第3章凱氏定氮法

1、CompanyLOGO第第3章章發(fā)酵原料中粗蛋白質(zhì)的測定發(fā)酵原料中粗蛋白質(zhì)的測定Company L發(fā)酵原料中粗蛋白質(zhì)的測定發(fā)酵原料中粗蛋白質(zhì)的測定v教學(xué)重點: 掌握方法的原理、測定步驟；掌握方法的原理、測定步驟； 掌握消化蒸餾、滴定操作技術(shù)掌握消化蒸餾、滴定操作技術(shù); ; 學(xué)會使用凱氏定氮儀學(xué)會使用凱氏定氮儀. .v教學(xué)難點: 消化蒸餾、滴定操作技術(shù)及消化蒸餾、滴定操作技術(shù)及測定過程的注意事項。測定過程的注意事項。 Company L發(fā)酵原料中粗蛋白質(zhì)的測定發(fā)酵原料中粗蛋白質(zhì)的測定v一、目的和意義食物中蛋白質(zhì)含量是了解人體蛋白質(zhì)食物中蛋白質(zhì)含量是了解人體蛋白質(zhì)攝入量的基礎(chǔ)資料。蛋白質(zhì)含量的高低

2、對攝入量的基礎(chǔ)資料。蛋白質(zhì)含量的高低對產(chǎn)品質(zhì)量影響重大，是評價原料及成品質(zhì)產(chǎn)品質(zhì)量影響重大，是評價原料及成品質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。量的重要指標(biāo)之一。Company L發(fā)酵原料中粗蛋白質(zhì)的測定發(fā)酵原料中粗蛋白質(zhì)的測定一類：利用蛋白一類：利用蛋白質(zhì)的共性即質(zhì)的共性即含氮含氮量量、肽鍵和折射、肽鍵和折射率等測定蛋白質(zhì)率等測定蛋白質(zhì)含量；含量；蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的測定方法測定方法另一類：利用蛋白質(zhì)另一類：利用蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基、酸中的氨基酸殘基、酸性和堿性基因以及芳性和堿性基因以及芳香基團等測定蛋白質(zhì)香基團等測定蛋白質(zhì)含量。含量。Company L5.5.紅外檢測儀紅外檢測儀4.4.酚試劑法酚試劑法2.2

3、.雙縮脲分光光度比色法雙縮脲分光光度比色法1.1.凱氏定氮法凱氏定氮法蛋白質(zhì)的測定方法蛋白質(zhì)的測定方法3.3.染料結(jié)合分光光度比色法染料結(jié)合分光光度比色法Company L發(fā)酵原料中粗蛋白質(zhì)的測定發(fā)酵原料中粗蛋白質(zhì)的測定v一般食品蛋白質(zhì)含氮量為一般食品蛋白質(zhì)含氮量為10左右，動植物原料左右，動植物原料中蛋白質(zhì)的含氮量一般為中蛋白質(zhì)的含氮量一般為 15% 17.6%，有的上，有的上下浮動下浮動,可以測出總氮：可以測出總氮：v 蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量 = N /16% = N 6.25v肉、蛋、豌豆、玉米等，其換算系數(shù)為肉、蛋、豌豆、玉米等，其換算系數(shù)為6.25，小，小麥取麥取5.70，大米，大米5

4、.95、乳制品、乳制品6.38、大豆、大豆5.17，動物膠動物膠5.55。含有的元素：含有的元素：C、H、O、NCompany L加堿加堿NaOH蒸蒸餾，使餾，使NH3游游離離樣品與濃硫酸樣品與濃硫酸和催化劑共熱和催化劑共熱消化，使蛋白消化，使蛋白質(zhì)分解有機氮質(zhì)分解有機氮轉(zhuǎn)化為轉(zhuǎn)化為NHNH3 3，并，并與與H H2 2SOSO4 4結(jié)合成結(jié)合成（NHNH4 4) )2 2SOSO4 4；再用再用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸標(biāo)準(zhǔn)鹽酸接接s收，過量酸用收，過量酸用標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定?；蛘叩味??；蛘?用用硼酸硼酸吸收形成硼吸收形成硼酸銨，再以酸銨，再以標(biāo)準(zhǔn)鹽標(biāo)準(zhǔn)鹽酸酸滴定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)滴定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)鹽酸消耗量可計算鹽酸

5、消耗量可計算出粗蛋白質(zhì)的含量出粗蛋白質(zhì)的含量。常量凱氏定氮法常量凱氏定氮法消化蒸餾滴定一、原理一、原理Company L（1 1）濃）濃H H2 2S0S04 4使試樣中的有機物脫水炭化、氧化。使試樣中的有機物脫水炭化、氧化。 濃濃H H2 2S0S04 4在在338338分解產(chǎn)生氧氣、破壞有機物，生成分解產(chǎn)生氧氣、破壞有機物，生成COCO2 2和和 H H2 2O O2 2。 2H2H2 2S0S04 4 = 2S0= 2S02 2 + 2H + 2H2 2O +OO +O2 2 C +O C +O2 2 = CO = CO2 2 2H 2H2 2 + O + O2 2 = 2H = 2H2

