基因轉(zhuǎn)染技術(shù)及其應(yīng)用簡(jiǎn)介

1、報(bào)告人報(bào)告人: 陳陳 紅紅 平平2006年年11月月安德魯法爾和克雷格梅洛 報(bào)告內(nèi)容報(bào)告內(nèi)容n一、基因轉(zhuǎn)染簡(jiǎn)介一、基因轉(zhuǎn)染簡(jiǎn)介n二、基因轉(zhuǎn)染的基本方法二、基因轉(zhuǎn)染的基本方法n三、基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的應(yīng)用三、基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的應(yīng)用1.基因轉(zhuǎn)染:將具生物功能的核酸轉(zhuǎn)移或運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)并使核酸在細(xì)胞內(nèi)維持其生物功能。2.基因轉(zhuǎn)染技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因組功能研究和基因治療研究。一、基因轉(zhuǎn)染簡(jiǎn)介一、基因轉(zhuǎn)染簡(jiǎn)介二、基因轉(zhuǎn)染的基本方法二、基因轉(zhuǎn)染的基本方法(一一)重組子構(gòu)建重組子構(gòu)建(二二)基因轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的基本方法基因轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的基本方法(一一)重組子構(gòu)建重組子構(gòu)建1.目的基因的制備和獲取目的基因的制備和獲取2.

2、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體的選擇哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體的選擇3. DNA片斷的重組連接片斷的重組連接4. DNA重組體的鑒定重組體的鑒定(1)目的基因目的基因 是所要研究或應(yīng)用的基因，也就是將要克隆或表達(dá)的基因或基因的一個(gè)片段(2)目的基因常用的制備方法目的基因常用的制備方法 1.目的基因的制備和獲取目的基因的制備和獲取A.限制酶切除限制酶切除 a.從原核基因組DNA制備視原核基因組物理圖譜已知或未知，克隆方法不同。 b. 從真核基因組從真核基因組DNA制備制備 c.從已克隆的從已克隆的DNA片段制備片段制備B.B. PCRPCR或或RT/PCRRT/PCR方法制備目的基因方法制備目的基因a. 獲取已

3、知基因獲取已知基因 據(jù)已發(fā)表的基因序列（或基因兩側(cè)序列已知）據(jù)已發(fā)表的基因序列（或基因兩側(cè)序列已知） 設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)/ /合合成一對(duì)引物成一對(duì)引物 PCR PCR（基因組（基因組DNADNA為模板）為模板）/RT-PCR(mRNA/RT-PCR(mRNA為模為模板板) ) 從組織或細(xì)胞制備目的基因從組織或細(xì)胞制備目的基因b.b. 構(gòu)建構(gòu)建RT/PCRRT/PCR文庫(kù)法獲取未知基因文庫(kù)法獲取未知基因 據(jù)據(jù)mRNAmRNA末端如末端如polyApolyA尾設(shè)計(jì)共同引物尾設(shè)計(jì)共同引物 將所用將所用mRNAmRNA并逆轉(zhuǎn)并逆轉(zhuǎn)錄成錄成cDNAcDNA利用工具酶在利用工具酶在cDNAcDNA末端加尾末端加尾

4、采用一對(duì)共用引物采用一對(duì)共用引物擴(kuò)增所有擴(kuò)增所有cDNAcDNA，插入適當(dāng)載體，插入適當(dāng)載體 構(gòu)成構(gòu)成PCRcDNA文庫(kù)篩選文庫(kù)篩選C.計(jì)算機(jī)克隆即利用計(jì)算機(jī)克隆即利用GenBank信息，利用不信息，利用不同種屬同源性設(shè)計(jì)引物，嘗試獲取未知基因片同種屬同源性設(shè)計(jì)引物，嘗試獲取未知基因片段，這有賴(lài)于各種計(jì)算機(jī)軟件的應(yīng)用。段，這有賴(lài)于各種計(jì)算機(jī)軟件的應(yīng)用。D.化學(xué)合成法制備基因片段化學(xué)合成法制備基因片段用用DNA合成儀，合成儀，對(duì)目的基因分段合成，連接，可以得到所需的對(duì)目的基因分段合成，連接，可以得到所需的目的基因。目的基因。2.哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體的選擇哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體的選擇哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)

