實驗二、植物葉綠素含量測定----丙酮提取法

1、二、植物葉綠素含量測定-丙酮提取法高等植物光合作用過程中利用的光能是通過葉綠體色素(光合色素)吸收的。葉綠體色素由葉綠素a、葉綠素b、胡蘿卜素和葉黃素組成。葉綠體色素的提取、分離和測定是研究它們的特性以及在光合中作用的第一步。葉片葉綠素含量與光合作用密切相關，是反眏葉片生理狀態(tài)的重要指標。在植物光合生理、發(fā)育生理和抗性生理研究中經(jīng)常需要測定葉綠素含量。葉綠素含量也是指導作物栽培生產(chǎn)和選育作物品種的重要指標。原理葉綠素不溶于水，溶于有機溶劑，可用多種有機溶劑，如丙酮、乙醇或二甲基亞砜等研磨提取或浸泡提取。葉綠色素在特定提取溶液中對特定波長的光有最大吸收，用分光光度計測定在該波長下葉綠素溶液的吸光

2、度(也稱為光密度)，再根據(jù)葉綠素在該波長下的吸收系數(shù)即可計算葉綠素含量。利用分光光計測定葉綠素含量的依據(jù)是Lambert-Beer定律，即當一束單色光通過溶液時，溶液的吸光度與溶液的濃度和液層厚度的乘積成正比。其數(shù)學表達式為：A=Kbc式中： A為吸光度；K為吸光系數(shù)；b為溶液的厚度；c為溶液濃度。葉綠素a、b的丙酮溶液在可見光范圍內(nèi)的最大吸收峰分別位于663、645nm處。葉綠素a和b在663nm處的吸光系數(shù)（當溶液厚度為1cm，葉綠素濃度為gL-1時的吸光度）分別為82.04和9.27；在645nm處的吸光系數(shù)分別為16.75和45.60。根據(jù)Lambert-Beer定律,葉綠素溶液在66

3、3nm和645nm處的吸光度（A663和A645）與溶液中葉綠素a、b和總濃度（a+b）（Ca、Cb 、Ca十b，單位為gL-1），的關系可分別用下列方程式表示：A663=82.04Ca+9.27Cb （1）A645=16.76Ca+45.60Cb （2）解方程（1）和（2）得：Ca=12.7 A6632.59 A645 (3)Cb=22.9 A6454.67 A663 (4)Ca十b20.3 A6458.04 A663 (5)從公式（3）、（4）、（5）可以看出，只要測得葉綠素溶液在663nm和645nm處的吸光度，就可計算出提取液中的葉綠素a、b濃度和葉綠素總濃度（a+b）。在652nm處

4、，葉綠素a和b的吸光系數(shù)相同，因此提取液中葉綠素的總濃度（a+b）也可通過測定溶液在波長652nm處的吸光度（A652）求得，其計算公式為：A6521000Ca十b （6）式中：34.5為葉綠素a和b在波長652nm處的吸光系數(shù)。但Inskeep等（1985）認為葉綠素a和b吸光系數(shù)相等時的波長位于吸收光譜斜率很陡的位置上，因此儀器波長很小的偏差都可能導致很大的測定誤差。所測定材料的單位面積或單位重量的葉綠素含量可按下式進行計算：CVA1000葉綠素含量（mgg-1或mgdm-2）= （7）式中：C為葉綠素濃度（mgL-1）或mgdm-2）；V為提取液總體積（ml）；A為取樣鮮重（g）或取樣面

5、積（dm-2）。材料、儀器、藥品1材料：植物綠色葉片。在本實驗中利用光合速率測定實驗中取回室內(nèi)的綠色半葉和黃色半葉為試材。2儀器：(1) 分光光度計；（2）天平；(3) 研缽；(4) 濾紙；(5) 漏斗；(6) 5ml移液管；(7) 打孔器；（8）滴管；（9）剪刀；（10）25ml容量瓶；（11）毛刷；（12）擦鏡紙。方法1取樣：用毛筆或毛刷清除葉片表面的灰塵，用打孔器從綠葉和黃葉上各打取0.25dm-2的葉圓片，立即稱重，剪碎后放入研缽中。（在正規(guī)實驗中應各重復3次，本實驗為減少丙酮向環(huán)境中的排放，故不設重復）。注意取樣時要避開大的葉脈。如果需要計算葉片干樣葉綠素含量，另取一份相同樣品置于烘

6、箱中烘干，用于測定干重。2研磨提?。合蜓欣徶屑尤?0%丙酮2.5ml，以及少許CaCO3 (中和酸性，防止葉綠素酯酶分解葉綠素) 和石英砂，研磨成勻漿，再加入3ml 80%丙酮，繼續(xù)研磨至組織變白，在暗處靜止35min后，用一層干濾紙過濾到25ml容量瓶中，用滴管吸取80%丙酮將研缽洗凈，清洗液也要過濾到容量瓶中，并用80%丙酮沿濾紙的周圍洗脫色素，待濾紙和殘渣全部變白后，用80%丙酮定容至刻度。3讀取吸光度：取厚度為lcm的潔凈比色皿，注意不要用手接觸比色皿的光面，先用少量色素提取液清洗23次，注意清洗時要使清洗液接觸比色皿內(nèi)壁的所有部分，然后將色素提取液倒入比色皿中，液面高度約為比色皿高度

7、的4/5，將撒在比色皿外面的溶液用濾紙吸掉（注意不能擦），再用擦鏡紙擦干擦凈。將比色皿放入儀器的比色皿架上，注意不要將溶液撒入儀器內(nèi)。第一個位置放盛有80%丙酮的比色皿，做為空白對照。將儀器波長分別調(diào)至663、645、652nm處，以80%丙酮做為空白對照調(diào)透光率100%，分別測定溶液在上述三個波長下的吸光度。每個樣品重復測定3次。注意，每次在轉換波長時，都要用80%丙酮調(diào)透光率100%。4結果計算：將645、663、652nm處測得的吸光度代入公式（3）、（4）、（5）、（6）中計算葉綠素a、b濃度和總濃度。再將葉綠素a、b濃度和總濃度代入公式（7）中求出所測材料單位重量或單位面積的葉綠素a、b含量和總含量。實驗結