實驗一糖類的顏色反應

1、第十六章 實驗技術實驗一 糖類的顏色反應一、實驗目的1了解糖類某些顏色反應的原理。2學習應用糖的顏色反應鑒別糖類的方法。二、實驗原理1.-萘酚反應（Molisch反應）原理糖在濃無機酸（硫酸、鹽酸）作用下，脫水生成糠醛及糠醛衍生物，后者能與-萘酚生成紫紅色物質。因為糠醛及糠醛衍生物對此反應均呈陽性，故此反應不是糖類的特異反應。2.間苯二酚反應（Seliwanoff反應）原理在酸作用下，酮糖脫水生成羥甲基糠醛，后者再與間苯二酚作用生成紅色物質。此反應是酮糖的特異反應。醛糖在同樣條件下呈色反應緩慢，只有在糖濃度較高或煮沸時間較長時，才呈微弱的陽性反應。在實驗條件下蔗糖有可能水解而呈陽性反應。三、器

2、材1.試管及試管架 2.滴管3.水浴鍋四、試劑1.莫氏（Molisch）試劑： 5% -萘酚的酒精溶液，稱取-萘酚5g，溶于95%酒精中，并用此酒精使總體積達100mL，貯于棕色瓶內。此試劑需新鮮配制。2.塞氏（Seliwanoff）試劑：稱取間苯二酚0.05g溶于30 mL濃鹽酸中，再用蒸餾水稀釋至100 mL，此試劑需新鮮配制。3.1%葡萄糖溶液：稱取葡萄糖1g，溶于100mL蒸餾水中。4.1%果糖溶液：稱取果糖1g，溶于100mL蒸餾水中。5.1%蔗糖溶液：稱取蔗糖1g，溶于100mL蒸餾水中。6.1%淀粉溶液：稱取可溶性淀粉1g與少量冷蒸餾水混合成薄漿狀物，然后緩緩傾入沸蒸餾水中，邊加

3、邊攪，最后以沸蒸餾水稀釋至100mL。7.0.1%糠醛溶液：稱取糠醛0.1g，溶于100mL蒸餾水中。8.濃硫酸 500mL五、操作1.-萘酚反應（Molisch反應）取5支試管，分別加入1%葡萄糖溶液、1%果糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液、0.1%糠醛溶液各1.5mL。再向5支試管中各加入2滴莫氏試劑，充分混合。斜執(zhí)試管，沿管壁慢慢加入濃硫酸約2 / 311mL，慢慢立起試管，切勿搖動。濃硫酸在試液下形成兩層。在二液分界處有紫紅色環(huán)出現(xiàn)。觀察、記錄各管顏色。試劑現(xiàn)象解釋現(xiàn)象1%葡萄糖溶液1%果糖溶液1%蔗糖溶液1%淀粉溶液0.1%糠醛溶液2.間苯二酚反應（Seliwanoff反應）取3支

4、試管，分別加入1%葡萄糖溶液、1%果糖溶液、1%蔗糖溶液各5mL。再向各管分別加入塞氏試劑2mL，混勻。將3支試管同時放入沸水浴中，注意觀察、記錄各管顏色的變化及變化時間。六、思考題1可用何種顏色反應鑒別酮糖的存在？2-萘酚反應的原理是什么？實驗二 糖類的還原作用一、實驗目的學習幾種常用的鑒定糖類還原性的方法及其原理。二、實驗原理許多糖類由于其分子中含有自由的或潛在的醛基或酮基，故在堿性溶液中能將銅、鉍、汞、鐵、銀等金屬離子還原，同時糖類本身被氧化成糖酸及其他產物。糖類這種性質常被利用于檢測糖的還原性及還原糖的定量測定。本實驗進行糖類的還原作用所用的試劑為斐林試劑和本尼迪克特試劑。它們都是含C

5、u2+的堿性溶液，能使還原糖氧化而本身被還原成紅色或黃色的Cu2O沉淀。生成Cu2O沉淀的顏色之所以不同是由于在不同條件下產生的沉淀顆粒大小不同引起的，顆粒越小呈黃色，越大則呈紅色。如有保護性膠體存在時，常生成黃色沉淀。三、器材1試管及試管架2竹試管夾3水浴鍋4電爐四、試劑1斐林（Fehling）試劑菲林甲液（硫酸酮溶液）：稱取34.5g硫酸銅（CuSO4·5H2O）溶于500mL蒸餾水中。菲林乙液（堿性酒石酸鹽溶液）：稱取125g氫氧化鈉和137g灑石酸鉀鈉溶于500 mL蒸餾水中。為了避免變質，甲、乙二液分開保存。用前，將甲、乙二液等量混合即可。2本尼迪克特（Benedict）試

6、劑稱取檸檬酸鈉173g及碳酸鈉（Na2CO3·H2O）100 g加入600mL蒸餾水中，加熱使其溶解，冷卻，稀釋至850mL。另稱取17.3g硫酸銅溶解于100 mL熱蒸餾水中，冷卻，稀釋至150mL。最后，將硫酸銅溶液徐徐地加入檸檬酸鈉-碳酸鈉溶液中，邊加邊攪拌，混勻，如有沉淀，過濾后貯于試劑瓶中可長期使用。31%葡萄糖溶液：稱取葡萄糖1g，溶于100mL蒸餾水中。41%果糖溶液：稱取果糖1g，溶于100mL蒸餾水中。51%蔗糖溶液：稱取蔗糖1g，溶于100mL蒸餾水中。61%麥芽糖溶液：稱取麥芽糖1g，溶于100mL蒸餾水中。71%淀粉溶液：稱取可溶性淀粉1g與少量冷蒸餾水混合成

7、薄漿狀物，然后緩緩傾入沸蒸餾水中，邊加邊攪，最后以沸蒸餾水稀釋至100mL。五、操作先取1支試管加入斐林試劑約 1mL，再加入4 mL蒸餾水，加熱煮沸，如有沉淀生成，說明此試劑已不能使用。經檢驗，試劑合格后，再進行下述實驗。取5支試管，分別加入菲林甲、乙液各1 mL，再向各試管分別加入1葡萄糖溶液、1果糖溶液、1蔗糖溶液、1麥芽糖溶液、1淀粉溶液各1mL。置沸水浴中加熱數(shù)分鐘，取出，冷卻。觀察各管溶液的變化。另取6支試管，用本尼迪克特試劑（每管加2mL）重復上述實驗。比較兩種方法的結果。斐林氏與本尼迪克特試法：溶液現(xiàn)象試劑1%葡萄糖溶液1%果糖溶液1%蔗糖溶液1%麥芽糖溶液1%淀粉溶液斐林氏試