5、載體有哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體有2大類(lèi)：質(zhì)粒型載體和病毒型載體大類(lèi)：質(zhì)粒型載體和病毒型載體（1）質(zhì)粒型載體）質(zhì)粒型載體 哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)粒型載體大多數(shù)是通過(guò)細(xì)菌質(zhì)粒而獲得哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)粒型載體大多數(shù)是通過(guò)細(xì)菌質(zhì)粒而獲得的，主要是在質(zhì)粒的基礎(chǔ)上插入了一些病毒或其他一些物種的，主要是在質(zhì)粒的基礎(chǔ)上插入了一些病毒或其他一些物種及人的基因表達(dá)調(diào)控序列。及人的基因表達(dá)調(diào)控序列。A. 典型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體需要以下順式作用元件典型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體需要以下順式作用元件: a.啟動(dòng)子啟動(dòng)子 b.增強(qiáng)子增強(qiáng)子 c. 多聚腺苷酸化信號(hào)多聚腺苷酸化信號(hào) d. 藥物選擇標(biāo)記基藥物選擇標(biāo)記基e. 報(bào)告基因報(bào)告基因

6、f.表位標(biāo)簽表位標(biāo)簽B.B.常用的哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒載體常用的哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒載體a. pcDNA3.la. pcDNA3.lb. pSIb. pSIc. pCMV-HAc. pCMV-HAd. pBudCE4.1d. pBudCE4.1e. pTREe. pTRE（2 2）病毒型載體）病毒型載體 病毒型載體已被廣泛地用于將外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞病毒型載體已被廣泛地用于將外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞或替換哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的缺陷基因，這類(lèi)載體將來(lái)在基因治療或替換哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的缺陷基因，這類(lèi)載體將來(lái)在基因治療中將具有非常重要的價(jià)值。目前應(yīng)用的病毒類(lèi)型包括：逆轉(zhuǎn)錄中將具有非常重要的價(jià)值。目前應(yīng)用的病毒類(lèi)

7、型包括：逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、牛痘病毒和桿狀病毒等。病毒、腺病毒、牛痘病毒和桿狀病毒等。 A A逆轉(zhuǎn)錄病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 逆轉(zhuǎn)錄病毒的優(yōu)點(diǎn)是，可以使外源基因整合到基因組中，逆轉(zhuǎn)錄病毒的優(yōu)點(diǎn)是，可以使外源基因整合到基因組中，因而可以被穩(wěn)定傳代和表達(dá)。但是，由于逆轉(zhuǎn)錄病毒的插入位因而可以被穩(wěn)定傳代和表達(dá)。但是，由于逆轉(zhuǎn)錄病毒的插入位點(diǎn)是隨機(jī)的，因而在基因組內(nèi)的整合有可能破壞一些內(nèi)源基因點(diǎn)是隨機(jī)的，因而在基因組內(nèi)的整合有可能破壞一些內(nèi)源基因的結(jié)構(gòu)，尤其是當(dāng)插人到一些重要的基因位點(diǎn)時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的的結(jié)構(gòu)，尤其是當(dāng)插人到一些重要的基因位點(diǎn)時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的異常。異常。B.腺病毒載體腺病毒載體 易于培養(yǎng)、純化

