腦脈通有效部位中總生物堿的含量測(cè)定

1、腦脈通有效部位中總生物堿的含量測(cè)定                     作者：王淑美，馮素香，李淑芳，高淑娟,李建生【摘要】  目的 建立腦脈通有效部位中總生物堿的含量測(cè)定方法。方法 采用酸性染料比色法，以溴甲酚綠緩沖液作為生物堿的顯色劑，測(cè)定樣品溶液在417 nm波長(zhǎng)處的吸收度。 結(jié)果 對(duì)照品川芎嗪質(zhì)量濃度在0.0310.153 mg/mL的范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系,r=0.

2、9998。平均回收率為100.95，RSD為1.75。精密度和穩(wěn)定性良好。結(jié)論 酸性染料比色法靈敏、快速、準(zhǔn)確，可用于腦脈通有效部位中總生物堿的含量測(cè)定。 【關(guān)鍵詞】  腦脈通；總生物堿；酸性染料比色法Abstract:Objective To establish a method for the determination of the content of total alkaloid in Nao Mai Tong recipe.Methods Acid dye colorimetry was used in the determination with bromocresol

3、 green buffer solution as the color developing agent with absorbance was determined at the detection wavelength of 417 nm.Results The calibration curve of the absorbance was linear with the concentration of ligustrazine in the range of 0.0310.153 mg/mL(r=0.9998).The average recovery of ligustrazine

4、was 100.95,RSD=1.75%. Conclusion The method is accurate，sensitive,and can be applied to determine total alkaloid in Nao Mai Tong recipe.Key words:Nao Mai Tong recipe；total alkaloid；acid Dye colorimetry腦脈通由大黃?p川芎?p葛根等組成，具有解毒降濁?p益氣活血?p滌痰開(kāi)竅?p瀉下之功。該方治療腦梗死效果明顯，可明顯改善生活質(zhì)量1，對(duì)腦缺血再灌注損傷有明顯的保護(hù)作用2,3。為有效控制腦脈通的質(zhì)量，

5、本文采用酸性染料比色法測(cè)定該制劑中總生物堿的含量4，方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好，為腦脈通的質(zhì)量控制提供了可行的方法。1  儀器與試藥    METTLER-AE240型1/100000電子分析天平（瑞士梅特勒公司），RE52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠(chǎng)），KQ-100型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，UV-2201SHIMADZU型分光光度計(jì)（日本島津）。    大黃、川芎、葛根等藥材購(gòu)自河南省藥材公司，經(jīng)河南中醫(yī)學(xué)院陳隨清教授鑒定分別為蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatum L.的干燥根及根莖，

6、豆科植物野葛Pueraria lobata(Wild.) Ohwi的干燥根，傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根莖。川芎嗪對(duì)照品（供含量測(cè)定用，批號(hào)：817-200104）購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。其余試劑均為分析純。    溴甲酚綠緩沖液的配制：精密稱(chēng)取溴甲酚綠125 mg，用0.2 mol/L的NaOH 12.5 mL溶解后，加入鄰苯二甲酸氫鉀2.55 g，加少量蒸餾水溶解后，轉(zhuǎn)移至250 mL的容量瓶中，用蒸餾水稀釋將至刻度，搖勻，0.2 mol/L的NaOH調(diào)pH4.8，備用。   

7、腦脈通有效部位樣品的制備：按照腦脈通處方比例稱(chēng)取藥材粗粉，用10倍量Q%乙醇回流提取2次，每次1 h，合并乙醇提取液，減壓回收乙醇至無(wú)醇味，提取液用6倍量蒸餾水分散后，用大孔吸附樹(shù)脂處理，P%乙醇洗脫至洗脫液約為樹(shù)脂體積的8倍為止，即得有效部位樣品。2  方法與結(jié)果2.1  溶液的制備    對(duì)照品溶液的制備：精密稱(chēng)取鹽酸川芎嗪對(duì)照品6.10  mg至10 mL的容量瓶中，用三氯甲烷溶解并稀釋至刻度，即得0.610 mg/mL的鹽酸川芎嗪對(duì)照品溶液。    供試品溶液的制備：精密稱(chēng)取有效部位樣品0.3 g

8、，加少量的水使溶解，超聲2 min，再加入25%的鹽酸使溶液的pH值為23，用乙酸乙酯萃取至乙酸乙酯層近無(wú)色，分取酸層，用氨水調(diào)溶液pH值910，再用三氯甲烷萃取5次（20，20，20，15，15 mL），合并三氯甲烷層，減壓蒸干，三氯甲烷溶解轉(zhuǎn)移至5 mL的容量瓶中，并稀釋至刻度。    陰性樣品溶液的制備：按處方比例分別稱(chēng)取除川芎外其他藥材適量,按有效部位制備工藝制得缺川芎的陰性樣品，按照供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液。2.2  測(cè)定波長(zhǎng)的選擇    精密吸取川芎嗪對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各1 mL分別置

9、分液漏斗中，加入溴甲酚綠緩沖液7 mL和三氯甲烷10 mL振搖2 min，靜置2 h,分取三氯甲烷層，并定容至10 mL。同法制得空白溶液。以空白為參比，400700 nm范圍內(nèi)掃描測(cè)定吸收光譜，結(jié)果表明，樣品與對(duì)照品均在417 nm處有最大吸收，故選擇測(cè)定波長(zhǎng)為417 nm。圖1  川芎嗪對(duì)照品溶液顯色后吸收光譜（略）Fig.1  UV Spectra of ligustrazine圖2  供試品溶液顯色后吸收光譜（略）Fig.2  UV Spectra of sample圖3  陰性樣品溶液顯色后吸收光譜（略）Fig.3  UV