8、劑本尼迪克試劑試解釋以上表格現(xiàn)象：六、思考題1斐林氏、本尼迪克特試劑法檢驗糖的原理是什么？2你熟悉的糖中那些具有還原性？實驗三 蛋白質的顏色反應一、實驗目的熟悉一些常見蛋白質的顏色反應二、實驗原理蛋白質分子中的某些基團與顯色劑作用，可產生特定的顏色反應，不同蛋白質所含氨基酸不完全相同，顏色反應亦不同。顏色反應不是蛋白質的專一反應，一些非蛋白物質亦可產生相同顏色反應，因此不能僅根據(jù)顏色反應的結果決定被測物是否是蛋白質。顏色反應是一些常用的蛋白質定量測定的依據(jù)。重要的顏色反應有：1.雙縮脲反應將尿素加熱到180，則兩分子尿素縮合而成一分子雙縮脲，并放出一分子氨。雙縮脲在堿性溶液中能與硫酸銅反應產生

9、紅紫色絡合物，此反應稱雙縮脲反應。蛋白質分子中含有許多和雙縮脲結構相似的肽鍵，因此也能起雙縮脲反應，形成紅紫色絡合物。通?？捎么朔磻獊矶ㄐ澡b定蛋白質，也可根據(jù)反應產生的顏色在540nm 處比色，定量測定蛋白質。2.蛋白質的黃色反應黃色反應是含有芳香族氨基酸特別是含有酪氨酸和色氨酸的蛋白質所特有的呈色反應。蛋白質溶液遇硝酸后，先產生白色沉淀，加熱則白色沉淀變成黃色，再加堿顏色加深呈橙黃色，這是因為硝酸將蛋白質分子中的苯環(huán)硝化，產生了黃色硝基苯衍生物。例如皮膚、指甲和毛發(fā)等遇濃硝酸會變成黃色。3.米倫氏反應米倫試劑為硝酸汞、亞硝酸汞、硝酸和亞硝酸的混合物，蛋白質溶液加入米倫試劑后即產生白色沉淀，加

10、熱后沉淀變成紅色。酚類化合物有此反應，酪氨酸含有酚基，故酪氨酸及含有酪氨酸的蛋白質都有此反應。4.茚三酮反應蛋白質與茚三酮共熱，則產生藍紫色的還原茚三酮、茚三酮和氨的縮合物。此反應為一切氨基酸及-氨基酸所共有。含有氨基的其他物質亦呈此反應三、器材試管和試管架、滴管、水浴鍋、酒精燈或電爐、量筒、濾紙片、烘箱、白明膠。四、試劑1. 卵清蛋白液：將雞(鴨)蛋白用蒸餾水稀釋2040倍，23層紗布過濾，濾液冷藏備用。2. 0.5%苯酚溶液：苯酚0.5mL，加蒸餾水稀釋至100mL。3. 1%白明膠液：1g 白明膠溶于少量熱水，完全溶解后，稀釋至100mL。4. 米倫(Millon)試劑：40g 汞溶于6

11、0mL 濃硝酸(比重1.42)，水浴加溫助溶，溶解后加2倍體積蒸餾水，混勻，靜置澄清，取上清液備用。此試劑可長期保存。5. 0.1%茚三酮溶液：0.1g 茚三酮溶于95%乙醇并稀釋至100mL。6.濃硝酸：比重1.42。7. 1%硫酸銅溶液：硫酸銅1g溶于蒸餾水中，稀釋至100mL。8. 尿素：如顆粒較粗，最好研磨成粉末狀。9. 10%氫氧化鈉溶液：氫氧化難10g溶于蒸餾水，稀釋至100mL。五、操作方法1.雙縮脲反應取少許結晶尿素放在干燥試管中，微火加熱，尿素溶化并形成雙縮脲，釋出的氨可用紅色石蕊試紙試之。至試管內有白色固體出現(xiàn)，停止加熱，冷卻。然后加10%NaOH 溶液1mL 混勻，觀察有

12、無紫色出現(xiàn)。另取一試管，加蛋白質溶液10滴，再加10% NaOH 溶液10滴及1%CuSO4溶液4滴，混勻，觀察是否出現(xiàn)紫玫瑰色。注意事項：硫酸銅不能多加，否則將產生藍色的Cu(OH)2。此外在堿溶液中氨或銨鹽與銅鹽作用生成深藍色的絡離子Cu(NH3)42+，妨礙此顏色反應的觀察。2.蛋白質的黃色反應在一試管內，加蛋白質溶液10滴及濃硝酸34滴，加熱，冷卻后再加10%NaOH 溶液5滴，觀察顏色反應。3.米倫氏反應 用苯酚做實驗：取0.5%苯酚溶液1mL 于試管中，加米倫試劑約0.5mL(米倫試劑含有硝酸，如加入量過多，能使蛋白質呈黃色，加入量不超過試液體積的1/51/4)，小心加熱，溶液即出

13、現(xiàn)玫瑰紅色。 用蛋白質溶液做實驗：取2mL 蛋白質溶液，加0.5mL 米倫試劑，此時出現(xiàn)蛋白質的沉淀(因試劑含汞鹽及硝酸之故)，小心加熱，凝固之蛋白質出現(xiàn)紅色。注意事項：蛋白質溶液中如含有大量無機鹽，可與汞產生沉淀從而喪失試劑的作用，如此試劑不能測定尿中的蛋白質。另外試液中還不能含有H2O2、醇或堿，因它們能使試劑中的汞變成氧化汞沉淀。遇堿必須先中和，但不能用鹽酸中和。4.茚三酮反應取1mL 蛋白質溶液置于試管中，加2滴茚三酮試劑，加熱至沸，即有藍紫色出現(xiàn)(注意：此反應必須在pH57進行)。六、思考題1. 氨基酸與蛋白質具有哪些共同的顏色反應？說明原因。2. 蛋白質除了可以實驗中的這些顏色反應