8、，在感染過(guò)程中復(fù)制與轉(zhuǎn)易于培養(yǎng)、純化，在感染過(guò)程中復(fù)制與轉(zhuǎn)錄依賴(lài)于宿主細(xì)胞的聚合酶，可插入較大的外錄依賴(lài)于宿主細(xì)胞的聚合酶，可插入較大的外源基因片段，且腺病毒基因不會(huì)發(fā)生整合，是源基因片段，且腺病毒基因不會(huì)發(fā)生整合，是研究真核基因的良好模型。研究真核基因的良好模型。3.DNA片斷的重組連接片斷的重組連接粘端連接方法要點(diǎn)粘端連接方法要點(diǎn)平端連接方法要點(diǎn)平端連接方法要點(diǎn)單酶單切點(diǎn)單酶單切點(diǎn) 防自身環(huán)化，希望防自身環(huán)化，希望定向插入；定向插入；雙酶雙切點(diǎn)雙酶雙切點(diǎn) 定向克隆，構(gòu)建表定向克隆，構(gòu)建表達(dá)載體的最好用此法；達(dá)載體的最好用此法；利用同裂解酶產(chǎn)生相同粘端。利用同裂解酶產(chǎn)生相同粘端。平端，平端連

9、接；平端，平端連接；Linker連接酶切產(chǎn)生粘端連接；連接酶切產(chǎn)生粘端連接；Adaptor銜接目的基因和載體；銜接目的基因和載體；同源同聚尾同源同聚尾，克隆，克隆cDNA的最好方法的最好方法T載體，載體，PCR產(chǎn)物產(chǎn)物T/A克隆法連接。克隆法連接。4. DNA重組體的鑒定重組體的鑒定 外源外源DNA片斷是否插入載體構(gòu)成重組片斷是否插入載體構(gòu)成重組DNA分子，而插入片斷大小，是分子，而插入片斷大小，是否突變及插入位置，順序及方向則關(guān)系到構(gòu)建載體是否擴(kuò)增，我們所需要的否突變及插入位置，順序及方向則關(guān)系到構(gòu)建載體是否擴(kuò)增，我們所需要的基因或表達(dá)，表達(dá)相應(yīng)的產(chǎn)品，所以需要進(jìn)一步鑒定基因或表達(dá)，表達(dá)相應(yīng)

10、的產(chǎn)品，所以需要進(jìn)一步鑒定DNA重組體重組體（1） 酶切鑒定是必需的，基于下述酶切鑒定是必需的，基于下述: A. 限制性圖譜個(gè)體特異性，限制性圖譜個(gè)體特異性，不同的載體或不同的載體或DNA分子物理圖譜不同，酶切分子物理圖譜不同，酶切后片段大小不一樣，電泳圖譜不一樣。后片段大小不一樣，電泳圖譜不一樣。 B. 同一載體連接不同的同一載體連接不同的DNA片斷，不同的載體連接同一片段片斷，不同的載體連接同一片段(片段上也片段上也有位點(diǎn)）酶切圖譜是不同的有位點(diǎn)）酶切圖譜是不同的 。 C. 插入法插入法(單酶單切點(diǎn)單酶單切點(diǎn))或替代法或替代法(雙酶雙位點(diǎn)雙酶雙位點(diǎn))酶切，一般來(lái)說(shuō)用酶切，一般來(lái)說(shuō)用3種限種

11、限制酶切：制酶切： 可鑒定載體及可鑒定載體及 插入片段的大小插入片段的大小, ,方向方向, ,切后并電泳分析切后并電泳分析, ,以確定是否以確定是否得到預(yù)期的得到預(yù)期的rDNArDNA。（2）若構(gòu)建）若構(gòu)建DNA重組體是為了克隆某個(gè)基因，可進(jìn)行重組體是為了克隆某個(gè)基因，可進(jìn)行在序列測(cè)定。在序列測(cè)定。（3）若構(gòu)建表達(dá)載體，可進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物鑒定。）若構(gòu)建表達(dá)載體，可進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物鑒定。 對(duì)外源基因轉(zhuǎn)染方法的要求包括：轉(zhuǎn)移效率高，不影響對(duì)外源基因轉(zhuǎn)染方法的要求包括：轉(zhuǎn)移效率高，不影響細(xì)胞的正常生理活動(dòng)，低毒性，容易使用，重復(fù)性好，易獲細(xì)胞的正常生理活動(dòng)，低毒性，容易使用，重復(fù)性好，易獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子。根據(jù)

