化學(xué)發(fā)光法測(cè)試模式相關(guān)結(jié)果小結(jié)

1、 基于磁分離的化學(xué)發(fā)光發(fā)測(cè)定試劑的項(xiàng)目設(shè)計(jì)及初步進(jìn)展2008年1月一、 項(xiàng)目設(shè)計(jì)背景1.國(guó)際成熟的免疫學(xué)自動(dòng)檢測(cè)體系及分析早在上世紀(jì)八十年代，一些知名的IVD廠商就開(kāi)始全自動(dòng)免疫分析儀的研制。發(fā)展到今天，市場(chǎng)上的全自動(dòng)免疫分析儀已經(jīng)非常成熟，而檢測(cè)原理也有著一定的區(qū)別。對(duì)此，我們做一個(gè)簡(jiǎn)單的分析。Abbott公司，第一代產(chǎn)品也是目前世界上臨床應(yīng)用最為成功的全自動(dòng)免疫分析儀，Axsystem,檢測(cè)原理是：基于聚苯乙烯粒子包被，堿性磷酸酶標(biāo)記(Alp)的熒光分析技術(shù)，儀器的洗滌體系為其專利的醋酸纖維吸附洗滌，洗滌及檢測(cè)杯設(shè)計(jì)得非常精致，科學(xué)，保證了檢測(cè)體系的特異性和精密性，因此在國(guó)，很長(zhǎng)一段時(shí)間里

2、，Axsystem的檢測(cè)結(jié)果都作為一些項(xiàng)目檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。但是由于體系的檢測(cè)信號(hào)為熒光信號(hào)，因此其檢測(cè)量程相對(duì)較低，例如：CEA檢測(cè)高限最高為500ng；從而影響了項(xiàng)目的檢測(cè)性能。第二代產(chǎn)品Architect系列是基于磁珠包被的，吖啶酯標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫學(xué)檢測(cè)分析儀。該體系采用磁珠分離體系，吖啶酯標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光技術(shù)，吖啶酯作為化學(xué)發(fā)光法標(biāo)記物，優(yōu)點(diǎn)很多：首先縮短了檢測(cè)光信號(hào)所需要的時(shí)間，其次發(fā)光集團(tuán)能夠在強(qiáng)堿的作用下脫落，之后在均勻的液相中收集光信號(hào)，使體系可能擁有更好的精密度，同時(shí)光信號(hào)的采集是對(duì)整個(gè)峰值的積分，使檢測(cè)體系擁有更廣的檢測(cè)量程，例如：CA125在該體系的檢測(cè)高限可達(dá)1500ng，

3、是Axsystem的3倍。但吖啶酯標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光技術(shù)為Bayer公司的專利，在應(yīng)用上存在限制。Bayer公司（Siemens），全自動(dòng)免疫檢測(cè)分析體系實(shí)際是來(lái)自Ciba-corning檢測(cè)體系，即：吖啶酯標(biāo)記，磁珠捕獲的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)體系。該體系同Architect體系一樣，應(yīng)用吖啶酯有專利的限制。BeckmenCoulter公司,堿性磷酸酶標(biāo)記，磁珠捕獲的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)體系，堿性磷酸酶標(biāo)記的缺點(diǎn)很多：首先，作為標(biāo)記物，分子量過(guò)大，在免疫學(xué)反應(yīng)過(guò)程中可能存在空間位阻從而影響捕獲，其次人血清中含有堿性磷酸酶的同工酶，可能存在由于非特異性吸附造成的非特異性發(fā)光反應(yīng)。但是，相對(duì)于吖啶酯標(biāo)記，堿性磷酸酶沒(méi)

4、有專利限制，標(biāo)記技術(shù)成熟，發(fā)光反應(yīng)與標(biāo)記物濃度之間有著良好的信號(hào)相應(yīng)關(guān)系。Johnson&Johnson，HRP標(biāo)記，管式捕獲，該體系基本是在HRP酶標(biāo)記顯色的基礎(chǔ)上略作改進(jìn)，采用HRP標(biāo)記技術(shù)，標(biāo)記技術(shù)成熟，市場(chǎng)上應(yīng)用時(shí)間長(zhǎng)，整個(gè)標(biāo)記體系在市場(chǎng)上已經(jīng)非常成熟，但該體系缺點(diǎn)很多，管式捕獲，包被流程復(fù)雜，工藝要求高，同時(shí)管間精密度也比較難控制，HRP的化學(xué)發(fā)光體系，由于整個(gè)反應(yīng)非常復(fù)雜，因此，發(fā)光信號(hào)和標(biāo)記物之間相應(yīng)關(guān)系較差，即：發(fā)光信號(hào)與標(biāo)記物濃度之間沒(méi)有很好的比例關(guān)系，從而影響檢出靈敏度和量程；從這點(diǎn)而言并不適合做量程要求較高的定量檢測(cè)。Roche，以專利的電化學(xué)檢測(cè)在整個(gè)免疫學(xué)檢測(cè)