14、外，你還知道哪些蛋白質的顏色反應？實驗四 蛋白質的沉淀反應一、實驗目的加深對蛋白質的沉淀反應的認識，理解蛋白質沉淀反應的原理。二、實驗原理蛋白質的水溶液是一種比較穩(wěn)定的親水膠體，這是因為蛋白質顆粒表面帶有很多極性基團，如NH3+，COO-，SH，CONH2等，和水有高度親和性，當?shù)鞍踪|與水相遇時，就很容易被蛋白質吸住，在蛋白質顆粒外面形成一層水膜(又稱水化層)。水膜的存在使蛋白顆粒相互隔開，顆粒之間不會碰撞而聚成大顆粒。因此蛋白質在溶液中比較穩(wěn)定而不會沉淀。蛋白質能形成較穩(wěn)定的親水膠體的另一個原因，是因為蛋白質顆粒在非等電狀態(tài)時帶有相同電荷，使蛋白質顆粒之間相互排斥，保持一定距離，不致相互凝集

15、沉淀。蛋白質由于帶有電荷和水膜，因此在水溶液中形成穩(wěn)定的膠體。當某些物理化學因素破壞了蛋白質的水膜或中和了蛋白質的電荷，則蛋白質膠體溶液就不穩(wěn)定而出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象。 蛋白質可因加入下列試劑而產生沉淀：1. 加鹽類如硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等可以破壞蛋白質膠體周圍的水膜，同時又中和了蛋白質分子的電荷，因此使蛋白質產生沉淀，這種加鹽使蛋白質沉淀析出的現(xiàn)象稱鹽析。鹽析法是分離制備蛋白質的常用方法，不同蛋白質鹽析時所需的鹽濃度不同，因此調節(jié)鹽濃度，可使混合蛋白質溶液中的幾種蛋白質分段析出，這種方法叫做分段鹽析。但中性鹽并不破壞蛋白質的分子結構和性質，因此，若除去或降低鹽的濃度，蛋白質就會重新溶解。2.加有機

16、溶劑如酒精、丙酮等可使蛋白質產生沉淀，這是由于這些有機溶劑和水有較強的作用，破壞了蛋白質分子周圍的水膜，因此發(fā)生沉淀作用。若及時將蛋白質沉淀與丙酮或乙醇分離，蛋白質沉淀則可重新溶解于水中。3.重金屬鹽如氯化汞、硝酸銀、醋酸鉛及三氯化鐵等。這是因為蛋白質在堿性溶液中帶負離子，可與這些重金屬的正離子作用而生成不易溶解的鹽而沉淀。4.某些酸類如苦味酸、單寧酸、三氯乙酸等能和蛋白質化合成不溶解的蛋白質鹽而沉淀。用鹽析法或低溫下加入丙酮、乙醇使蛋白質沉淀，以及利用等電點的沉淀反應時，雖然蛋白質已經沉淀析出，然而其分子內部結構并沒發(fā)生明顯的改變，仍保持原有的生物活性。如除去沉淀因素，蛋白質可重新溶解在原來

17、的溶劑中。因此，這種沉淀作用稱為可逆沉淀作用。但如在溫度較高情況下加入有機溶劑來沉淀分離蛋白質或已用有機溶劑沉淀分離得到的蛋白質沒有及時與有機溶劑分開，都會引起蛋白質的性質發(fā)生改變，這應該注意。三、器材試管及試管架、吸管、抽濾瓶、量筒、布氏漏斗。四、試劑1. 蛋白質氯化鈉溶液取20mL 蛋清，加蒸餾水200mL 和飽和氯化鈉溶液100mL，充分攪勻后紗布濾去不溶物(加氯化鈉的目的是溶解球蛋白)。2. 蛋白質溶液 取5mL 蛋清，用蒸餾水稀釋至100mL，攪拌均勻后，用紗布過濾。3. 飽和硫酸銨溶液：稱硫酸銨850g 加于1000mL 蒸餾水中，在7080下攪拌促溶，室溫中放置過夜，瓶底析出白色

18、結晶，上清液即為飽和硫酸銨溶液。4. 飽和苦味酸溶液：取2g 苦味酸放入三角燒瓶，加蒸餾水100mL，80水浴約10min 使之完全溶解，于室溫下冷卻后瓶底析出黃色結晶，上清液即為飽和苦味酸，此液可存放數(shù)年。5. 1%醋酸溶液、1%醋酸鉛溶液、1%硫酸銅溶液、1%三氯乙酸溶液。6. 0.5%磺基水楊酸溶液。7. 5%鞣酸溶液。8. 硫酸銨粉末。五、操作1.鹽析作用：取1支試管加入3mL 蛋白質氯化鈉溶液和3mL 飽和硫酸銨溶液，混勻，靜置約10min，球蛋白則沉淀析出。過濾后向濾液中加入硫酸銨粉末，邊加邊用玻璃棒攪拌，直至粉末不再溶解達到飽和為止，析出的沉淀為清蛋白，再加水稀釋，觀察沉淀是否溶

19、解。2.乙醇沉淀蛋白質：取1支試管架蛋白質溶液1mL，加晶體氯化鈉少許(加速沉淀并使沉淀完全)待溶解后再加入95%乙醇2mL 混勻。觀察有無沉淀析出。3.有機酸沉淀蛋白質：取2支試管，各加入蛋白質溶液約0.5mL，然后分別滴加10%三氯乙酸和0.5%磺基水楊酸數(shù)滴。觀察蛋白質沉淀。4.重金屬鹽沉淀蛋白質?。?支試管各加蛋白質溶液2mL，一管內滴加1%醋酸鉛溶液，另一管內滴加1%硫酸銅溶液，觀察沉淀生成。5.生物堿試劑沉淀蛋白質?。?支試管，各加蛋白溶液2mL 及1%醋酸45滴。其中一管滴加5%鞣酸，另一管滴加飽和的苦味酸溶液，觀察沉淀的形成。六、思考題1.蛋白質的中性鹽沉淀和重金屬沉淀有何差別