12、轉(zhuǎn)染的機(jī)制不同可將轉(zhuǎn)染法分為：得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子。根據(jù)轉(zhuǎn)染的機(jī)制不同可將轉(zhuǎn)染法分為： 1.1.化學(xué)轉(zhuǎn)染法化學(xué)轉(zhuǎn)染法 2.2.物理轉(zhuǎn)染法物理轉(zhuǎn)染法 3.3.病毒感染法病毒感染法 (二二)基因轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的基本方法基因轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的基本方法1.1.化學(xué)轉(zhuǎn)染法化學(xué)轉(zhuǎn)染法 化學(xué)轉(zhuǎn)染法包括化學(xué)轉(zhuǎn)染法包括DEAEDEAE一葡聚糖法、磷酸鈣法和人一葡聚糖法、磷酸鈣法和人工脂質(zhì)體法等。工脂質(zhì)體法等。目前應(yīng)用最廣泛的是人工質(zhì)體法。目前應(yīng)用最廣泛的是人工質(zhì)體法。 1.DEAE-1.DEAE-葡聚糖葡聚糖 是最早應(yīng)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染的試劑之一。是最早應(yīng)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染的試劑之一。DEAE-DEAE-葡聚糖是陽(yáng)離子多聚體

13、葡聚糖是陽(yáng)離子多聚體, ,它與帶負(fù)電的核酸結(jié)它與帶負(fù)電的核酸結(jié)合后接近細(xì)胞膜而被攝取。合后接近細(xì)胞膜而被攝取。DEAEDEAE一葡聚糖轉(zhuǎn)染已成一葡聚糖轉(zhuǎn)染已成功地應(yīng)用于瞬時(shí)開(kāi)始，但用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染卻不可靠。功地應(yīng)用于瞬時(shí)開(kāi)始，但用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染卻不可靠。2. 2. 磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染法磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染法 由于試劑易得、價(jià)格便宜而被廣泛用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定染由于試劑易得、價(jià)格便宜而被廣泛用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定染的研究。方法是，先將的研究。方法是，先將DNADNA和氯化鈣混合，然后加人到和氯化鈣混合，然后加人到PBSPBS中中慢慢形成慢慢形成DNADNA磷酸鈣沉淀，后把含有沉淀的混懸液加到培養(yǎng)的磷酸鈣沉淀，后把含

14、有沉淀的混懸液加到培養(yǎng)的細(xì)胞上，通過(guò)胞膜的內(nèi)吞作用攝人細(xì)胞上，通過(guò)胞膜的內(nèi)吞作用攝人DNADNA。3. 3. 人工脂質(zhì)體法人工脂質(zhì)體法 脂質(zhì)體還可以介導(dǎo)脂質(zhì)體還可以介導(dǎo)DNADNA和和RNARNA轉(zhuǎn)動(dòng)物和人的體內(nèi)，用于基因轉(zhuǎn)動(dòng)物和人的體內(nèi)，用于基因治療。人工合成的陽(yáng)離子脂質(zhì)體與帶負(fù)電荷的核酸結(jié)合后形治療。人工合成的陽(yáng)離子脂質(zhì)體與帶負(fù)電荷的核酸結(jié)合后形成合物，當(dāng)復(fù)合物接近細(xì)胞膜時(shí)被內(nèi)吞成為內(nèi)體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，成合物，當(dāng)復(fù)合物接近細(xì)胞膜時(shí)被內(nèi)吞成為內(nèi)體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，隨后隨后DNADNA復(fù)合物被釋放進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。復(fù)合物被釋放進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。2.2.物理方法物理方法 包括電穿孔、顯微注射及基因槍等方法。包括電

