定磷法測(cè)定核酸的含量

1、定磷法測(cè)定核酸的含量核酸, 含量, 測(cè)定【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹空莆斩追y(cè)定核酸含量的原理和方法【實(shí)驗(yàn)原理】核酸分子結(jié)構(gòu)中含有一定比例的磷(RNA含磷量約為8.5%9.0%，DNA含磷量約為9.2%)，測(cè)定其含磷量即可求出核酸的量。核酸分子中的有機(jī)磷經(jīng)強(qiáng)酸消化后形成無(wú)機(jī)磷，在酸性條件下,無(wú)機(jī)磷與鉬酸銨結(jié)合形成黃色磷鉬酸銨沉淀，其反應(yīng)為：在還原劑存在的情況下,黃色物質(zhì)變成藍(lán)黑色,稱為鉬藍(lán)。在一定濃度范圍內(nèi)，藍(lán)色的深淺與磷含量成正比，可用比色法測(cè)定。若樣品中尚含有無(wú)機(jī)磷，需作對(duì)照測(cè)定，消除無(wú)機(jī)磷的影響，以提高準(zhǔn)確性。【實(shí)驗(yàn)材料】恒溫水浴,721分光光度計(jì)（1）標(biāo)準(zhǔn)磷溶液：將磷酸二氫鉀于110烘至恒重，準(zhǔn)確稱

2、取0.8775g溶于少量蒸餾水中，轉(zhuǎn)移至500ml容量瓶中，加入5ml5molL硫酸溶液及氯仿數(shù)滴，用蒸餾水稀釋至刻度。此溶液每1m1含磷400g，臨用時(shí)準(zhǔn)確稀釋20倍(20gm1)。（2）定磷試劑17硫酸：17m1濃硫酸(相對(duì)密度l.84)緩緩加入到83m1水中。2.5鉬酸銨溶液：2.5g鉬酸銨溶于100ml水。10抗壞血酸溶液：10g抗壞血酸溶于100ml水，并貯存于棕色瓶中，溶液呈淡黃色尚可使用，呈深黃甚至棕色即失效。臨用時(shí)將上述三種溶液與水按如下比例混合：溶液(1):溶液(2):溶液(3):水=1:1:1:2(V:V)（3）5%氨水,27%硫酸【實(shí)驗(yàn)操作】1磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取干燥試管7

3、支編號(hào)，按表所示加入試劑。試劑管號(hào)0123456磷標(biāo)準(zhǔn)溶液，ml0.00.050.10.20.30.40.5蒸餾水，ml3.02.950.92.80.72.62.5定磷試劑，ml3.03.03.03.03.03.03.0A660加畢搖勻，在45水浴中保溫10min，冷卻，以零號(hào)管調(diào)零點(diǎn)，于660nm處測(cè)吸光度。以磷含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖。2總磷的測(cè)定稱粗核酸0.1g，用少量水溶解(若不溶，可滴加5%氨水至pH7.0)，待全部溶解后，移至50ml容量瓶中，加水至刻度(此溶液含樣品2mg/m1)，即配成核酸溶液。吸取上述核酸溶液1.0ml，置大試管中，加入2.5m127%硫酸及一粒玻璃珠

4、，于通風(fēng)櫥內(nèi)直火加熱至溶液透明(切勿燒干)，表示消化完成。冷卻后取下，將消化液移入100ml容量瓶中，以少量蒸餾水洗滌試管兩次，洗滌液一并倒入容量瓶，再加蒸溜水至刻度，混勻后吸取3m1溶液置試管中，加3m1定磷試劑，45水浴保溫10min后取出,測(cè)A660。3無(wú)機(jī)磷的測(cè)定吸取核酸溶液1ml，置于100ml容量瓶中，加水至刻度，混勻后吸取3.0ml置試管中，加定磷試劑3.0m1，45水浴中保溫10min后取出,測(cè)A660。4結(jié)果處理總磷A660無(wú)機(jī)磷A660=有機(jī)磷A660從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出有機(jī)磷微克數(shù)(X)，按下式計(jì)算樣品中核酸百分含量【實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論】定磷法即可以測(cè)定DNA的含量又可以測(cè)定RNA