5、體系中獨(dú)樹(shù)一幟，優(yōu)點(diǎn)很多，靈敏度高，量程廣，但缺點(diǎn)也有，但由于有專利限制，也影響了其應(yīng)用。二、 項(xiàng)目設(shè)計(jì)依據(jù)1.為什么選擇化學(xué)發(fā)光？免疫學(xué)檢測(cè)(immunoassay)是一類以抗原抗體之間發(fā)生的免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)的檢測(cè)。根據(jù)檢測(cè)過(guò)程中的最終檢測(cè)信號(hào)的不同，可以分為：放免、可見(jiàn)光檢測(cè)（optical detection）如比色類及以酶聯(lián)免疫吸附為代表的吸光度檢測(cè)（absorbance），光發(fā)射類（emission）主要是熒光、化學(xué)發(fā)光信號(hào)的檢測(cè)。上述這幾大類的檢測(cè)中以可見(jiàn)光類的檢測(cè)靈敏度最低，但由于對(duì)儀器依賴較小，檢測(cè)方法成熟，收費(fèi)較低，因此，在我國(guó)的廣區(qū)有著廣泛的應(yīng)用；但由于測(cè)定主要以定性測(cè)試為

6、主，并且靈敏度較低，量程只有20倍左右，因此可以檢測(cè)的項(xiàng)目非常有限，這也限制了這種方法在臨床中的應(yīng)用。光發(fā)射類主要有熒光和化學(xué)發(fā)光類。熒光類的信號(hào)檢測(cè)包括前幾年炒作非常熱的時(shí)間分辨熒光檢測(cè)，用于小分子檢測(cè)的能量傳遞類檢測(cè)等；相對(duì)于可見(jiàn)光類信號(hào)檢測(cè)，熒光信號(hào)的檢測(cè)靈敏度高，量程可達(dá)103左右，但熒光信號(hào)的檢測(cè)受到多種因素的干擾，如標(biāo)本的生物學(xué)本底，激發(fā)光波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)之間的狹窄的斯托頓位移等，都將影響檢測(cè)的特異性，進(jìn)而降低了檢測(cè)的實(shí)際靈敏度和量程；同時(shí)儀器檢測(cè)成本非常高（激發(fā)波長(zhǎng)需要488nm的激光器），似乎更適合于多相檢測(cè)。相對(duì)于其他方法，化學(xué)發(fā)光類的信號(hào)類檢測(cè)靈敏度最高，檢測(cè)的理論量程可達(dá)1

7、05左右，但實(shí)際不同的發(fā)光體系檢測(cè)靈敏度略有差異，檢測(cè)量程的差別也非常大?；瘜W(xué)發(fā)光類免疫學(xué)檢測(cè)按標(biāo)記物進(jìn)行分類，可分為酶促化學(xué)發(fā)光免疫學(xué)檢測(cè)和化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫學(xué)檢測(cè)?；瘜W(xué)發(fā)光標(biāo)記應(yīng)用的最廣的標(biāo)記物主要是吖啶酯類，這是一種比較理想的標(biāo)記物，但由于存在嚴(yán)格的專利保護(hù)，因此我們基本不存在應(yīng)用的可能性。酶促化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物主要有辣根過(guò)氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（Alp），一般認(rèn)為Alp靈敏度高于HRP，但實(shí)際上，不同的底物體系的實(shí)際檢測(cè)靈敏度差異很大，而不同的檢測(cè)體系實(shí)際檢測(cè)量程也差別很大。本實(shí)驗(yàn)室測(cè)試結(jié)果顯示，在同一檢測(cè)體系中，已篩選出的靈敏度最佳的HRP底物體系和 Alp底物體系相比，Alp體系