20、？各有什么用途？ 2.為什么雞蛋清可作為鉛或汞中毒的解毒劑？實驗五 蛋白質等電點測定一、實驗目的掌握蛋白質等電點的測定方法及其原理。了解等電點的意義及其與分子聚沉能力的關系。二、實驗原理蛋白質同氨基酸一樣，是兩性電解質，在不同的pH 水溶液中解離后所帶正、負電荷不同。調節(jié)溶液的酸堿度達到一定的氫離子濃度時，蛋白質分子所帶的正電荷和負電荷相等，以兼性離子狀態(tài)出現(xiàn)，在電場內該蛋白質分子既不向陰極移動，也不向陽極移動，這時溶液的pH 值稱為該蛋白質的等電點(pI)。各種蛋白質具有特定的等電點，這時和它所含的氨基酸的種類和數(shù)量有關。如蛋白質分子中含堿性氨基酸較多，其等電點偏堿。例如從雄性魚類成熟精子中

21、提取的魚精蛋白含精氨酸特多，其等電點為12.012.4。如蛋白質分子中含酸性氨基酸較多，則其等電點偏酸。例如胃蛋白酶含酸性氨基酸殘基為37個，而堿性氨基酸殘基僅含6個，其等電點為1.0左右。含酸性和堿性氨基酸殘基數(shù)目相近的蛋白質，其等電點大多為中性偏酸，約5.0左右。蛋白質等電點多接近于pH7.0，略偏酸性的等電點也較多。處于等電點的蛋白質表現(xiàn)電中性，所以在溶液中的穩(wěn)定性很低，容易沉淀析出。將酪蛋白溶液分置于連續(xù)不同的pH 環(huán)境中，通過觀察混濁程度可測得酪蛋白的等電點。三、器材試管和試管架、滴管、吸管(1和5mL)、容量瓶。四、試劑1. 酪蛋白醋酸鈉溶液：稱取純酪蛋白0.25g，加蒸餾水20m

22、L 及1.00mol/L 氫氧化鈉溶液5mL(必須準確)。搖蕩使酪蛋白溶解。然后加1.00mol/L 醋酸5mL(必須準確)，倒入50mL 容量瓶內，用蒸餾水稀釋至刻度，混勻，結果酪蛋白溶于0.10mol/L 醋酸鈉溶液內，其濃度為0.5%。2. 0.01mol/L 醋酸溶液3. 1.00mol/L 醋酸溶液4. 0.10mol/L 醋酸溶液5. 1.00mol/L 氫氧化鈉溶液（氫氧化鈉和醋酸的濃度要標定）五、操作1.取9支粗細相近的干燥試管，編好號后按表5-1的順序準確地加入各種試劑。2.加完后觀察上述各管的混濁程度，靜置約20min，再視其沉淀情況，以-，+，+，+，+符號表示沉淀的多少

23、。根據(jù)觀察的結果，指出哪一個pH 是酪蛋白的等電點(混濁顯著或靜置后沉淀最多，上部溶液變得最清亮一管的pH 值，即為酪蛋白的等電點)。3. 該試管要求各種試劑的濃度和加入量必須相當準確。除了需要精心配制試劑以外，實驗中應該嚴格按照定量分析的操作進行。為了保證實驗的重復性或為了進行大批 量的測定，可以事先按照上述的比例配制成大量的9種不同濃度的醋酸溶液。實驗時分別準確吸取4mL該溶液，再各加入1mL酪蛋白醋酸鈉溶液。表5-1 試劑加入及數(shù)據(jù)記錄表管號酪蛋白醋酸鈉溶液（毫升）水（毫升）0.01mol/L醋酸（毫升）0.10mol/L醋酸（毫升）1.00mol/L醋酸（毫升）pH觀察沉淀出現(xiàn)情況0分

24、鐘10分鐘20分鐘118.380.625.9217.751.255.6318.750.255.3418.500.505.0518.001.004.7617.002.004.4715.004.004.1811.008.003.8917.401.603.5六、思考題1.該方法測定蛋白質等電點的原理是什么？2.蛋白質等電點在實際生產上有何意義？實驗六 酪蛋白的制備等電點沉淀法一、實驗目的1、了解等電點沉淀法2、學習從牛奶中制備酪蛋白的方法3、加深對蛋白質等電點性質的理解二、實驗原理蛋白質是一種親水膠體，在水溶液中蛋白質分子表面形成一個水化層。另外，蛋白質又是一種兩性離子，在一定pH溶液能夠維持一個穩(wěn)

25、定的狀態(tài)。但是調節(jié)蛋白質溶液的pH值至等電點時，蛋白質會因失去電荷而變得不穩(wěn)定，此時若再加脫水劑或加熱，水化層被破壞，蛋白質分子就相互凝聚而析出。等電點沉淀法主要利用兩性電解質分子在等電點時溶解度最低的原理，而多種兩性電解質具有不同等電點而進行分離的一種方法。牛乳中主要的蛋白質是酪蛋白含量約為35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白質的混合物，等電點為4.7。將牛乳的pH調至4.7時，酪蛋白就沉淀出來。用乙醇洗滌沉淀，除去脂類雜質后便可得到較純的酪蛋白。但單獨利用等電點沉淀法來分離生化產品效果并不太理想，因為即使在等電點時，有些兩性物質仍有一定的溶解度，并不是所有的蛋白質在等電點時都能沉淀下來，特別是

26、同一類兩性物質的等電點十分接近時。生產中常與有機溶劑沉淀法、鹽析法并用，這樣沉淀的效果較好。三、器材離心機、抽濾裝置（布氏漏斗）、電爐、溫度計、天平、表面皿、燒杯、容量瓶、移液管、酸度計。四、試劑（1）鮮牛奶；（2）0.5mol/L HCl；（3）0.5 mol/L NaOH；（4）95乙醇；（5）無水之醚；（6）0.2mol/LpH4.7醋酸醋酸鈉緩沖液，先配制A液與B液。（A液：0.2 mol/L醋酸鈉溶液：稱NaAC·3H2O  54.44g，定容至2 000 mL。B液：0.2 mol/L醋酸溶液。稱取優(yōu)級純醋酸（含量大于99.8）12g定容至1 000 mL。取A

27、液1 770 mL，B液1 230mL混合即得pH4.7的醋酸鈉醋酸緩沖液3 000 mL。）；（7）乙醇乙醚混合液。乙醇：乙醚1：1（VV）。五、操作1.將50mL牛奶加熱到40。在攪拌下慢慢加入預熱到40的pH4.7的醋酸緩沖液50mL。用精密pH試紙或酸度計調pH至4.7。將上述懸浮液冷至室溫。離心15 min(2000 r/min)，棄去清液，得酪蛋白粗制品。2.用水洗沉淀，離心10 min(3000 r/min)，棄去上清液；如此操作三次。3.在沉淀中加入30mL乙醇。攪拌片刻，將全部懸濁液轉移至布氏漏斗中抽濾。用乙醇乙醚混合液洗沉淀兩次。最后用乙醚洗沉淀兩次，抽干。4.將沉淀攤開在

