實(shí)驗(yàn)四細(xì)菌的劃線分離與培養(yǎng)

1、實(shí)驗(yàn)四 細(xì)菌的劃線分離與培養(yǎng)一、實(shí)驗(yàn)前要說(shuō)明的幾點(diǎn)問(wèn)題點(diǎn)名,查看學(xué)生出勤情況?？偨Y(jié)上次作業(yè)，提出作業(yè)中出現(xiàn)的問(wèn)題并講解。二、板書(shū)部分 （一）目的要求1.掌握需氧菌分離培養(yǎng)的基本要領(lǐng)。2.了解厭氧菌的分離培養(yǎng)原則及方法。（二）實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.用普通瓊脂平板做一次劃線分離培養(yǎng)。2.用普通肉湯做一管大腸桿菌的移植培養(yǎng)。3.用普通瓊脂斜面做一管金黃葡萄球菌的移植培養(yǎng)。4.用劃線法進(jìn)行真菌的分離培養(yǎng)（示教）（三）作業(yè)1.為什么要進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)？2.進(jìn)行分離培養(yǎng)應(yīng)注意哪些事項(xiàng)？3.細(xì)菌分離培養(yǎng)的方法有哪些？（重點(diǎn)敘述平板劃線法）4.敘述真菌的劃線分離方法。三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容主要內(nèi)容有分離培養(yǎng)及目的、注意事項(xiàng)、分

2、離培養(yǎng)的方法、真菌的培養(yǎng)方法、患病動(dòng)物病料中分離培養(yǎng)、釣菌、移植。1.什么是分離培養(yǎng)及目的：分離培養(yǎng)是細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)的基本技術(shù)之一。分離培養(yǎng)之目的，在于從被檢材料中由多種細(xì)菌里分離出一種細(xì)菌。2.注意事項(xiàng)：1）分離培養(yǎng)前應(yīng)考慮所分離的細(xì)菌的特性，選擇適合其生長(zhǎng)需要的培養(yǎng)基（需氧還是厭氧、營(yíng)養(yǎng)的要求高還是不高、培養(yǎng)溫度等）等。例如：鏈球菌在普通瓊脂不長(zhǎng)，要加血清或血液。大腸桿菌和葡萄球菌要求較低，普通的培養(yǎng)基即可生長(zhǎng)。2）防止污染。分離培養(yǎng)的整個(gè)過(guò)程要嚴(yán)格無(wú)菌操作。培養(yǎng)基和一切用具必須徹底滅菌；操作時(shí)必須靠近火焰；操作完畢后，禁止再讓培養(yǎng)基接觸外界空氣。2 / 153）防止接種器械過(guò)熱，很容易殺死分

3、離培養(yǎng)的細(xì)菌，如接種環(huán)在燒灼滅菌后，不能立即釣取細(xì)菌材料，應(yīng)在酒精燈旁涼涼；另外還應(yīng)注意防止已釣取菌料的接種環(huán)，不慎通過(guò)火焰而將細(xì)菌殺死。4）初代分離時(shí)發(fā)現(xiàn)有多種細(xì)菌，觀察找到目的菌落，再拿一肉湯培養(yǎng)基純化培養(yǎng)。然后在接種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，作成凝集抗原，做血清學(xué)鑒定，。還可以反過(guò)來(lái)做抹片染色觀察。3.分離培養(yǎng)的方法：主要分需氧菌的分離培養(yǎng)方法、厭氧菌的分離培養(yǎng)方法和需要CO菌的培養(yǎng)分離方法。1） 需氧菌的分離培養(yǎng)法（1）平板劃線法：劃線后有單個(gè)菌落，便于觀察菌落的形態(tài)、溶血性等。方法左手拿瓊脂平板，使其與水平面成45。角；右手拿鉑金耳，使之與水平面平行，靠近酒精燈火焰操作。將接種環(huán)于酒精燈火焰中灼燒滅