8、的量程和檢出靈敏度均優(yōu)于HRP，并且Alp體系發(fā)光信號(hào)非常穩(wěn)定，因此，就發(fā)光體系本身而言，Alp體系確實(shí)優(yōu)于HRP。但是Alp的應(yīng)用在免疫學(xué)檢測(cè)中，存在很多其他問(wèn)題，如：交聯(lián)，人血清標(biāo)本中源性Alp的干擾問(wèn)題等等，都限制了Alp在臨床中的應(yīng)用。2.為什么是磁珠？免疫學(xué)檢測(cè)按檢測(cè)方式來(lái)分有均相和非均相。前者由于沒(méi)有洗滌過(guò)程，抗干擾性非常弱，因此，目前不是免疫學(xué)檢測(cè)的主流。非均相檢測(cè)又可分為基于聚苯乙烯板包被的固相反應(yīng)和基于粒子（聚苯乙烯粒子或磁性粒子）包被的液相反應(yīng)。相對(duì)于固相反應(yīng)，液相反應(yīng)優(yōu)點(diǎn)很多，在標(biāo)記物相同的情況下，液相反應(yīng)有更寬的檢測(cè)量程。并且，對(duì)于磁珠來(lái)說(shuō)，易于洗滌，理論上檢測(cè)試劑可能

9、有更好的精密度。對(duì)于制備工藝來(lái)說(shuō)，采用磁珠進(jìn)行包被，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)過(guò)程的人員設(shè)備成本非常低，生產(chǎn)流程易于控制，容易規(guī)模化。3.為什么是自動(dòng)化的免疫分析體系？首先，發(fā)光法檢測(cè)本身非常容易受到環(huán)境因素的影響，因此，需要較為封閉的檢測(cè)體系，而酶促化學(xué)發(fā)光，對(duì)檢測(cè)體系還有溫控的要求，磁珠的洗滌也需要相應(yīng)的配套儀器，所有這些要求，如果分拆成手工操作，將增加其不精密度和測(cè)定時(shí)的不準(zhǔn)確度，從而削減方法學(xué)本身的優(yōu)勢(shì)；同時(shí)，手工法的測(cè)定模式從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看，應(yīng)該會(huì)慢慢退出中高端的醫(yī)院市場(chǎng)。其次，自動(dòng)化的免疫分析體系的研制成功，將使我們有可能為醫(yī)院提供模塊式小型工作站的服務(wù)模式。根據(jù)市場(chǎng)上各大IVD廠商推出的儀器系

10、列，我們很清楚的看到，整合已經(jīng)是將來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)，如Roche公司提供的免疫測(cè)試模塊和生化測(cè)試模塊，使得用戶能夠根據(jù)測(cè)試量的大小來(lái)自行整合，從而對(duì)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)資源進(jìn)行優(yōu)化。我們公司已經(jīng)擁有全自動(dòng)的生化分析儀，配合全自動(dòng)的免疫分析儀，將使我們的檢測(cè)系統(tǒng)更具有競(jìng)爭(zhēng)力；從而使我們的產(chǎn)品在未來(lái)很長(zhǎng)一段時(shí)間，能夠立于不敗之地。三、 項(xiàng)目設(shè)計(jì)方案基于上述分析，我們對(duì)于化學(xué)發(fā)光免疫學(xué)檢測(cè)系列試劑的開(kāi)發(fā)的定位為基于磁珠包被的酶促化學(xué)發(fā)光全自動(dòng)免疫分析體系。項(xiàng)目具體設(shè)計(jì)如下：1. 第一階段：檢測(cè)模式的確定，由于現(xiàn)有的應(yīng)用于免疫學(xué)檢測(cè)的方法主要有：夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法。因此，確定整個(gè)檢測(cè)流程及檢測(cè)模式時(shí)，應(yīng)包含這兩種檢測(cè)

11、方法的通用模式。2. 第二階段：完成部分目前醫(yī)院里最具市場(chǎng)的項(xiàng)目開(kāi)設(shè)及基本性能考核；同時(shí)，儀器開(kāi)發(fā)能基本確定加樣體系，洗滌體系及檢測(cè)體系，初步確定儀器開(kāi)發(fā)方案并完成簡(jiǎn)易的儀器測(cè)試；3. 第三階段：完成所有開(kāi)設(shè)項(xiàng)目的基本性能考核，儀器開(kāi)發(fā)完成。4. 第四階段：完成所有項(xiàng)目溯源性考核，性能考核，臨床考核，開(kāi)始項(xiàng)目申報(bào)。 5. 第五階段：完成市場(chǎng)后完善，開(kāi)設(shè)新的項(xiàng)目。四、檢測(cè)模式的確定通過(guò)對(duì)市場(chǎng)上現(xiàn)有免疫學(xué)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)模式的篩選，計(jì)劃采用以鏈霉親和素包被的磁珠（SAMag）為固相捕獲載體，以辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶作為標(biāo)記物的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)模式。目前我們已經(jīng)獲得如下結(jié)果：1.不同臂長(zhǎng)生物素比較由于空