15、穿孔、顯微注射及基因槍等方法。（1 1）電穿孔法）電穿孔法 利用高壓電脈沖對(duì)細(xì)胞膜的干擾，使其形成利用高壓電脈沖對(duì)細(xì)胞膜的干擾，使其形成利于核酸進(jìn)人的微孔。電穿孔技術(shù)可用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)利于核酸進(jìn)人的微孔。電穿孔技術(shù)可用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，可方便地用于懸浮細(xì)胞，重現(xiàn)性染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，可方便地用于懸浮細(xì)胞，重現(xiàn)性好，但需要較多的細(xì)胞。影響轉(zhuǎn)染效率的主要因好，但需要較多的細(xì)胞。影響轉(zhuǎn)染效率的主要因素是脈沖強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間。必須找到能夠使核酸素是脈沖強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間。必須找到能夠使核酸有效釋放而又不殺死細(xì)胞的最佳平衡點(diǎn)。有效釋放而又不殺死細(xì)胞的最佳平衡點(diǎn)。 （2 2）顯微注射法）顯微注射法 該法雖然費(fèi)力，但卻是

16、非常有效的將核酸導(dǎo)人細(xì)胞或細(xì)該法雖然費(fèi)力，但卻是非常有效的將核酸導(dǎo)人細(xì)胞或細(xì)胞核的方法。這種方法常用來(lái)制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，但不適用于胞核的方法。這種方法常用來(lái)制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，但不適用于需要大量轉(zhuǎn)染細(xì)胞的研究。需要大量轉(zhuǎn)染細(xì)胞的研究。（3 3）基因槍法）基因槍法 該法依靠攜帶了核酸的高速粒子而將核酸導(dǎo)人細(xì)胞內(nèi)，該法依靠攜帶了核酸的高速粒子而將核酸導(dǎo)人細(xì)胞內(nèi)，這種方法適用于培養(yǎng)的細(xì)胞和在體的細(xì)胞。這種方法適用于培養(yǎng)的細(xì)胞和在體的細(xì)胞。 3.病毒感染法病毒感染法 病毒顆粒是一類(lèi)十分有效的基因釋放系統(tǒng)，病毒顆粒是一類(lèi)十分有效的基因釋放系統(tǒng)，因此，它是將外源基因?qū)舜罅考?xì)胞最有效的因此，它是將外源基因?qū)舜?/p>

17、量細(xì)胞最有效的方法。病毒感染具有高效率、可穩(wěn)定遺傳、適方法。病毒感染具有高效率、可穩(wěn)定遺傳、適用于各種不同來(lái)源的細(xì)胞及操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。用于各種不同來(lái)源的細(xì)胞及操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。但多數(shù)病毒有其潛在的危險(xiǎn)性，操作者需要有但多數(shù)病毒有其潛在的危險(xiǎn)性，操作者需要有一定的病毒操作經(jīng)驗(yàn)和良好的設(shè)施。一定的病毒操作經(jīng)驗(yàn)和良好的設(shè)施。 （1 1）逆轉(zhuǎn)錄病毒）逆轉(zhuǎn)錄病毒 （2 2）腺病毒）腺病毒三、基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的應(yīng)用三、基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的應(yīng)用（一）轉(zhuǎn)基因植物（一）轉(zhuǎn)基因植物（二）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（二）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（三）生物制藥（三）生物制藥（四）基因治療（四）基因治療（五）（五）RNAi技術(shù)技術(shù)（一）轉(zhuǎn)基因植物（一）轉(zhuǎn)基因植

18、物1.轉(zhuǎn)基因植物的發(fā)展簡(jiǎn)史轉(zhuǎn)基因植物的發(fā)展簡(jiǎn)史2.轉(zhuǎn)基因植物類(lèi)型轉(zhuǎn)基因植物類(lèi)型1.轉(zhuǎn)基因植物的發(fā)展簡(jiǎn)史轉(zhuǎn)基因植物的發(fā)展簡(jiǎn)史（1）1983年，世界第一例轉(zhuǎn)基因植物 煙草問(wèn)世（2）19962005年，全世界轉(zhuǎn)基因植物在21個(gè)國(guó)家種植，面積從1996年的170萬(wàn)公頃增加到2005年的9 000萬(wàn)公頃（3）全世界轉(zhuǎn)基因作物僅種子銷(xiāo)售額到2005年已達(dá)52.5億美元，是1995年的63倍2.轉(zhuǎn)基因植物類(lèi)型轉(zhuǎn)基因植物類(lèi)型（1）抗除草劑基因）抗除草劑基因（2）抗蟲(chóng)基因）抗蟲(chóng)基因（3）抗病基因）抗病基因（4）抗逆境基因）抗逆境基因（5）改良品質(zhì)基因）改良品質(zhì)基因（二）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（二）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物1.轉(zhuǎn)基因小鼠轉(zhuǎn)

