木瓜蛋白酶水解核桃蛋白的工藝條件優(yōu)化及水解物抗氧化活性研究

1、木瓜蛋白酶水解核桃蛋白的工藝條件優(yōu)化及水解物抗氧化活性研究劉昭明 ,黃翠姬 ,巫俊良 ,黃娟娟( 廣西工學(xué)院生物與化學(xué)工程系 , 廣西柳州 545006)摘要 目的 研究采用木瓜蛋白酶水解核桃蛋白的工藝條件及水解物的抗氧化活性 。 方法 采用正交試驗法確定木瓜蛋白酶水解核桃蛋白的最適工藝條件 ,采用 Sephadex G - 25 凝膠色譜分離酶水解物 ,通過測定羥自由基(OH·) 和超氧陰離子自由基清除能力研究了酶水解物的抗氧化活性 。 結(jié)果 核桃蛋白木瓜蛋白酶水解的最優(yōu)條件是溫度 55 ,底物濃度 4 % ,酶濃度 60 000 U/ g ,p H 值 8. 0 ;在水解度達到

2、38. 4 %時 ,其酶解產(chǎn)物對羥自由基(OH·) 和超氧陰離子自由基(O2·) 的清除率分別為 22. 5 %和 46. 4 % 。采用 Sephadex G - 25 凝膠柱層析對水解度 38. 4 %的酶水解物進行分離得到了 A 、B 、C 和 D 4 個肽片段 ,其中肽片段 C 的自由基清除能力最大 。 結(jié)論 核桃蛋白木瓜蛋白酶水解物具有一定抗氧化活性 。關(guān)鍵詞 核桃蛋白 ;木瓜蛋白酶 ;抗氧化活性 ;酶水解物文章編號 0517 - 6611 (2009) 13 - 06136 - 03中圖分類號 TS214. 2文獻標(biāo)識碼 AStudy on the Optimi

3、zation of the Technological Conditions of Walnut Protein Hydrolyzeed by Papain and the Antioxidative Activity of Its Hy 2drolysateLIU Zhao2ming et al(Department of Biological and Chemical Engineering , Guangxi University of Technology , Liuzhou , Guangxi 545006 )AbstractObjective The research aimed

4、to investigate the optimum technological conditions of walnut protein hydrolyzed by papain and antioxidativeactivity of its hydrolysate . Method The optimum technological conditions of walnut protein hydrolyzed by papain were confirmed by orthogonal experi2ment . The enzyme hydrolysate was separated

5、 by Sephadex G - 25 gel filtration and the antioxidative activities of hydrolysate were studied through determin 2ing the scavenging activities of hydroxyl and superoxide anion free radicals. Result The optimum conditions for the papain hydrolysis of walnut proteinwere as follows : the temperature o

6、f 55 , substrate concentration of 5 % , enzyme concentration of 60 000 U/ g and p H of 8. 0. When the hydrolysis de 2gree was 38. 4 % , the scavenging rate of its enzymolysis products to hydroxyl free radicals superoxide anion free radicals were 22. 5 % and 46. 4 % respec 2 tively. Four fractional p

7、eptides were obtained from hydrolysate by Sephadex G - 25 gel filtration. Among them , the scavenging capability of the peptide C was the biggest . Conclusion The papain hydrolysate of walnut protein had certain antioxidative activity.Key wordsWalnut protein ;Papain ; Antioxidative activity ; Hydrol

8、ysate抗氧化肽是一種具有抗氧化活性的生物活性肽 ,具有清除體內(nèi)自由基的功能 ,是一種潛在可以利用的外源性抗氧化 物質(zhì)1 ,有可能是食品工業(yè)中潛在的天然 、安全 、高效的抗氧由梅特勒 - 托利多儀器 (上海) 有限公司生產(chǎn) ;LXJ - II 型離心機 ,由上海醫(yī)分儀器制造有限公司生產(chǎn) ;UV mini 1240 紫外 可見分光光度計 ,由日本島津公司生產(chǎn) 。1. 3 試驗方法1. 3. 1 水解度的測定 。采用 pH2Stat 法6 。1. 3. 2 肽含量的測定 。采用雙縮脲法7 。1. 3. 3 核桃蛋白木瓜蛋白酶水解條件的正交試驗優(yōu)化 。影 響蛋白質(zhì)酶水解的因素主要有底物濃度 、酶濃