6、 2O O蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) RCHRCH（NHNH2 2）COOHCOOH NHNH3 3 +CO+CO2 2 + SO + SO2 2 + H + H2 2O O2 NH3 + H2 NH3 + H2 2S0S04 4 （過量）（過量） （ NHNH4 4）2 2S0S04 4在消化過程中，反應(yīng)生成的在消化過程中，反應(yīng)生成的（ NH4NH4）2 2S0S04 4留在溶液中，其他的留在溶液中，其他的產(chǎn)物產(chǎn)物COCO2 2、SOSO2 2及及H H2 2O O都揮發(fā)逸出。都揮發(fā)逸出。濃H2S04濃H2S04常量凱氏定氮法常量凱氏定氮法Company L（2 2）CuSOCuSO4 4作為催化劑，加快

7、反應(yīng)速度。作為催化劑，加快反應(yīng)速度。 2 CuSO2 CuSO4 4 = Cu = Cu2 2SOSO4 4 + SO + SO2 2 + 2O + 2O 2CuSO 2CuSO4 4 + C = Cu + C = Cu2 2SOSO4 4 + SO + SO2 2 + 2CO + 2CO2 2 Cu Cu2 2SOSO4 4 + 2 H + 2 H2 2S0S04 4 = 2 CuSO = 2 CuSO4 4 + 2 H + 2 H2 2O+ SOO+ SO2 2此反應(yīng)反復(fù)循環(huán)地進(jìn)行，反應(yīng)中產(chǎn)生的新生態(tài)氧使有機物此反應(yīng)反復(fù)循環(huán)地進(jìn)行，反應(yīng)中產(chǎn)生的新生態(tài)氧使有機物加快降解。加快降解。（3 3）

8、K K2 2SOSO4 4使反應(yīng)液沸點提高，可達(dá)使反應(yīng)液沸點提高，可達(dá)400400。 K K2 2SOSO4 4+H+H2 2SOSO4 4 = 2KHSO = 2KHSO4 4 2KHSO 2KHSO4 4 = K = K2 2SOSO4 4 + SO + SO3 3 + H + H2 2O O（4 4）H H2 2O O2 2可加速有機物分解?？杉铀儆袡C物分解。 H H2 2O O2 2 + 2H + 2H+ + = 2H = 2H2 2O EO E0 0=1.77V=1.77V O O2 2 + 4H+ 4H+ + = 2H = 2H2 2O EO E0 0=10299V=10299V常

9、量凱氏定氮法常量凱氏定氮法Company L（5）30% NaOH溶液使消化液中的溶液使消化液中的NHNH3 3通過蒸餾游通過蒸餾游離出來。離出來。 （ NHNH4 4）S0S04 4 + 2NaOH =Na + 2NaOH =Na2 2SOSO4 4 +2H +2H2 2O + O + 2NH2NH3 3蒸餾出來的蒸餾出來的NHNH3 3被被H H3 3BOBO3 3吸收：吸收： 2NH2NH3 3 + 4 H + 4 H3 3BOBO3 3 = = （NHNH4 4）B B4 4O O7 7 + 5H + 5H2 2O O(6)(6)生成的（生成的（NHNH4 4）B B4 4O O7 7

10、用用HClHCl滴定：滴定：（NHNH4 4）B B4 4O O7 7 + 2 + 2 HClHCl + 5H + 5H2 2O = O = 2 NH2 NH4 4ClCl + 4 H + 4 H3 3BOBO3 3試樣中的總氮（粗蛋白）試樣中的總氮（粗蛋白）= =蛋白質(zhì)中的氮蛋白質(zhì)中的氮+ +氨基酸、氨基酸、酰胺、核酸等中的氮酰胺、核酸等中的氮常量凱氏定氮法常量凱氏定氮法Company L二、試劑與器材二、試劑與器材1、消化液：、消化液：H2O2：H2S04 ：H2O=3：2：12、粉末硫酸鉀粉末硫酸鉀硫酸銅混合物硫酸銅混合物 K2S04與與CuS04.5H20以以 3：1混合混合3、30氫