19、基因小鼠2.轉(zhuǎn)基因牛轉(zhuǎn)基因牛3.轉(zhuǎn)基因豬轉(zhuǎn)基因豬4.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物疾病模型轉(zhuǎn)基因動(dòng)物疾病模型轉(zhuǎn)基因動(dòng)物疾病模型轉(zhuǎn)基因動(dòng)物疾病模型1.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與心血管疾病轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與心血管疾病 a.與動(dòng)脈粥樣硬化和脂質(zhì)代謝有關(guān)的如LDL受體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可增強(qiáng)LDL的清除； b. apoE3基因轉(zhuǎn)基因鼠可增強(qiáng)LDL的清除，而突變的apoE則誘發(fā)高脂血癥，apoE4與apoE7轉(zhuǎn)基因鼠還出現(xiàn)學(xué)習(xí)與記憶能力降低、誘發(fā)腫瘤以及脾臟、腎臟腫大等。2.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與高血壓轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與高血壓 與血壓調(diào)控有關(guān)的如reninangiotensinogen轉(zhuǎn)基因鼠模型出現(xiàn)高血壓，用于研究RAS (reninangiotensinogen

20、 system) 中各成分致高血壓的作用以及相互關(guān)系3.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與乙型肝炎轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與乙型肝炎 乙型肝炎是目前流行廣泛、危害嚴(yán)重的病毒性傳染病。由于一般實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)HBV不易感，目前發(fā)現(xiàn)能夠感染HBV的動(dòng)物只有靈長(zhǎng)類(lèi)，因此使得對(duì)HBV致病機(jī)理的研究很難用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法來(lái)進(jìn)行。HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的建立，為探討HBV的致病機(jī)理提供了有價(jià)值的動(dòng)物模型4.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與腫瘤研究轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與腫瘤研究 轉(zhuǎn)基因鼠腫瘤模型能很好地模擬體內(nèi)的生理、病理環(huán)境，與所要研究腫瘤的發(fā)生過(guò)程具有較好的一致性，而且可模擬部分癌前病變。（三）生物制藥（三）生物制藥1.細(xì)菌細(xì)胞2.酵母細(xì)胞3.昆蟲(chóng)細(xì)胞4.哺乳動(dòng)物細(xì)胞5.動(dòng)物乳腺反

21、應(yīng)器動(dòng)物乳腺反應(yīng)器動(dòng)物乳腺反應(yīng)器 是指利用動(dòng)物乳腺特異性啟動(dòng)子調(diào)控元件指導(dǎo)外源基因在乳腺中特異性表達(dá)，并能從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳汁中獲取重組蛋白的一種生物反應(yīng)器。特點(diǎn)： 1.對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的影響小 2.產(chǎn)量大，產(chǎn)品易提純，質(zhì)量高 3.表達(dá)產(chǎn)物生物活性穩(wěn)定 4.易于擴(kuò)群，進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn) 5.縮短新藥上市周期 6.可以獲取巨額經(jīng)濟(jì)利潤(rùn)（四）基因治療（四）基因治療 1.基因治療基因治療(gene therapy) 是指將外源功能性目的基因?qū)氩∪梭w內(nèi)，通過(guò)調(diào)控目的基囚表達(dá)，抑制、替代或補(bǔ)償缺陷基囚，從而恢復(fù)細(xì)胞、組織或器官的生理功能，達(dá)到疾病治療目的的一種方法 2.治療方式：治療方式： （1）基因直接注射法）