9、度 、反應(yīng)體系的 pH 值 、溫度和反應(yīng)時間等 。在試驗中 ,固定反應(yīng)的時間 ,以水解度 (DH) 為評價指標(biāo) ,在單因素試驗的基礎(chǔ)上 ,確定底 物濃度 、酶濃度 、反應(yīng)體系的 pH 值 、溫度的系列值 ,采用正交 表 L9 (34) 安排試驗 (表 1) 。表 1 核桃蛋白木瓜蛋白酶水解試驗安排Table 1 The papain hydrolysis experiment arrangement of walnut protein化劑2 - 3。核桃仁中含有 20 %左右的蛋白質(zhì) ,采用酶水解核桃蛋白可以制得具有抗氧化活性的生物活性肽 。2007 年 ,易建華等 研究了采用 Alcalas

10、e 2. 4 L 和 Neutrase 0. 8 L 水解核桃蛋白所得的水解物的抗氧化性4 。2008 年 ,劉昭明等研究了采用中性蛋白酶水解核桃蛋白所得的水解物的抗氧化性 ,并將酶水 解物分離得到 4 種分子量范圍的肽混合物5 。由于肽的抗 氧化活性與其氨基酸的組成與序列有關(guān)3 ,蛋白酶催化蛋白 水解反應(yīng)又具有高度的專一性 ,因此 ,有必要探討不同種類 的蛋白酶水解核桃蛋白所得的水解產(chǎn)物的抗氧化活性的大 小 。筆者以核桃蛋白為底物 ,研究木瓜蛋白酶水解核桃蛋白 的工藝條件 ,對獲得的水解產(chǎn)物進行葡聚糖凝膠柱層析分 離 ,測定水解物對羥自由基和超氧陰離子自由基的清除能 力 ,旨在探討核桃蛋白水

11、解產(chǎn)物的抗氧化活性 ,為進一步開 發(fā)利用提供理論依據(jù) 。1 材料與方法1. 1 材料 核桃蛋白質(zhì) ,自制 ,蛋白質(zhì)含量為 75 % ; 木瓜蛋 白酶 ,活力 60 萬 U/ g ,由廣西東恒華道生物科技有限公司生 產(chǎn) ;葡聚糖凝膠 Sephadex G - 25 ,由 Sigma 公司生產(chǎn) ;其他試劑均為分析純 。序號Serial number溫度 (A) 底物濃度 (B) %酶濃度 (C) U/ gEnzyme concentrationpH 值 (D)pHvalueTemper2atureSubstrate concentration1234567845454550505055554565

12、646436 00048 00060 00036 00048 00060 00036 00048 0007. 58. 08. 58. 57. 58. 08. 08. 59 55 5 60 000 7. 5 1. 2 儀器與設(shè)備超級恒溫槽 ,由上海精密儀器有限公司1. 3. 4 核桃蛋白木瓜蛋白酶水解物的制備 。準(zhǔn)確稱取一定量的核桃蛋白 ,按照正交試驗確定的最佳酶解條件進行水 解 ,在水解的過程中不斷滴加 0. 5 mol/ L 的 NaOH 溶液 ,使 pH 值穩(wěn)定在最適 pH 值 ,達到一定的水解度后 ,沸水浴滅酶 10 min ,冷卻后在 3 000 r/ min 下離心 15 min ,