4、菌，待其冷卻后，蘸取欲檢材料少許，注意不要?jiǎng)澠骗傊?，不要?jiǎng)澋锰瑁悦庠斐衫速M(fèi)，不要重復(fù)劃線，以免形成菌苔。劃線方法：方格劃線、蛇形劃線、區(qū)域劃線、交叉劃線，選擇其中一種進(jìn)行劃線。劃畢，將接種環(huán)燒灼滅菌，于皿底用蠟筆標(biāo)記被檢材料名稱及日期，倒轉(zhuǎn)置恒溫箱中培養(yǎng)。思考題：方格劃線哪個(gè)地方會(huì)長(zhǎng)出單個(gè)菌落比較多？（2）傾注法：不常用，這里不做介紹2）厭氧菌的分離培養(yǎng)方法厭氧菌生長(zhǎng)繁殖的環(huán)境不能有游離氧的存在。故在培養(yǎng)厭氧菌時(shí)，必須創(chuàng)造一個(gè)厭氧環(huán)境，一般以降低氧的張力或保持減低的氧張力為原則。目前應(yīng)用于厭氧菌的分離方法頗多，現(xiàn)就其中較簡(jiǎn)便且常用的幾種方法介紹如下：（1）焦性沒(méi)食子酸法 利用焦性沒(méi)食子酸在

5、堿性溶液內(nèi)能大量地吸收氧的原理進(jìn)行厭氧培養(yǎng)。通常100cm3空間用焦性沒(méi)食子酸1g，10%氫氧化鈉或氫氧化鉀10ml。具體方法有下列有平板培養(yǎng)法、干燥器培養(yǎng)法。平板培養(yǎng)法是將厭氧菌劃線接種于適宜的瓊脂平板，取一小團(tuán)直徑約2cm的脫脂棉，置于平皿蓋的內(nèi)面中央，其上滴加10%氫氧化鈉溶液約5ml；在靠近脫脂棉的一側(cè)放置焦性沒(méi)食子酸約0.5g,注意暫勿使兩者接觸，立即將已接種好的平板覆蓋于平皿蓋上，迅速用融化的石蠟密封平皿邊緣周?chē)?。封畢，輕輕搖動(dòng)平皿，使被氫氧化鈉溶液浸濕的脫脂棉與焦性沒(méi)食子酸接觸，然后置37恒溫箱中培養(yǎng)之。干燥器培養(yǎng)法是于干燥器底部放入氫氧化鈉溶液適量，然后再放入2-3個(gè)略高于液面

6、的玻璃圓柱（如鏈霉素小瓶），將適量焦性沒(méi)食子酸用紙或紗布包好，放置于圓柱上面，使暫勿與氫氧化鈉接觸，然后放下隔板，將已接種的培養(yǎng)皿或試管置于隔板上，待一切準(zhǔn)備好后，將蓋蓋好密封，并輕輕搖動(dòng)干燥器，使焦性沒(méi)食子酸落入氫氧化鈉溶液中。（2）高層瓊脂柱搖震培養(yǎng)分離法取長(zhǎng)約15cm，直徑約5mm的玻璃棒一支，一端塞以小木塞，另一端塞以棉花塞，高壓滅菌備用；加熱融化一管適合分離厭氧菌用的瓊脂培養(yǎng)基，待冷卻至50左右，接入少許經(jīng)適當(dāng)稀釋的待分離的培養(yǎng)物或含菌材料，充分搖震均勻；在瓊脂凝固前，迅速以無(wú)菌滴管吸取上述已接種的瓊脂培養(yǎng)基，注入上述（1）準(zhǔn)備好的玻璃管內(nèi)，置恒溫箱中培養(yǎng)。（3）連二亞硫酸鈉法 將已

7、接種的平板或斜面培養(yǎng)基，置于一玻璃干燥器內(nèi)（預(yù)先測(cè)出體積），按每1000ml容積稱取連二亞硫酸鈉（又稱保險(xiǎn)粉）和無(wú)水碳酸鈉各4g，并分別研細(xì)均勻，臨用前混合置于一平皿內(nèi)，放在培養(yǎng)基上層，然后將蓋蓋嚴(yán)，用凡士林密封，置37恒溫箱中培養(yǎng)。2）二氧化碳培養(yǎng)法少數(shù)細(xì)菌如布氏桿菌（牛型），在含有10%二氧化碳的環(huán)境下生長(zhǎng)良好。要?jiǎng)?chuàng)造這樣的環(huán)境，常用的方法為燭缸法。將接種的培養(yǎng)基置玻璃干燥器或其他可以密閉的玻璃缸內(nèi)，于其內(nèi)點(diǎn)燃一小段蠟燭，加上蓋（蓋邊涂凡士林以防漏氣），約一分鐘左右蠟燭熄滅，此時(shí)缸內(nèi)氧氣已被耗盡，缸內(nèi)所含二氧化碳約10%。注意蠟燭勿太長(zhǎng)，而且不宜靠近缸壁，以免因局部玻璃過(guò)熱而破裂。凡士林不