28、表面皿上，風干得酪蛋白純品。5.準確稱重，計算含量和得率。含量：酪蛋白g/100mL牛乳。式中理論含量為3.5g/100mL牛乳。六、思考題1.為什么調整溶液的pH值可將酪蛋白沉淀出來？2.你還可以采用哪些其他的方法來制備酪蛋白？3.制備高產率純酪蛋白的關鍵是什么？實驗七 氨基酸的紙層析一、實驗目的1.了解并掌握氨基酸紙層析的原理和方法。2.學習紙層析法的操作技術，分析未知樣品氨基酸的成分。二、實驗原理用濾紙為支持物進行層析的方法，稱為紙層析法，它是分配層析法的一種。紙層析所用的展層溶劑大多是由水飽和的有機溶劑組成。濾紙纖維的OH 基的親水性基團，可吸附有機溶劑中的水作為固定相，有機溶劑作為流

29、動相，它沿濾紙自下向上移動，稱為上行層析；反之，使有機溶劑自上而下移動，稱為下行層析。將樣品點在濾紙上進行展層，樣品中的各種氨基酸即在二相中不斷進行分配，由于它們各自的分配系數(shù)不同，故在流動相中移動速率不等，從而使不同的氨基酸得到分離和提純。紙層析法主要是依據(jù)混合組分對二相分配系數(shù)的差異進行分離，但亦存在著某種程度的吸附作用和離子交換現(xiàn)象。氨基酸經層析在濾紙上形成距原點不等的層析點，氨基酸在濾紙上的移動速率用Rf 表示。Rf = 原點到層析斑點中心的距離/原點到溶劑前沿的距離只要實驗條件(如溫度、展層溶劑的組分、pH、濾紙的質量等)不變，Rf 值是常數(shù)，因此可做定性分析參考。Rf值的大小與物質

30、的結構、性質、溶劑系統(tǒng)、層析濾紙的質量和層析溫度等因素有關。本實驗利用紙層析法分離氨基酸。由于氨基酸無色，可利用茚三酮反應使氨基酸層析點顯色，從而定性和定量。三、器材1層析缸2毛細管3噴霧器4培養(yǎng)皿5層析濾紙（新華一號）6小燒杯（50mL）7鉛筆8直尺四、試劑1.展層劑：正丁醇80%甲酸水 = 1532(V/V)，搖勻后放置半天以上，取上清液備用。2.氨基酸溶液（用0.01mol/L的鹽酸配制）：0.5的賴氨酸、脯氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它們的混合液（各組份濃度均為0.5）。3.顯色劑：0.1%水合茚三銅正丁醇容液。五、操作1將盛有平衡溶劑的小燒杯置于密閉的層析缸中。2取層析濾紙（

31、長22cm、寬15cm）一張。在紙的一端距邊緣23cm處用鉛筆劃一條直線，在此直線上每間隔2cm作一記號如下圖。3點樣 用毛細管將各氨基酸樣品分別點在這6個位置上，干后再點一次。每點在紙上擴散的直徑最大不超過3mm。4擴展 用線將濾紙縫成筒狀，紙的兩邊不能接觸。將盛有約20 mL擴展劑的培養(yǎng)皿迅速置于密閉的層析缸中，并將濾紙直立于培養(yǎng)皿中（點樣的一端在下，擴展劑的液面需低于點樣線1cm）。待溶劑上升 1520 cm時即取出濾紙，用鉛筆描出溶劑前沿界線，自然干燥或用吹風機熱風吹干。5顯色 用噴霧器均勻噴上0.1茚三酮正丁醇溶液，然后置80烘箱中烘烤35分鐘或用熱風吹干即可顯出各層析斑點。6計算各

32、種氨基酸的Rf值。六、思考題1何謂紙層析法？2何謂Rf值？影響Rf值的主要因素是什么？3怎樣制備展層劑？4層析缸中平衡溶劑的作用是什么？實驗八 電泳技術紙電泳分離氨基酸一、實驗目的1.了解電泳技術的基本原理；2.掌握紙上電泳的原理和操作技術。二、實驗原理帶電顆粒在電場的作用下，向著與其電性相反的電極移動，稱為電泳（electrophoresis）。電泳現(xiàn)象早在1808年就被發(fā)現(xiàn)，但是作為一項生物化學研究的方法學，卻是在1937年Tiselius在電泳儀器方面取得重大成就后，才得到較大的進展。特別是后來應用濾紙作為支持物，形成了設備簡單，操作方便的紙上電泳法后，電泳技術在生物化學和其他領域研究中

33、得到了廣泛的應用和發(fā)展。近年來，由于采用多種新型支持物，儀器裝置亦得到不斷改進，因此出現(xiàn)了許多新型的電泳技術。目前所采用的電泳方法，大致可分為三類：顯微電泳，自由界面電泳和區(qū)帶電泳。區(qū)帶電泳應用比較廣泛，按其支持物物理性狀的不同可分成4大類：1.濾紙及其他纖維（如玻璃纖維、醋酸纖維、聚氯乙烯纖維）薄膜電泳。2.凝膠電泳：如瓊脂、聚丙烯酰胺凝膠、淀粉凝膠電泳。3.粉末電泳：如纖維素粉、淀粉、玻璃分電泳。4.線絲電泳：如尼龍絲，人造絲電泳。此為微量電泳方法。區(qū)帶電泳現(xiàn)已廣泛應用于生物化學物質的分析分離以及臨床檢驗等方面。現(xiàn)以紙上電泳為例介紹有關電泳的原理和操作技術。任一物質質點，由于其本身的解離作