13、取上清液 ,即得到核 桃蛋白水解物溶液 。生產(chǎn) ;高速離心分離機 ,由上海手術(shù)機械廠生產(chǎn) ; 電子天平 ,基金項目 廣西區(qū)教育廳科研立項項目 (200708LX184) ; 廣西工學(xué)院食品科學(xué)碩士 學(xué) 位 授 權(quán) 點 學(xué) 科 建 設(shè) 經(jīng) 費 資 助 項 目 ( 院 科 自0705104) 。作者簡介 劉昭明 (1966 - ) ,男 ,廣東廣州人 , 碩士 ,副教授 ,從事食品工藝與生物技術(shù)研究 。收稿日期 200920221337 卷 13 期劉昭明等 木瓜蛋白酶水解核桃蛋白的工藝條件優(yōu)化及水解物抗氧化活性研究6137表 2 核桃蛋白酶解正交試驗結(jié)果分析Table 2 The result

14、analysis of the orthogonal experiment of the enzyme hy2drolysis of walnut protein1. 3. 5 活性肽的分離 。取一定量的核桃蛋白酶水解物用蒸餾水制成一定濃度的蛋白肽溶液 ,過 0. 22 m 的微濾膜 。收 集到的溶 液 再 經(jīng) Sephadex G - 25 凝 膠 層 析 柱 ( 1. 2 cm ×80cm) ,以蒸餾水為洗脫液進行洗脫 ,控制恒定流速 ,洗脫速度 為 0. 5 ml/ min ,每管收集 1 ml 洗脫液 。測定各管的 OD280 nm , 作洗脫體積與 OD 值的關(guān)系圖 ,并將

15、分離得到的各個峰合 并 ,然后測定其抗氧化活性 。1. 3. 6 抗氧化活性研究 。1. 3. 6. 1 羥自由基 (OH·) 清除能力的測定 。采用鄰二氮菲 -序號 溫度 (A) 底物濃度 (B) % 酶濃度 (C) U/ g pH 值 (D)SerialTemper2SubstrateEnzymepHDHnumber ature concentration concentration value 12345678945454550505055555545645645636 00048 00060 00048 00060 00036 00060 00036 00048 0007.

16、58. 08. 58. 57. 58. 08. 08. 57. 50. 120. 250. 330. 210. 340. 230. 350. 240. 21Fe2 + 氧化法8 - 9。取 1. 5 mmol/ L 的鄰二氮菲溶液 1 ml 于試管中 ,依次加入磷酸鹽緩沖液 PBS(0. 2 mol/ L ,pH 值 7. 4) 2 ml 和蒸餾水 1 ml 、0. 75 mmol/ L 硫酸亞鐵液 1 ml ,充分混勻 ,加 0. 01 % H2O21 ml ,于 37 下恒溫反應(yīng) 45 min ,于 536 nm 處測其吸光度 ,其值稱 A P ; 同前步 ,用 1 ml 蒸餾水代替 H2

17、O2 ,測得的吸光度 稱 AB ; 用試樣液 1 ml 代替 中的 1 ml 蒸餾水 ,測得到吸光度 稱 AS ;HO·自由基清除率( SA1) 計算公式為 :K1 j K2 j K3 jRj0. 700. 780. 800. 100. 680. 830. 770. 150. 590. 670. 760. 170. 670. 830. 780. 16AS - A PSA1 = A×100 %- AB P1. 3. 6. 2 超氧陰離子自由基 (O2 ·) 的清除能力的測定 。采用鄰苯三酚方法10 。在一系列的試管中加 3 ml 0. 05 mol/ L 的 Tri

18、s2HCl 緩沖液 (pH 值 8. 2) ,分別加入待測樣品溶液 100 l , 空白組加入同體積蒸餾水 ,再加入 100 l 0. 45 mol/ L 鄰苯三 酚溶液 ,振蕩并計時 ,至 3 min 時 ,立即加入 100l 3 %抗壞血 酸溶液 ,振蕩 ,終止反應(yīng) ,在 325 nm 處測吸光度 A 。以空白的 吸光度為 Ao , 加樣品溶液時的吸光度為 As , 自由基清除率 ( SA2) 公式為 :圖 1 核桃蛋白酶水解物水解度與自由基清除能力的關(guān)系Fig. 1 The relationship bet ween the hydrolysis degree of walnut pro