8、能太多也不能太少，多了蓋子滑落，少了則封口不嚴(yán)。4.真菌的分離培養(yǎng)法（簡(jiǎn)單介紹）應(yīng)用細(xì)菌的平板分離法（劃線、傾注），能容易而滿意地得到真菌的純培養(yǎng)。劃線法：2-5天長(zhǎng)霉菌。1）取瓊脂培養(yǎng)基熔化，冷卻至45，注入無(wú)菌平皿中，每皿15-20ml，作成平板待用。2）取要分離的材料（如田土、混雜的或污染的真菌培養(yǎng)物、真菌）少許，投入盛無(wú)菌水之試管中，搖振，使分離菌懸浮水中。3）將接種環(huán)經(jīng)火焰滅菌并冷卻后，蘸取上述懸浮液，進(jìn)行平板劃線。4）劃線完畢，置溫箱中培養(yǎng)2-5天，待形成子實(shí)器官后，釣取單個(gè)菌落的部分，制片檢查。若只有一種菌生長(zhǎng)，即得純種。另外，亦可在放大鏡的觀察下，用無(wú)菌鑷子夾取一段待分離的真菌

9、菌絲，直接放在平板上作分離培養(yǎng)，即可獲得該種真菌的純培養(yǎng)。5.自患病動(dòng)物病料中分離病原菌方法（簡(jiǎn)單介紹）1）瓊脂斜面分離法 取瓊脂斜面三管，用接種環(huán)蘸取欲檢病料少許（如為臟器，現(xiàn)將表面灼燒后，用滅菌解剖刀切開(kāi)，以接種環(huán)由切面釣取組織），混合于第一管的凝集水中，再做斜面劃線；然后取出接種環(huán)，不經(jīng)燒灼，繼續(xù)在第二管、第三管斜面上作同樣的劃線。劃畢，置溫箱中培養(yǎng)。經(jīng)此法分離培養(yǎng)后，第二管的菌落較第一管為少，第三管的菌落更少，如此較易得到單個(gè)菌落，達(dá)到純培養(yǎng)之目的。2）瓊脂平板涂布分離法 液體被檢病料如血液、腹水等，可用滅菌毛細(xì)吸管或吸管吸取，置1-2滴于平板中央，用L形玻棒或玻璃刮鏟作均勻涂布。如為

10、臟器病料，可先做成乳劑再行涂布；或取其一小塊，用鑷子夾住，表面燒烙后，用滅菌刀切開(kāi)，以其切面直接進(jìn)行涂布。此法適用于含菌量較少的病料的分離。3）通過(guò)試驗(yàn)動(dòng)物分離法 被檢材料中疑有某種病原菌存在，可將病料接種于有易感性的動(dòng)物體內(nèi)，如疑有豬丹毒桿菌存在的病料，可注射于鴿體，鴿死后，再取其脾臟以分離豬丹毒桿菌，?？傻玫郊兣囵B(yǎng)。四、釣菌和純培養(yǎng)被檢材料經(jīng)分離培養(yǎng)后，選擇欲分離的可疑菌落，用滅菌接種環(huán)（針）釣取少許，接種在新的培養(yǎng)基上，稱為釣菌。釣取一個(gè)菌落培養(yǎng)出來(lái)的細(xì)菌培養(yǎng)物，稱為純培養(yǎng)。純培養(yǎng)的目的在于進(jìn)一步進(jìn)行微生物學(xué)檢驗(yàn)和其他試驗(yàn)研究。方法：首先用肉眼或放大鏡觀察并選擇可疑的單個(gè)菌落，然后以蠟筆

11、在可疑菌落下面的平皿底上作一記號(hào)，用滅菌的接種環(huán)（針）輕輕接觸菌落，蘸取菌料少許，作抹片，染色，鏡檢。如其形態(tài)一致，即接種于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上，置溫箱中培養(yǎng)。6.細(xì)菌和真菌的移植方法（簡(jiǎn)單介紹）1）接種環(huán)移植法:以左手持長(zhǎng)有細(xì)菌（或真菌）的菌種和無(wú)菌的瓊脂斜面各一管，管口并齊，管底握于掌中，以右手作握筆狀緊執(zhí)接種環(huán)，并進(jìn)行火焰滅菌；以右手的小指和無(wú)名指扭開(kāi)并夾住第一管的棉塞，無(wú)名指和中指扭開(kāi)并夾住第二管的棉塞，或以小指和無(wú)名指同時(shí)扭開(kāi)并夾住兩管的棉塞。將管口通過(guò)火焰滅菌，然后用燒灼滅菌后的接種環(huán)插入菌種管內(nèi)，釣取少許菌料，接種于無(wú)菌的瓊脂斜面上。同樣將管口通過(guò)火焰滅菌后，塞好棉塞，最后將接種環(huán)燒灼