34、用或由于表面上吸附有其他帶電質點，在電場中便會向一定的電極移動。例如氨基酸、蛋白質分子等，由于它具有許多可解離的酸性基團和堿性基團，如-COO和-NH3+等，它是一典型的兩性電解質，在一定的pH條件下，就會解離而帶電，帶電的性質和多少決定于蛋白質分子的性質及溶液的pH值和離子強度。在某一pH條件下，蛋白質分子所帶的正電荷數(shù)恰好等于負電荷數(shù)，即凈電荷等于零。此時蛋白質質點在電場中不移動，溶液的這pH值，稱為該蛋白質的等電點(pI)。如果溶液的pH小于pI，則蛋白質分子結合一部分H，而帶正電荷，在電場中就會向負極移動。反之，溶液的pH大于pI，則蛋白質分子會解離出部分H而帶有負電，此時蛋白質分子在

35、電場中就會向正極移動。不同的帶電顆粒在同電場中泳動速度不同，常用遷移率(或稱泳動度，mobility)來表示。遷移率的定義是帶電顆粒在單位電場強度下的泳動速度。式中：m為遷移率(cm2/V·s)；v為顆粒的泳動速度(cm/s)；E為電場強度(V/cm)；d為顆粒泳動的距離(cm)；l為濾紙的有效長度(cm)，即濾紙與兩極溶液交界面間的距離；V為實際電壓(V)；t為通電時間秒(s)。通過測量d，l，v，t便可計算出顆粒的遷移率。帶電顆粒在電場中的泳動速度與本身所帶凈電荷的量，顆粒的大小和形狀有關。一般說，所帶凈電荷量愈多，顆粒愈小，愈接近球形，則在電場中的泳動速度愈快，反之則愈慢。泳動

36、速度除受顆粒本身性質的影響外，還和其他外界因素有關?，F(xiàn)將影響顆粒泳動速度的外界因素討論如下：1、電場強度：電場強度是指每lcm的電位降，也稱電位梯度(電勢梯度)。電場強度對泳動速度起著決定性作用。電場強度愈高，則帶電顆粒泳動愈快。例如進行紙上電泳時，濾紙兩端相距20cm處測得電位降為200V，則電場強度為200/2010V/cm。紙上電泳根據(jù)電場強度的大小可分為常壓(100500V)紙上電泳和高壓(2 00010 000V)紙上電泳，前者電場強度一般為210V/cm，分離時間較長，從數(shù)小時到數(shù)天。后者電場強度為50200V/cm，電泳時間很短；有時僅需數(shù)分鐘。常壓紙上電泳多用于分離蛋白質等大分

37、子物質，高壓紙上電泳則多用來分離氨基酸，多肽、核苷酸、糖類等小分子物質。2、溶液的pH值；溶液的pH值決定帶電顆粒解離的程度，亦即決定其所帶凈電荷的多少。對蛋白質兩性電解質而言，pH值離等電點越遠，則顆粒所帶凈電荷越多，泳動速度也越快，反之，則越慢。因此當分離某一蛋白質混合物時，應選擇一個合適的pH，使各種蛋白質所帶的電荷量差異較大，有利于彼此分開。為了使電泳過程中溶液pH值恒定，必須采用緩沖溶液。3、溶液的離子強度：離子強度影響顆粒的電動電勢()，溶液的離子強度越高，電動電勢越小，則泳動速度越慢；反之，則越快。一般最適的離子強度在0.020.2之間。溶液離子強度的計算方法如下：式中：I為溶液

38、的離子強度；C為離子的摩爾濃度；Z為離子的價數(shù)。4、電滲：在電場中，由于多孔支持物吸附水中的正或負離子使溶液相對帶電，在電場作用下，溶液就向一定方向移動，稱為電滲現(xiàn)象。在紙上電泳中，由于紙上吸附OH-離子帶負電荷，而與紙相接觸的水溶液帶正電荷，液體便向負極移動，移動時可攜帶顆粒同時移動。所以電泳時顆粒泳動的表面速度是顆粒本身的泳動速度與由于電滲影響而被攜帶的移動速度兩者的加和。若是顆粒原來向負極移動，則其表觀速度將比泳動速度快，若原來向正極移動，則其表觀速度將比泳動速度慢。為了校正這一誤差，可用一中性物質如糊精，蔗糖或葡聚糖等與樣品平行作紙上電泳，然后將其移動距離自實驗結果中除去。5、濾紙的選

39、擇：要求紙質均勻和吸附力小，否則電場強度不均勻，使結果不能重復，并得不到好的圖譜。如果吸附力大，則蛋白質或其他膠體在它們泳動的過程中有一部分被紙所吸附，以致于泳動快的部分其相對含量降低。因此常將濾紙事先處理，以減低濾紙的吸附能力，使達到更好的分離效果。若選用國產新華濾紙，或WhatmanNo.1號濾紙，一般不必再進行預處理。6、其他因素：例如緩沖溶液的粘度。緩沖溶液與帶電顆粒的相互作用以及電泳時溫度的變化等因素，也都影響泳動速度。 本實驗以混合氨基酸為材料，用紙上電泳法分離其中的不同氨基酸。三、器材水平式電泳槽、電泳儀、吹風機、點樣器、噴霧器、鉛筆、杭州新華濾紙或WhatmanNo.1號濾紙四

40、、試劑1、1/15mol/L磷酸鹽緩沖液(離子強度0.08，pH6.0) 配制方法：甲液：1/15mol/L Na2HPO4溶液（Na2HPO4 9.465g；蒸餾水加至1000mL）乙液：l/15mol/L KH2PO4溶液 （KH2PO4 9.07g；蒸餾水加至1000mL） 分裝在棕色瓶內，于4冰箱中保存，用時甲、乙兩液各按19比例混合，即可得所需pH的緩沖液。2、1%丙氨酸、1%谷氨酸、1%賴氨酸標準溶液。吸取上述氨基酸標準溶液各10mL于50mL燒杯中配成混合樣品。      3、顯色液（0.5%茚三酮丙酮溶液）五

41、、操作1、儀器及樣品的準備將電泳槽洗凈，晾干、放平。然后量取約700800mL緩沖液先倒入電泳槽，使兩端液面達到平衡。  2、濾紙的剪裁用刀片將新華濾紙或WhatmanNo.1號濾紙，裁成長21.5cm，寬13.8cm的濾紙條，并按以下規(guī)格用鉛筆作上正負記號。剪裁前要選擇紙質比較均勻的紙，用刀片裁整齊，注意紙邊不能有缺刻或起毛，可先用廢紙條練習，然后再正式裁剪。3、點樣1）原點的位置和形狀：對于一個未知樣品，初次實驗時，應將樣品點在濾紙條的中央，觀察區(qū)帶的兩極泳動情況，即可選擇出點樣位置。樣品可點成長條形，或圓點狀。一般長條形分離效果較好，但樣品很少時，點成圓點，樣品比較集中，便于顯

