先前研究表明，先前研究表明，STZ誘導(dǎo)胰島誘導(dǎo)胰島細(xì)胞凋亡是由活性氧介導(dǎo)的，當(dāng)細(xì)胞凋亡是由活性氧介導(dǎo)的，當(dāng)暴露于暴露于STZ時，活性氧由時，活性氧由細(xì)胞大量產(chǎn)生。細(xì)胞大量產(chǎn)生。過量的活性氧不僅造過量的活性氧不僅造成線粒體、生物膜和核的直接損傷，還誘導(dǎo)成線粒體、生物膜和核的直接損傷，還誘導(dǎo)NF-kB的活化，涉的活化，涉及免疫的一系列氧化還原敏感轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)調(diào)控，炎癥和細(xì)及免疫的一系列氧化還原敏感轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)調(diào)控，炎癥和細(xì)胞凋亡。胞凋亡。作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子，作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子，NF-kB仍以未激活的形式保留在仍以未激活的形式保留在細(xì)胞質(zhì)中與細(xì)胞質(zhì)中與它它的抑制者的抑制者IkB聯(lián)結(jié)，

17、聯(lián)結(jié)，抑制抑制NF-kB的的核移位核移位。多。多種刺激，包括活性氧，種刺激，包括活性氧，IkB能被能被IkB激酶（激酶（IKK）激活并從）激活并從NF-kB分離出來，允許分離出來，允許NF-kB移位到細(xì)胞核，在細(xì)胞核它與目標(biāo)基移位到細(xì)胞核，在細(xì)胞核它與目標(biāo)基因結(jié)合并啟動轉(zhuǎn)錄。因結(jié)合并啟動轉(zhuǎn)錄。Bcl-2 蛋白家族是蛋白家族是NF-kB的目標(biāo)基因，是凋亡共同途徑的關(guān)鍵調(diào)的目標(biāo)基因，是凋亡共同途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器。節(jié)器。在這些蛋白中，促凋亡成員，如在這些蛋白中，促凋亡成員，如Bax可誘導(dǎo)線粒體凋亡因子如細(xì)可誘導(dǎo)線粒體凋亡因子如細(xì)胞色素胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的釋放，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。和凋亡誘導(dǎo)因子

18、進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的釋放，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。與此相反，與此相反，Bcl-2通過螯合親半胱氨酸蛋白酶或阻止線粒體凋亡因通過螯合親半胱氨酸蛋白酶或阻止線粒體凋亡因子向細(xì)胞質(zhì)的釋放來抗凋亡。子向細(xì)胞質(zhì)的釋放來抗凋亡。芝麻素預(yù)培養(yǎng)組顯著扭轉(zhuǎn)芝麻素預(yù)培養(yǎng)組顯著扭轉(zhuǎn)STZ誘導(dǎo)的誘導(dǎo)的Bax和和Bcl-2蛋白的表達(dá)，表蛋白的表達(dá)，表明芝麻素能抑制明芝麻素能抑制STZ誘導(dǎo)誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞凋亡，可能是與細(xì)胞凋亡，可能是與NF-kB活化的活化的抑制抑制和隨后和隨后Bcl-2蛋白家族表達(dá)抑制蛋白家族表達(dá)抑制有關(guān)。有關(guān)。這個結(jié)果是與先前研究觀察到的這個結(jié)果是與先前研究觀察到的STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠的調(diào)查誘導(dǎo)糖尿病大鼠的調(diào)查結(jié)果結(jié)

19、果相符相符。與另一份報告表明與另一份報告表明NF-kB活化顯著上調(diào)活化顯著上調(diào)Bax蛋白的結(jié)果相符，蛋白的結(jié)果相符，但但Bcl-2蛋白表達(dá)不變。這種差異背后的機(jī)制仍不清楚需要進(jìn)一步蛋白表達(dá)不變。這種差異背后的機(jī)制仍不清楚需要進(jìn)一步的調(diào)查。的調(diào)查。暴露STZ本研究表明：本研究表明：芝麻素對INS-1INS-1細(xì)胞TACTAC和MDAMDA含量的影響暴露于暴露于STZ12h 導(dǎo)致導(dǎo)致INS-1細(xì)胞總抗氧化能力降低和細(xì)胞總抗氧化能力降低和MDA含量增加，而芝含量增加，而芝麻素預(yù)培養(yǎng)組有效扭轉(zhuǎn)了麻素預(yù)培養(yǎng)組有效扭轉(zhuǎn)了STZ引起的這個改變。引起的這個改變。這些結(jié)果與觀察到的芝麻素可減少細(xì)胞內(nèi)活性這些結(jié)果與觀察到的芝麻素可減少細(xì)胞內(nèi)活性氧相符，表明芝麻素能提高氧相符，表明芝麻素能提高INS-1INS-1細(xì)胞的抗氧化細(xì)胞的抗氧化能力，從而降低能力，從而降低INS-1INS-1細(xì)胞活性氧和氧化損傷。細(xì)胞活性氧和氧化損傷。作為氧化還原敏感轉(zhuǎn)錄因子，作為氧化還原敏感轉(zhuǎn)錄因子，NF-kB活化和隨后基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活化和隨后基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)可被氧化應(yīng)激促發(fā)?？杀谎趸瘧?yīng)激促發(fā)。本研究中，本研究中，STZ顯著誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生和顯著誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生和INS-1細(xì)胞脂質(zhì)過氧化，細(xì)胞脂質(zhì)過氧化，而芝麻素預(yù)培養(yǎng)組能有效增加而芝麻素預(yù)培養(yǎng)組能有效增加INS-1細(xì)胞的