12、滅菌，用蠟筆在試管上標(biāo)記菌名、日期，置溫箱中培養(yǎng)。厭氧菌移植常用培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法如上述釣菌項(xiàng)。2）吸管或注射器移植法:移植定量的液體培養(yǎng)或表面有液體石蠟的厭氧菌培養(yǎng)物，一般也可以利用吸管或注射器移植，其操作方法系以無(wú)菌吸管或無(wú)菌注射器吸取培養(yǎng)物，代替接種環(huán)進(jìn)行移植。四、示教1. 用普通瓊脂平板做一次劃線分離培養(yǎng)：點(diǎn)上酒精燈，取實(shí)驗(yàn)三所做好的普通瓊脂平板，倒置，將培養(yǎng)基靠近酒精燈呈45度打開(kāi)，然后用鉑金耳釣取一環(huán)菌在培養(yǎng)基上劃線，選四種（方格劃線、蛇形劃線、區(qū)域劃線、交叉劃線）畫(huà)法中的一種。2. 用普通肉湯做一管大腸桿菌的移植培養(yǎng)：手拿大腸桿菌的培養(yǎng)試管和一管肉湯培養(yǎng)基，充分震蕩?？拷凭珶?，灼

13、燒管口，充分灼燒鉑金耳，放到酒精燈旁邊放涼，打開(kāi)試管塞，灼燒試管口，將鉑金耳釣取一環(huán)菌，然后將鉑金耳放到肉湯培養(yǎng)基，搖晃。灼燒鉑金耳，灼燒試管口，把試管塞上。充分灼燒鉑金耳。將接好試管和鉑金耳放到試管架。3.用普通瓊脂斜面做一管金黃葡萄球菌的移植培養(yǎng)：用相同的方法接種，在斜邊培養(yǎng)基上劃線。放到溫箱培養(yǎng)。4.用劃線法進(jìn)行真菌的分離培養(yǎng)（示教）：與細(xì)菌的劃線培養(yǎng)相同，畫(huà)好線后放如溫箱培養(yǎng)（30），2-5天，待形成子實(shí)器官后，釣取單個(gè)菌落的部分，制片檢查。若只有一種菌生長(zhǎng)，即得純種。另外，亦可在放大鏡的觀察下，用無(wú)菌鑷子夾取一段待分離的真菌菌絲，直接放在平板上作分離培養(yǎng)，即可獲得該種真菌的純培養(yǎng)。五

14、、實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意的問(wèn)題1）分離培養(yǎng)前應(yīng)考慮所分離的細(xì)菌的特性，選擇適合其生長(zhǎng)需要的培養(yǎng)基（需氧還是厭氧、營(yíng)養(yǎng)的要求高還是不高、培養(yǎng)溫度等）等。例如：鏈球菌在普通瓊脂不長(zhǎng)，要加血清或血液。大腸桿菌和葡萄球菌要求較低，普通的培養(yǎng)基即可生長(zhǎng)。2）防止污染。分離培養(yǎng)的整個(gè)過(guò)程要嚴(yán)格無(wú)菌操作。培養(yǎng)基和一切用具必須徹底滅菌；操作時(shí)必須靠近火焰；操作完畢后，禁止再讓培養(yǎng)基接觸外界空氣。3）防止接種器械過(guò)熱，很容易殺死分離培養(yǎng)的細(xì)菌，如接種環(huán)在燒灼滅菌后，不能立即釣取細(xì)菌材料，應(yīng)在酒精燈旁涼涼；另外還應(yīng)注意防止已釣取菌料的接種環(huán)，不慎通過(guò)火焰而將細(xì)菌殺死。4）初代分離時(shí)發(fā)現(xiàn)有多種細(xì)菌，觀察找到目的菌落，再拿一肉