19、2tease hydrolysate and the scavenging capability of free radicals2. 3 酶水解物的層析分離對水解度為 38. 4 %的核桃蛋白 酶水解產(chǎn)物采用 Sephdex G225 凝膠柱層析進行分離 ,測定每AO - ASSA2 =×100 %AO2 結(jié)果與分析2. 1 酶水解工藝條件的優(yōu)化蛋白質(zhì)水解的影響因素主要有底物濃度 、酶濃度 、酶解溫度 、pH 值和反應(yīng)時間 。其中 ,底物濃度 、酶濃度 、酶解溫度和 pH 值會影響到水解的速率 ,在 這四者確定的情況下 ,在一定的水解時間范圍內(nèi) ,蛋白質(zhì)的 水解度隨水解的時間增加而

20、增大 ,因此 ,在試驗中考察底物 濃度 、酶濃度 、酶解溫度和 pH 值的取值對水解度的影響 ,水 解時間固定為 3 h ,以水解度為評價的指標(biāo) 。由表 2 可知 ,影響水解度的因素由主到次的順序是 : 酶 濃度 > 底物濃度 > pH 值 > 溫度 ,最優(yōu)組合是 A3B2 C3D3 ,即溫 度 55 ,底物濃度 5 % ,酶濃度 60 000 U/ g ,pH 值 8. 0 。因此 , 采用該工藝條件進行蛋白質(zhì)水解試驗 。2. 2 不同水解度的酶解物對羥自由基( O H·) 和超氧陰離子 自由基( O2·) 的清除能力 從圖 1 中可以看出 ,隨著水解度

21、的提高 ,酶解物對羥自由基 (OH·) 和超氧陰離子自由基(O2 ·)的清除能力也越強 ,在水解度達到 24. 2 %時 ,其對羥自由基(OH·) 和超氧陰離子自由基 (O2 ·) 的清除率分別為 22. 5 %和46. 4 % 。該結(jié)論與吳建中水解大豆蛋白獲得的酶水解物的 抗氧化活性的結(jié)論一致10 。研究認為 ,酶解物的疏水性越大 ,其抗氧化活性越大11 - 13 。因此 ,核桃蛋白的水解度增大 ,自由基清除能力增大的原因可能是隨著水解度的提高 , 原來包埋在蛋白質(zhì)肽鏈內(nèi)部的疏水性氨基酸殘基轉(zhuǎn)移到了 外部 ,有利于其抗氧化性質(zhì)的發(fā)揮 。管洗脫液的 OD

22、。從圖 2 可以看出 ,通過凝膠 Sephadex G2280 nm25 層析后分出了 A 、B 、C 和 D 4 個肽片段 。圖 2 核桃蛋白酶水解物 Sephdex G225 凝膠層析色譜圖Fig. 2 Sephadex G225 gel chromatogram of walnut proteinase hy2drolysate2. 4 不同肽片段的抗氧化活性將所得的 4 個峰的肽片段 合并 ,并通過稀釋或濃縮使肽含量為 0. 3 mg/ ml ,然后分別測定各個部分的羥自由基和超氧陰離子的清除能力 。從表 3可以看出 ,不同的肽片段其清除自由基的能力存在差異 ,其 中 ,C 片段的清除

23、自由基的能力最強 ,D 片段最弱 。根據(jù)凝膠6138安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2009 年idative effects of giant squid muscle peptides on free radical2mediated oxidative systemsJ .Journal of Nutrition Biochemistry ,2005 ,16 :562 - 569.2 LI Y H ,J IANG B ,ZHANG T ,et al . Antioxidant and free radical 2scavenging ac2tivities of chickpea protein hydro

24、lysate (CPH) J . Food Chemistry ,2008 ,106 :444 - 450.3 J E J Y,QIAN Z J ,BYUN H G,et al . Purification and characterization of an an 2 tioxidant peptide obtained from tuna backbone protein by enzymatic hydrolysis J . Process Biochemistry ,2007 ,42 :840 - 846.色譜的原理可以知道 ,在 A 、B 、C 和 D 4 個片段中 ,分子量最大的是