12、間位阻對(duì)SAMag的捕獲效應(yīng)有一定影響，因此，考核不同臂長(zhǎng)的生物素對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。通過(guò)對(duì)不同臂長(zhǎng)的生物素的考核，確定最佳臂長(zhǎng)的生物素，用作進(jìn)一步的測(cè)試。2. 不同粒徑SAMag的篩選由于磁珠粒徑的大小決定了單位體積SA的含量，也決定了單位體積的磁珠的捕獲能力，一般來(lái)說(shuō)，粒徑越小則單位體積的SA含量越高，磁珠的捕獲力越強(qiáng)；但同時(shí)粒徑越小，磁珠在多次洗滌轉(zhuǎn)移中的損失也較大（上吸法分離磁珠），經(jīng)過(guò)測(cè)試及綜合評(píng)估，最終選出合適粒徑的磁珠作為固相捕獲載體。3.HRP及Alp發(fā)光底物的篩選采用通用模式對(duì)來(lái)自不同供應(yīng)商的底物進(jìn)行檢測(cè)分析。即HRP/Alp和Biotin進(jìn)行交聯(lián)，分別用SA包被的磁珠和SA包

13、被的發(fā)光板考核現(xiàn)有的HRP/Alp發(fā)光底物，現(xiàn)有各底物體系中，測(cè)定結(jié)果初步表明，底物是化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)的決定因素。HRP現(xiàn)有底物的靈敏度在本系統(tǒng)的測(cè)試為50pg/ml,量程在103左右；Alp底物檢測(cè)靈敏度在5 pg/ml，量程在104左右，相對(duì)光子數(shù)與Alp濃度之間有著良好的響應(yīng)關(guān)系。4.Alp交聯(lián)方法確定通過(guò)對(duì)Alp兩種交聯(lián)方法比較，最終選擇過(guò)碘酸鈉法對(duì)Alp進(jìn)行抗體交聯(lián)。5.HRP與Alp兩種標(biāo)記物發(fā)光法測(cè)定比較選用CA125作為待測(cè)物，對(duì)兩種酶促化學(xué)發(fā)光法做比較，分別對(duì)靈敏度，量程，信號(hào)與濃度之間的響應(yīng)關(guān)系進(jìn)行測(cè)試比較，最后確定采用Alp作為酶標(biāo)記物，作進(jìn)一步的測(cè)試。五、相關(guān)項(xiàng)目測(cè)試結(jié)果1

14、.按照上述測(cè)定模式，已經(jīng)完成CA125，CEA，AFP，PSA，fPSA等腫瘤標(biāo)志物的抗體配對(duì)工作。并完成相關(guān)項(xiàng)目性能指標(biāo)的測(cè)試。2.甲狀腺素類測(cè)試甲狀腺素類主要打算開(kāi)設(shè)三個(gè)項(xiàng)目：總T3，總T4和TSH。目前已完成總T4的體系構(gòu)建及性能考核。總T3測(cè)試正在進(jìn)行中。部分項(xiàng)目性能初步考核結(jié)果如下：CA125 （IU/ml）總T4（ng/ml）靈敏度不高于1.0不高于15線性圍1.0500015350準(zhǔn)確度良好良好特異性篩選400例獻(xiàn)血員血漿，特異性良好測(cè)試部分獻(xiàn)血員血漿，特異性良好3、穩(wěn)定性測(cè)試完成CA125及總T4Alp酶接物工作液373天熱穩(wěn)定性考核，測(cè)試結(jié)果良好，完成腫瘤標(biāo)志物類Biotin抗體復(fù)合物工作液熱穩(wěn)定性考核，結(jié)果良好。目前，測(cè)試結(jié)果顯示，已基本Alp酶促發(fā)光的測(cè)試平臺(tái)的構(gòu)建，完成上述七個(gè)產(chǎn)品（CA125，CEA，AFP，PSA，fPSA，總T4，總T3）的校準(zhǔn)體系及質(zhì)控體系的篩選和相關(guān)穩(wěn)定性測(cè)試。而進(jìn)一步的性能考核及抗干擾性，校準(zhǔn)品的溯源性測(cè)試，臨床考核等都需要儀器，才能完成。六、 最終測(cè)試流程總結(jié)根據(jù)上述測(cè)試結(jié)果，現(xiàn)有兩種測(cè)試模式：1.夾心法；2.競(jìng)爭(zhēng)法?；竞w了現(xiàn)有的免疫學(xué)檢測(cè)項(xiàng)目的測(cè)試模式。夾心法測(cè)試流程如下：生物素化抗體樣本酶接物 3730min 加入鏈霉親和素磁珠 3730min 加入發(fā)光底物 測(cè)試讀數(shù)競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)試流程如下