22、基因直接注射法(in vivo)： 即經(jīng)靜脈或肌肉直接將帶存外源DNA的病毒、脂質(zhì)體或裸露的DNA注入患者有關(guān)組織，使其進(jìn)入相應(yīng)的細(xì)胞并表達(dá)。 （2）體外基因轉(zhuǎn)移再回輸體內(nèi)的方法）體外基因轉(zhuǎn)移再回輸體內(nèi)的方法(ex vivo)： 即將患者的體細(xì)胞(如T淋巴細(xì)胞)取出在體外培養(yǎng)并導(dǎo)入外源目的基因后重新輸回患者體內(nèi)。3.基因治療的策略基因治療的策略（1）基因置換（2）基因補(bǔ)償（3）基因失活（4）免疫基因治療（5）活化前體藥物基因治療（6）耐藥基因治療（五）（五）RNAi技術(shù)技術(shù)The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006RNAi一、一、RNAi早期研

23、究和理論形成早期研究和理論形成二、參與二、參與RNAi的重要分子的重要分子三、三、 RNAi作用機(jī)制作用機(jī)制一一 、 RNAiRNAi早期研究和理論形成早期研究和理論形成 ( (一一) )、RNAiRNAi早期研究早期研究 1、牽?；▽?shí)驗(yàn) 1990年，Arizona大學(xué)的Rich教授在轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)室將紫色素基因?qū)胫涟珷颗；ㄖ参?，目的是想通過(guò)增加紫色素基因拷貝獲得具有更多的紫紅色的矮牽牛。結(jié)果出乎意外，增加花瓣紫色的著色失敗，一些轉(zhuǎn)基因的花出現(xiàn)全白或部分白花，色素合成不是增加了，而是減少了，事實(shí)上，不僅導(dǎo)入的基因未被表達(dá)，反而植物本身的基因也失活或受到某種程度的限制。這種現(xiàn)象稱(chēng)為共抑制（共抑制（

24、cosuppression)現(xiàn)象。 山西醫(yī)科大學(xué)生化教研室372.秀麗線蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)秀麗線蟲(chóng)實(shí)驗(yàn) 1995年，Cornell大學(xué)Su Guo和Kemphues試圖以反義RNA技術(shù)特異性地阻斷秀麗線蟲(chóng)par-1基因的表達(dá)以研究其功能。發(fā)現(xiàn)，給線蟲(chóng)注射par-1的反義RNA時(shí)，如預(yù)期那樣阻斷了該基因的表達(dá)；但當(dāng)給對(duì)照組注射正義RNA以期觀察到該基因表達(dá)增強(qiáng)時(shí)，卻發(fā)現(xiàn)par-1基因同樣也被抑制了。3.粗糙脈孢菌實(shí)驗(yàn)粗糙脈孢菌實(shí)驗(yàn) 1997年，意大利Cogoni等，將外源類(lèi)胡蘿卜素基因?qū)胝婢植诿}孢菌（結(jié)果引起30%被轉(zhuǎn)化的脈孢自身基因失活，轉(zhuǎn)化細(xì)胞中內(nèi)源性胡蘿卜素基因也受到了抑制，這種基因失活形式稱(chēng)之為

25、抑制（抑制（ quelling, 基因壓制）?；驂褐疲?。 早期的三個(gè)實(shí)驗(yàn)，牽?；▽?shí)驗(yàn)和粗糙脈孢菌實(shí)驗(yàn)已經(jīng)做出了有意義的結(jié)果，但都沒(méi)有繼續(xù)研究。 其中以秀麗線蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)有最有意義，因?yàn)樵谶@個(gè)實(shí)驗(yàn)中給線蟲(chóng)注射了正義RNA和反義RNA，但就是沒(méi)有注射二者結(jié)合起來(lái)的雙連RNA。而RNAi理論形理論形成的形成正是基于后者。成的形成正是基于后者。（二）RNAi理論形成理論形成1. RNAi理論理論2. RNAi概念概念Discovery of RNAiDouble-stranded RNAinjectC. elegansNeg. control UninjectedAntisense RNA dsRNAsenseantisenseNature 1998, 391:806-811Mex-3 mRNA detection in e