25、 A ,最小的是 D 。表 3 不同肽片段的抗氧化活性Table 3 The antioxidative activities of different peptide fragments%肽片段 Peptide fragmentSA1SA24易建華 ,朱振寶 ,董文賓. 核桃蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化活性的研究J . 食品工業(yè)科技 ,2007 (4) :84 - 86.劉昭明 ,黃翠姬 ,孟陸麗 ,等. 核桃蛋白中性蛋白酶水解物的制備及其抗氧化活性研究J . 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) ,2008 ,36 (35) :15696 - 15697 ,15701.徐英操 ,劉春紅. 蛋白質(zhì)水解度測定方法綜述J . 食

26、品研究與開發(fā) ,2007 ,28 (7) :173 - 176.大連輕工業(yè)學(xué)院等八院校. 食品分析M. 北京 :中國輕工業(yè)出版社 ,1994.史軍 ,王金水 ,蔡鳳英 ,等. 花生蛋白酶解條件及活性肽抗氧化特性研究J . 河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報 :自然科學(xué)版 ,2006 ,27 (6) :29 - 33.凌關(guān)庭. 抗氧化食品與健康M. 北京 :化學(xué)工業(yè)出版社 ,2004.吳建中. 大豆蛋白的酶法水解及產(chǎn)物抗氧化活性的研究D . 廣州 :華南理工大學(xué) ,2003.A B C D35. 333. 750. 131. 061. 152. 575. 038. 55673結(jié)論(1) 采用木瓜蛋白酶酶水解核桃蛋

27、白 ,其即水解的最優(yōu)條8件是溫度 55 ,底物濃度 5 % ,酶濃度 60 000 U/ g ,pH 值 8. 0 。(2) 在一定的水解度范圍內(nèi) ,核桃蛋白酶水解物的水解 度越大 ,其對羥自由基 (OH·) 和超氧陰離子自由基(O2 ·) 的清 除能力也越強 ,說明其抗氧化活性也越大 。(3) 對水解度為 38. 4 %的酶水解物采用 Sephdex G - 25凝膠柱層析進行分離后得到了分子量不同的 A 、B 、C 和 D 4 個肽片段 ,其中肽片段 C 的自由基清除能力最大 ,肽片段 D 最小 。參考文獻1 RAJAPAKSE N ,MENDIS E ,BYUN H

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30、ptides from soybean 2conglycinin J . Journal of Agricultural and FoodChemistry ,1995 ,43 :574 - 578.(上接第 6130 頁)2. 3. 5 地震 。地震對填埋場的影響極大 ,填埋場一般不選 在地震活動帶上 。當(dāng)?shù)卣鹆叶冗_到 6 度時疏松的土質(zhì)就可 能出現(xiàn)小裂縫 。所以當(dāng)?shù)卣鹆叶冉咏?6 度時 , 就要對場地 的抗震性做出評價 。原則上場址不能選在歷史上最大地震 烈度超過度的地方 。3 環(huán)境地質(zhì)勘察 3質(zhì)分析 。地下水的流向一般用三點法或人工放射性同位素單井法測定 。地下水的流速一般用示蹤劑法或水

31、力梯度法 求得 ,必要時兩者可結(jié)合使用 。為求得土層的滲透系數(shù) ( k 值) , 尚應(yīng)進行簡易抽水試 驗 , 在鉆孔內(nèi)一般以小流量 、小降深的抽水試驗為宜 。根據(jù) 試驗所得的涌水量 ( Q) 、水位降深 ( S ) 、水位恢復(fù)速度 ( V ) 等參數(shù)進行計算 , 求得水平滲透系數(shù) 。再結(jié)合室內(nèi)土工試驗所得 k 值 , 確定合理的滲透系數(shù) 。有條件的地區(qū)可以進行 民井抽水試驗 , 結(jié)果相對精確些 。地下水的水質(zhì)分析應(yīng)進行全分析 。根據(jù)需要選擇有代 表性的鉆孔取樣 ,一般取 2 0003 000 ml 。取樣時應(yīng)嚴(yán)格按 操作規(guī)程進行 ,并及時送化驗室分析 。試驗時需特別注意氰化 物 ( CN - ) 、酚 ( C6 H5OH) 、鎘