11、氧化鈉溶液氫氧化鈉溶液4、2硼酸溶液硼酸溶液 5、標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液、標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液(約約0.01 molL)6、混合指示劑混合指示劑(田氏指示劑田氏指示劑) 由由50mL 0.1甲烯藍(lán)乙醇溶液與甲烯藍(lán)乙醇溶液與200mL 0.1甲基紅乙醇溶液混合配成，棕色瓶貯存。甲基紅乙醇溶液混合配成，棕色瓶貯存。酸性時為紫紅色，堿性時為綠色。變色范圍酸性時為紫紅色，堿性時為綠色。變色范圍很窄且靈敏。很窄且靈敏。7、待測樣品、待測樣品Company L三、操作方法三、操作方法滴定接收蒸餾蒸餾消化消化Company L三、操作方法三、操作方法1. 消化前樣品處理消化前樣品處理 固體樣品固體樣品105烘干至恒重。烘干至

12、恒重。 若樣品為液體若樣品為液體(如血清等如血清等)，可取，可取一定體積樣品直接消化測定。一定體積樣品直接消化測定。？Company L2、消化消化v 取凱氏燒瓶取凱氏燒瓶 標(biāo)號。各加標(biāo)號。各加幾幾顆玻璃珠顆玻璃珠;1及及2號瓶中各加樣品號瓶中各加樣品0.1g，催化劑催化劑200 mg，消化液消化液5 mL。3及及4號瓶中各加號瓶中各加相同量的催化劑和消化液相同量的催化劑和消化液-對照，對照，以測定試劑中可能含有的微量含氮物以測定試劑中可能含有的微量含氮物質(zhì)。質(zhì)。 1、加樣時應(yīng)直接送人瓶底，不要沾在加樣時應(yīng)直接送人瓶底，不要沾在瓶口和瓶頸上。瓶口和瓶頸上。2、火力控制，先小后大。、火力控制，先

13、小后大。3、消化完全。、消化完全。注意事項注意事項Company L（2）蒸餾 3、蒸餾吸收、蒸餾吸收Company L 3、蒸餾吸收、蒸餾吸收v 特點：將蒸汽發(fā)生器、蒸特點：將蒸汽發(fā)生器、蒸餾器和冷凝器組成一個整餾器和冷凝器組成一個整體，體積小，安裝容易，體，體積小，安裝容易，操作簡便。操作簡便。 1)水蒸汽發(fā)生器和反應(yīng)室水蒸汽發(fā)生器和反應(yīng)室2)冷凝器和通氣室冷凝器和通氣室3)排水柱排水柱v 關(guān)鍵：搞清水管系統(tǒng)關(guān)鍵：搞清水管系統(tǒng)Company L3、蒸餾吸收、蒸餾吸收1、消化液加蒸餾水稀釋后, 應(yīng)及時蒸餾, 2、蒸餾時，加入氫氧化鈉要過量，溶液應(yīng)呈褐色,若是呈藍(lán)色,則說明堿不夠. 并且動作還

14、要迅速以防止氨的流失3、蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)的水裝至三分之二體積并且保持酸性以防止在堿性條件水中游離氨蒸出, 使結(jié)果偏大。4、蒸餾時蒸氣要發(fā)生均勻,充足, 蒸餾中不得?；饠鄽? 否則會發(fā)生倒吸。5、停止蒸餾時防止倒吸, 應(yīng)先將冷凝管下端提高液面并清洗管口, 再蒸1min 后關(guān)掉熱源。6、蒸餾是否完全, 可用精密pH 試紙測冷凝管口的冷凝液來測定,中性則說明已蒸餾完全。注意事項注意事項Company L4 4、滴定、滴定v全部蒸餾完畢后，用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液滴定各錐形瓶中收集全部蒸餾完畢后，用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液滴定各錐形瓶中收集的氨量，硼酸指示劑溶液的氨量，硼酸指示劑溶液由綠變淡紫色由綠變淡紫色為滴定終點。為滴定終

15、點。v使用前檢查酸式滴定管漏不漏？漏的話，涂凡士林。使用前檢查酸式滴定管漏不漏？漏的話，涂凡士林。滴滴定時一邊滴一邊搖，防止滴定過頭！及時記錄讀數(shù)定時一邊滴一邊搖，防止滴定過頭！及時記錄讀數(shù)v要求：空白液要求：空白液1次，樣品消化液次，樣品消化液2次次注意事項注意事項Company L5 5、計算、計算v 總氮量總氮量 () = =c c為標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液摩爾濃度為標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液摩爾濃度( (0.00980.0098M)M)；V V1 1為滴定樣品消化液用去的鹽酸溶液平均為滴定樣品消化液用去的鹽酸溶液平均mLmL數(shù)；數(shù)；V V2 2為滴定空白液用去的鹽酸溶液為滴定空白液用去的鹽酸溶液mLmL數(shù)；數(shù)；w w為樣品重量為樣品重量( (1 1g)g)。1414為氮的相對量子質(zhì)量。為氮的相對量子質(zhì)量。 消化液總量消化液總量500500ml, ml, 蒸餾時消化液用量蒸餾時消化液用量3 3ml ml 樣品蛋白質(zhì)含量樣品蛋白質(zhì)