5、的含量，若DNA中混有RNA或RNA中混有DNA，都會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。核酸的定量測(cè)定定磷法原理磷的測(cè)定方法很多，F(xiàn)iske-Subbarow定磷法是一經(jīng)典的但至今仍被經(jīng)常采用的方法，它具有靈敏、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。各種含磷有機(jī)物經(jīng)硫酸或過(guò)氯酸水解，使有機(jī)磷消化成為無(wú)機(jī)磷。無(wú)機(jī)磷在酸性條件下，與鉬酸鹽（常用鉬酸銨或鉬酸鈉）反應(yīng)生成磷鉬酸鹽絡(luò)合物。用還原劑處理，磷鉬酸鹽絡(luò)合物被還原生成鉬藍(lán)，在660nm處有最大光吸收峰。在一定濃度范圍內(nèi)，顏色的深淺與磷含量成正比關(guān)系。因此可應(yīng)用分光光度法進(jìn)行磷的定量測(cè)定?；瘜W(xué)反應(yīng)式：(NH4)2MoO4 + H2SO4 H2MoO4 + (NH4)2SO4H3PO4 +

6、 12H2MoO4 H3P (Mo3O10)4 + 12H2O還原劑H3P (Mo3O10)4 Mo2O3 MoO3核酸是一類含磷化合物，其分子含有一定比例的磷，一般純的RNA及其核苷酸含磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9.0%；DNA及其核苷酸含磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9.2%，即每100g核酸含有9.09.2g磷，也就是核酸量是含磷量的11倍左右，故測(cè)得磷的量，即可求得核酸量。這就是定磷法的理論依據(jù)，磷的定量測(cè)定是測(cè)定核酸含量常用手段之一。生物有機(jī)磷材料中有時(shí)含有無(wú)機(jī)磷雜質(zhì)，故用定磷法來(lái)測(cè)定該有機(jī)磷物質(zhì)的量時(shí)，必須分別測(cè)定該樣品的總磷量，即樣品經(jīng)過(guò)消化以后所測(cè)得的含磷量，以及該樣品的無(wú)機(jī)磷含量，即樣品未經(jīng)消化直接測(cè)得的含

7、磷量。將總磷量減去無(wú)機(jī)磷才是該有機(jī)磷物質(zhì)的含磷量。 方法和步驟 磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取試管7支，06依次編號(hào)。按下表加入各試劑。注意每加好一種試劑后應(yīng)立即搖勻。各反應(yīng)液加畢后，于30保溫20min，置分光光度計(jì)中在波長(zhǎng)660nm比色，測(cè)光吸收值。以磷含量為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)作圖，即得定磷標(biāo)準(zhǔn)曲線。 2、總磷量的測(cè)定取30毫升凱氏燒瓶2只，、依次編號(hào)，號(hào)瓶為空白對(duì)照，用刻度吸管準(zhǔn)確吸取核糖核酸樣液1.0mL，置于號(hào)凱氏燒瓶?jī)?nèi)，號(hào)瓶加入蒸餾水1.0mL，不加樣液，兩瓶分別加入6mol/L硫酸1.0mL置消化架用小火加熱消化，待溶液呈褐色，稍加冷卻，加入2 mol/L硝酸2滴，再繼續(xù)加熱，直至逸出

8、白色煙霧，溶液無(wú)色透明，表示消化完成時(shí)為止。待凱氏燒瓶冷卻后，分別加入1.0mL蒸餾水，置沸水浴蒸煮5min，使焦磷酸分解。凱氏燒瓶從沸水浴中取出，待其冷卻，將和號(hào)瓶?jī)?nèi)的消化液分別移入兩只10毫升容量瓶中，用少量蒸餾水洗滌凱氏燒瓶?jī)纱?，并將洗滌液一并倒入容量瓶?jī)?nèi)，再各加蒸餾水稀釋至刻度。 取試管3支，按79依次編號(hào)，7號(hào)管為空白對(duì)照。準(zhǔn)確吸取空白對(duì)照液1.0mL，置于7號(hào)管內(nèi)，再分別準(zhǔn)確吸取號(hào)瓶經(jīng)過(guò)消化的核糖核酸樣液1.0mL，置于8、9號(hào)管內(nèi)，以下操作與磷標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制相同。測(cè)出光密度，即可由繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線查得核糖核酸經(jīng)消化稀釋后的總磷量。3、無(wú)機(jī)磷的測(cè)定取試管3支，按1012依次編號(hào)，10號(hào)管為空白對(duì)照。用刻度吸管分別準(zhǔn)確吸取未經(jīng)消化的核糖核酸液1.0mL，作為無(wú)機(jī)磷測(cè)定樣液，置于11、12號(hào)管內(nèi)，空白管以蒸餾水代替RNA液，以下操作與磷標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制相同。測(cè)出光密度，即可由繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線查得無(wú)機(jī)磷含量。若溶液渾濁，影響測(cè)定光密度，可在加入試