42、色。但雙向電泳或一向電泳、一向層析結合使用時則必須點成圓點或橢圓點，不能點成長條。2）點樣量：隨濾紙的厚度，原點的寬度，樣品的溶解度，顯色方法的靈敏度，樣品遷移率的差異而有所不同。樣品量過多時拖尾和擴散比較嚴重，不能獲得最有效的分離。樣品量太少時，將無法檢出。 3）點樣方法：可分干點法和濕點法兩種。濕點法：先將濾紙用噴霧器均勻地噴上緩沖液，或將濾紙浸于緩沖液中，浸透后取出，夾在兩普通濾紙中，輕壓，將多余緩沖液吸去。緩沖液與干紙重量比為1.212.51。然后架起濾紙，在紙上用點樣管將樣品畫成長條形。注意畫線要直，且粗細均勻，千萬不可將濾紙畫毛，損傷紙面。以濕點法點樣品時，點的次數(shù)不宜多，因此如果

43、樣品濃度較低時，必須事先濃縮。干點法：將樣品點于紙上，待第一次樣品晾干，再點第二次。畫線必須細直，粗細均勻，直到將所需要的樣品全部點完為止?？捎么碉L機冷風加速干燥，而后小心地用噴霧器將濾紙兩端噴濕，有樣品處空出，讓其緩沖液經擴散而自行濕潤?；驅V紙除樣品部分外浸于緩沖液中，放置片刻，樣品部分靠毛細管作用而濕潤，多余緩沖液用普通濾紙吸去。干點法和濕點法各有利弊，干點法雖然在點樣過程中起濃縮的作用，但點的次數(shù)多時，紙面容易受損，樣品干壞。濕點法雖不宜用作稀的樣品，卻可保持樣品的天然狀態(tài)。點樣前，可用廢濾紙條先以水代替樣品進行練習，當操作熟練后再正式點樣。本次實驗采用干法點樣，在濾紙的中間位置橫著劃

44、一直線，在直線上每隔23cm作一記號“×”，用毛細管分別吸取標準丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸各3uL及混合液10uL，小心點于濾紙上，點樣直徑不能大于0.5cm，每點一次用電風筒吹干，再點第二次，再吹干，直到點完。4、電泳 將濾紙架放入電泳槽中，標有正號的一端應放在正極槽內，負號的一端放在負極槽內。并把濾紙條拉緊，使其成為平面，避免中間下垂。蓋上玻璃蓋，關閉電泳槽中間活塞，檢查好線路。然后打開電源開關，調整電壓到250V左右，并觀察或測量其電流數(shù)值，記下通電時間。為了計算遷移率，要用萬用電表測量濾紙的有效長度兩端的實際電壓，記下讀數(shù)。5、烘干 通電0.5小時后，關閉電源開關，在濾紙與溶液交

45、界處作上記號(以便測量長度l)，然后將濾紙條由濾紙架上取下，分別平插在具有兩排細針的木架上放入105烘箱中烘干15分鐘?；虼蹈?。6、染色浸顯色劑。 7、吹干至出現(xiàn)斑點。8、繪出結果圖，指出各斑點的氨基酸酸堿性質并說明你判斷的依據(jù)。六、思考題1.A pI=9，B pI=11。設計一個最佳電泳分離方案。2.電泳技術可否用于定量分析？實驗九 酶的催化特性一、實驗目的通過本實驗了解酶催化的特異性以及pH、溫度、抑制劑和激活劑對酶活力的影響二、實驗原理酶與一般催化劑最主要的區(qū)別之一是酶具有高度特異（專一）性，即一種酶只能對一種底物或一類底物（此類底物在結構上通常具有相同的化學鍵）起催化作用，對

46、其他底物無催化反應。例如，淀粉酶和蔗糖酶雖然都是催化糖苷鍵的水解，但是淀粉酶只對淀粉起作用，蔗糖酶只水解蔗糖。還原糖產物可用班尼迪克特試劑鑒定。通過比較淀粉酶在不同pH、不同溫度以及有無抑制劑或激活劑時水解淀粉的差異，說明這些環(huán)境因素與酶活性的關系。三、器材恒溫水?。?7，70）、沸水?。?00）、冰?。?），試管18×180共19支，吸管1mL7支、2mL3支、5mL5支，量筒100mL1個，白瓷板，膠頭滴管3支四、試劑2%蔗糖溶液：用分析純蔗糖新鮮配制。1%淀粉溶液：1g淀粉和0.3g NaCl，用5mL蒸餾水懸浮，慢慢倒入60mL煮沸的蒸餾水中，煮沸1min，冷卻至室溫，加水到

47、100mL，冰箱貯存。0.1%淀粉溶液：0.1g淀粉，以5mL水懸浮，慢慢倒入60mL煮沸的蒸餾水中，煮沸1min，冷卻至室溫，加水到100mL，冰箱貯存。班尼迪克特（Benedict）試劑：17.3g 無水硫酸銅，加100mL蒸餾水加熱溶解，冷卻；173g檸檬酸鈉和100g無水碳酸鈉，以600mL蒸餾水加熱溶解，邊加邊攪勻，最后定容至1000mL。如有沉淀可過濾除去，此試劑可長期保存。碘液：2g碘化鉀溶于5mL蒸餾水中，加1g碘，溶解后再加295mL水，混勻貯存于棕色瓶中。磷酸緩沖液：A液：0.2mol/L Na2HPO4稱取28.40g Na2HPO4(或71.64g Na2HPO412H

48、2O)溶于1000mL水中。B液：0.1mol/L 檸檬酸稱取21.01g檸檬酸（C6H8O7H2O）溶于1000mL水中。pH5.0緩沖液：10.30mL A液+9.70mL B液pH7.0緩沖液：16.47mL A液+3.53mL B液pH8.0緩沖液：19.45mL A液+0.55mL B液1% CuSO45H2O溶液。1% NaCl。唾液淀粉酶溶液：先用蒸餾水漱口，再含10mL左右蒸餾水，輕輕漱動，2分鐘后吐出收集在燒杯中，即得清澈的唾液淀粉酶原液，根據(jù)酶活高低稀釋50倍，即為唾液淀粉酶溶液。蔗糖酶溶液：取1g鮮酵母或干酵母放入研缽中，加入少量石英砂和水研磨，加50mL蒸餾水，靜置片刻