10、Spectrum of negative sample2.3  顯色條件的考察2.3.1  緩沖溶液pH值的考察  精密吸取供試品溶液6份，每份1 mL，置分液漏斗中，分別加入pH3.0、3.6、4.2、4.8、5.4、5.8 mL的溴甲酚綠緩沖液，按“2.2”項(xiàng)方法測(cè)定溶液的吸光度。結(jié)果表明，用pH值4.8的溴甲酚綠緩沖液顯色，吸光度最大。2.3.2  酸性染料用量考察  精密吸取供試品溶液5份，每份1 mL，分別加入溴甲酚綠緩沖液4、5、6、7 mL和8 mL，按“2.2”法測(cè)定吸光度。結(jié)果表明，溴甲酚綠緩沖液用量為7 mL時(shí)，已能使生物堿

11、與其完全結(jié)合，被充分萃取，吸光度最大，再增加用量，反而會(huì)因空白溶液顏色加深，導(dǎo)致吸光度下降。2.3.3  三氯甲烷用量的考察  精密吸取供試品溶液6份，每份1 mL，分別加入溴甲酚綠緩沖液7 mL，再分別加入三氯甲烷8、9、10、12、14、16 mL，劇烈振搖2 min，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，靜置2 h，分取三氯甲烷層，定容至10 mL,依法測(cè)定吸光度。結(jié)果表明，三氯甲烷的用量超過(guò)10 mL后，吸光度基本穩(wěn)定。說(shuō)明生物堿與酸性染料的配合物已基本萃取完全。2.4  顯色穩(wěn)定性試驗(yàn)    取“2.2”項(xiàng)下顯色后的供試品溶液，分別放置0、1、

12、2、3、4 h后，于417 nm處測(cè)定吸光度，結(jié)果表明，三氯甲烷萃取液放置4 h內(nèi)基本穩(wěn)定，吸光度RSD為0.40%。2.5  線(xiàn)性關(guān)系試驗(yàn)    精密吸取川芎嗪對(duì)照品溶液（0.61 mg/mL）0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL照“2.2”項(xiàng)下的方法于417 nm處測(cè)定吸光度。以川芎嗪對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程：C=0.2952A-0.0054（r=0.9998），表明川芎嗪在0.0310.153 mg/mL的范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。2.6  精密度試驗(yàn) 

13、;   精密吸取川芎嗪對(duì)照品溶液（0.61 mg/mL）1 mL，按“2.2”項(xiàng)方法于417 nm連續(xù)測(cè)定6次，記錄吸光度，計(jì)算RSD為0.53%，表明儀器精密度符合要求。2.7  重復(fù)性試驗(yàn)    取5份同一批有效部位樣品約0.3 g精密稱(chēng)定，按“2.1”項(xiàng)方法處理供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)方法顯色后于417 nm處測(cè)定吸光度，并計(jì)算含量的RSD為2.67%，表明樣品制備和測(cè)定誤差符合要求，本實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性良好。2.8  樣品穩(wěn)定性的考察    取有效部位樣品約0.3 g，精密稱(chēng)定，按“2.1

14、”項(xiàng)方法制備樣品溶液，分別于顯色后0、2、4、6、8、10 h后，依法測(cè)定吸光度，計(jì)算其含量，結(jié)果表明溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定，RSD為1.11%。2.9  回收率試驗(yàn)       取5份同一批有效部位樣品各0.15 g，精密稱(chēng)定，分別精密加入濃度為0.84 mg/mL的川芎嗪對(duì)照品溶液2 mL，低溫干燥后，按“2.1”項(xiàng)方法制備樣品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下方法于415 nm處顯色測(cè)定吸光度，計(jì)算其含量，結(jié)果總生物堿的平均回收率為100.95%，RSD為1.75%，結(jié)果見(jiàn)表1。表1  總生物堿回收率試驗(yàn)結(jié)果（略）Tab.

15、1  Results of recovery test2.10  樣品的含量測(cè)定    取3批有效部位樣品，每份約0.3 g，精密稱(chēng)定，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，最后定容至10 mL的容量瓶中。精密吸取供試品溶液1 mL，再按“2.2”項(xiàng)下方法于417 nm處顯色測(cè)定吸光度，計(jì)算其含量，結(jié)果見(jiàn)表1。表2  樣品含量測(cè)定結(jié)果（略）Tab.2  Contents of sample3  討論3.1  酸性染料比色法是測(cè)定生物堿的常用方法之一 5，可用于川芎藥材總生物堿的含量測(cè)定。我們通過(guò)參考相關(guān)文獻(xiàn)

16、，采用溴甲酚綠緩沖液作為生物堿的顯色劑，并對(duì)顯色劑的用量及顯色的穩(wěn)定性等影響因素均做了考察，篩選出最佳方案，可以在一定程度上保證測(cè)定結(jié)果的重現(xiàn)、穩(wěn)定和準(zhǔn)確可靠。3.2  在測(cè)定過(guò)程中發(fā)現(xiàn)陰性樣品在422 nm處有干擾，將pH調(diào)節(jié)為酸性質(zhì)，再分別用乙醚和乙酸乙酯萃取，結(jié)果乙醚萃取陰性仍有干擾，而乙酸乙酯萃取陰性無(wú)干擾。故選擇乙酸乙酯為萃取溶劑。3.3  建立了腦脈通有效部位中總生物堿的含量測(cè)定方法，3批樣品的含量測(cè)定結(jié)果，腦脈通有效部位中總生物堿含量為1.09%1.12%,轉(zhuǎn)移率為75.19%76.41?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 李建生,郭明冬.腦脈通顆粒治療急性腦梗塞的臨床療效評(píng)價(jià)J.華中醫(yī)藥雜志,