15、湯培養(yǎng)基純化培養(yǎng)。然后在接種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，作成凝集抗原，做血清學(xué)鑒定，。還可以反過(guò)來(lái)做抹片染色觀察。六、作業(yè)1.為什么要進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)？2.進(jìn)行分離培養(yǎng)應(yīng)注意哪些事項(xiàng)？3.細(xì)菌分離培養(yǎng)的方法有哪些？（重點(diǎn)敘述平板劃線法）4.敘述真菌的劃線分離方法。七、本次實(shí)驗(yàn)總結(jié)1.掌握劃線法，熟悉四種劃線方法。以及細(xì)菌的移植方法。2.在操作過(guò)程中要防止污染。分離培養(yǎng)的整個(gè)過(guò)程要嚴(yán)格無(wú)菌操作。培養(yǎng)基和一切用具必須徹底滅菌；操作時(shí)必須靠近火焰；操作完畢后，禁止再讓培養(yǎng)基接觸外界空氣。3.操作的過(guò)程中要注意不要讓接種器械過(guò)熱。防止殺死細(xì)菌或真菌，如接種環(huán)在燒灼滅菌后，不能立即釣取細(xì)菌材料，應(yīng)在酒精燈旁涼涼；另外還

16、應(yīng)注意防止已釣取菌料的接種環(huán)，不慎通過(guò)火焰而將細(xì)菌殺死。八、附： 實(shí)驗(yàn)四：細(xì)菌的劃線分離與培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)所需物品一、試驗(yàn)材料名稱 組別 數(shù)量 合計(jì) 備注 1、酒精燈 5 2 10 火機(jī)（柴）2、接種環(huán) 5 2 103、培養(yǎng)基 自備用前融解普通瓊脂4、菌種 大腸桿菌肉湯、金黃色葡萄球菌斜面每組各1管5、病料糞便6、霉菌菌種7、真菌培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，應(yīng)提前制備平板每班2個(gè)）8、9ml生理鹽水試管4只9、5ml吸管10、吸球11、酒精棉球二、儀器設(shè)備名稱1、 干燥箱1臺(tái)2、 水浴鍋1臺(tái)3、 培養(yǎng)箱1臺(tái)表1、試驗(yàn)儀器設(shè)備統(tǒng)計(jì)表學(xué)院牧醫(yī)工程 實(shí)驗(yàn)室名稱畜牧微生物 實(shí)驗(yàn)名稱實(shí)驗(yàn)四細(xì)菌的劃線分離與培養(yǎng)儀

17、器設(shè)備名稱數(shù)量（臺(tái)、套）設(shè)備現(xiàn)狀備注藥品柜恒溫培養(yǎng)箱烘烤箱普通水箱低溫水箱（冰柜）高壓滅菌器流通蒸汽滅菌器水平式電動(dòng)離心機(jī)抽水機(jī)（真空泵）賽式細(xì)菌濾器G1-6波動(dòng)濾器顯微鏡超凈臺(tái)無(wú)菌室試驗(yàn)臺(tái)試驗(yàn)臺(tái)燈2個(gè)1臺(tái)1臺(tái)1臺(tái)1臺(tái)1臺(tái)1臺(tái)1臺(tái)1臺(tái)1套1套32臺(tái)1臺(tái)1個(gè)7個(gè)7套有1個(gè)有已壞無(wú)無(wú)已壞無(wú)無(wú)無(wú)無(wú)無(wú)有無(wú)無(wú)有已壞4套表2、試驗(yàn)試劑消耗情況統(tǒng)計(jì)表學(xué)院牧醫(yī)工程 實(shí)驗(yàn)室名稱畜牧微生物 實(shí)驗(yàn)名稱實(shí)驗(yàn)四細(xì)菌的劃線分離與培養(yǎng)分類(lèi)內(nèi)容試劑名稱實(shí)驗(yàn)人數(shù)組 數(shù)試劑量組均消耗蒸餾水單價(jià)試劑（元）人均消耗情況再利用香柏油二甲苯牛肉膏氯化鈉蛋白胨瓊脂粉堿性美蘭KOH草酸銨結(jié)晶紫碘片碘化鉀堿性復(fù)紅3232培養(yǎng)細(xì)菌染色制備各種標(biāo)本片661瓶1瓶1瓶1瓶1瓶1瓶1瓶1瓶1瓶1瓶1瓶1瓶1瓶5000ml5000ml合計(jì)表3.實(shí)驗(yàn)用低值易耗品及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物統(tǒng)計(jì)表系別： 牧醫(yī) 實(shí)驗(yàn)室名稱： 畜牧微生物 實(shí)驗(yàn)名稱：實(shí)驗(yàn)四細(xì)菌的劃線分離與培養(yǎng)實(shí)