49、，過濾即得。五、操作1、酶催化的專一性  取6支干凈試管，按下表操作：操作項目管號1234561%淀粉(mL)1100102%蔗糖(mL)001101唾液淀粉酶原液(mL)101000蔗糖酶溶液(mL)010100蒸餾水(mL)000011酶促水解搖勻，37水浴中保溫10min班尼迪克特試劑(mL)222222反應搖勻，沸水浴中加熱510min現(xiàn)象2、pH對酶活力的影響 取3支試管，按下表操作：操作項目管號123pH5.0磷酸緩沖液(mL)300pH7.0磷酸緩沖液(mL)030pH8.0磷酸緩沖液(mL)0031%淀粉溶液(mL)111預保溫混勻，37水浴中保溫

50、2min唾液淀粉酶溶液(mL)111檢查淀粉水解程度    搖勻，置37水浴中繼續(xù)反應2分鐘，每隔1分鐘從第2號管中取出1滴反應液于白瓷板上，加碘液檢查反應進行情況，直至反應液不再變色，即可停止反應，取出所有試管。碘液(滴)111現(xiàn)象3、溫度對酶活力的影響  取3支試管，按下表操作：操作項目管號123唾液淀粉酶溶液(mL)111pH7.0磷酸緩沖液(mL)222溫度預處理5min（）037701%淀粉溶液(mL)222搖勻，保持各自溫度繼續(xù)反應，5分鐘后每隔1分鐘從第2號管吸取1滴反應液于白瓷板上，用碘液檢查反應進行情況，直至反應液不再變色（只

51、有碘液的顏色），立即取出所有試管，流水冷卻2min，各加1滴碘液，混勻。觀察并記錄各管反應現(xiàn)象，解釋之。4、酶的抑制與激活操作項目管號1231% NaCl(mL)1001% CuSO4(mL)010蒸餾水(mL)001唾液淀粉酶溶液(mL)1110.1%淀粉溶液(mL)333保溫反應并檢查淀粉水解程度    搖勻，37水浴反應1min左右即可用碘液檢查1號試管淀粉水解程度，待1號試管的反應液不再變色時取出所有試管。碘液(滴)111現(xiàn)象注意事項（1）各人唾液中淀粉酶活力不同，因此實驗2、3、4應隨時檢查反應進行情況。如反應進行得太快，應適當稀釋唾液；反之，則應減少唾

52、液淀粉酶稀釋倍數(shù)。（2）酶的抑制與激活最好用經透析的唾液，因為唾液中含有少量Cl。另外，注意不要在檢查反應程度時使各管溶液混雜。六、思考題：1.何謂酶的最適pH和最適溫度？2.說明底物濃度、酶濃度、溫度和pH對酶反應速度的影響。3. 酶作為一種生物催化劑，有哪些催化特點？實驗十 糖化酶活力測定一、實驗目的1、 學習糖化型淀粉酶(或液體曲)酶活力的測定方法。2、 了解糖化型淀粉酶活力大小對工藝生產的指導意義。二、實驗原理糖化型淀粉酶可催化淀粉水解生成葡萄糖。本實驗在一定條件下用一定量的糖化型淀粉酶作用于淀粉，然后用碘量法測定所生成的葡萄糖的含量來計算淀粉酶的活力。碘量法定糖原理：淀粉經糖化酶水解

53、生成葡萄糖，葡萄搪具有還原性，其羰基易被弱氧化劑次碘酸鈉所氧化：體系中加入過量的碘，氧化反應完成后用硫代替硫酸鈉滴定過量的碘，即可推算出酶的活力。I22Na2S2O3 = Na2S4O6 2NaI三、器材儀器吸管(25mL，5mL，2mL，10mL)、定碘瓶(500mL)、 堿式滴定管、燒杯、恒溫水浴鍋、分析天平。原料：待測酶液四、試劑1. 2%可溶性淀粉溶液：準確稱取2克可溶性淀粉(預先于100105烘干至恒重約2小時)，加少量蒸餾水調勻。傾入80mL左右的沸蒸餾水中，繼續(xù)煮沸至透明，冷卻后用水定容至100mL。2. 0.05 mol/L碘液：稱取25克碘化鉀溶于少量水中，加入12.7克碘，

54、溶解后定容至1000mL。3. pH4.5的1mol/L醋酸緩沖液：稱取8.204克無水醋酸鈉，先在少量水中溶解，定容至1000mL。取分析純冰醋酸5.78mL定容至1000mL。以上兩種溶液按醋酸和醋酸鈉的體積比為25：22混合即為所要求之緩沖液。4. 0.1 mol/L氫氧化鈉溶液：稱取分析純氫氧化鈉4克溶解并定容至1000mL。5. 1mol/L硫酸 ：吸取分析純濃硫酸(比重1.84)55.5mL，緩緩如入944.5mL水定容至1000mL。6. 0.1mol/L硫代硫酸鈉：稱取25克硫代硫酸鈉(Na2S2O3·5H2O)和0.4克碳酸鈉，用煮沸冷卻的蒸餾水溶解并定容至1000

55、mL，配制后放置三天再標定。五、操作取2可溶性淀粉溶液25mL加pH4.5醋酸緩沖液5mL混勻，在40恒溫水浴中預熱510分鐘加入待測酶液2mL準確計時1小時。取出加入4滴20NaOH終止酶反應，冷卻至室溫。取上述反應液5mL于定容瓶中，先加入0.05mol/L碘液10mL，再加0.1 mol/L NaOH 10mL，搖勻暗處靜置15分鐘。加入1mol/L硫酸2mL。用0.1mol/L的硫代硫酸鈉滴定至無色，記錄滴定值B mL。并以蒸餾水代替酶液，同法保溫后測定，記錄消耗硫代硫酸鈉的體積AmL。其與空白消耗硫代硫酸鈉毫升數(shù)的差值應在46之間，否則要適當調整酶液的稀釋倍數(shù)。六、計算 A空白所消耗的Na2S2O3的毫升數(shù)； B樣品所消耗的Na2S