吸入溴化異丙托品對慢性阻塞性肺疾病大鼠模型氣道和肺組織M受體

1、吸入溴化異丙托品對慢性阻塞性肺疾病大鼠模型氣道和肺組織M受體的影響【摘要】目的觀察吸入溴化異丙托品對大鼠慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型氣道和肺組織M受體的影響及其規(guī)律。方法通過長期吸入高濃度SO2氣體的方法建立大鼠COPD模型47只, COPD大鼠在密閉箱內(nèi)吸入霧化的0.025%溴化異丙托品溶液10 ml(2次/天,20分鐘/次)，應用放射配基結合法測定大鼠氣道和肺組織M受體。結果與對照組相比，COPD大鼠吸入溴化異丙托品5天,氣道和肺組織M受體密度無明顯增加，吸入異丙托品30天，M受體的密度顯著升高(P0.05)，停藥6天后，M受體的密度基本恢復正常。各組平衡離解常數(shù)(Kd)值差異均無顯著

2、性。結論長期吸入溴化異丙托品可上調(diào)氣道毒蕈堿M受體，但停藥后能較快恢復，氣道M受體的上調(diào)可能與長期應用異丙托品患者停藥后所出現(xiàn)的暫時性的支氣管痙攣及肺功能惡化有關。【關鍵詞】受體，毒蕈堿肺疾病，阻塞性溴化異丙托品The effect of inhaled ipratropium bromide on airway and lung tissue muscarinic receptors in a rat model of COPDYAO Wanzheng, WANG Guoyang, ZHU Hong, et al. Department of Respiratory Medicine, th

3、e Third Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100083【Abstract】ObjectiveTo observe the effect of inhaled ipratropium bromide on airway and lung tissue muscarinic receptors (MR) in a rat model of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). MethodsThe rat model of COPD was established by chro

4、nic exposure with high concentrations of SO2 gas, COPD rats inhaled aerosolized 0.025% ipratropium bromide solution 10 ml (twice/d, 20 min/time). The MR was determined by radioligand binding studies with 3H-QNB as the ligand. ResultsCompared with that of control, there was a marked increase in MR de

5、nsity on day 30 of treatment with ipratropium but not on day 5. The MR density decreased and close to normal level on the 6th day after cessation of regular therapy with inhaled ipratropium for 30 days. No significant difference was observed in antagonist affinity (Kd) among different time groups of

6、 ipratropium therapy. ConclusionsChronic exposure to the anticholinergic agent ipratropium bromide produces an up-regulation of airway MR. The airway MR density can recover to normal when treatment stopped. Up-regulation of airway MR is associated with transient bronchoconstriction following cesstio

7、n of regular ipratropium therapy and lung function deteriorated following long-term inhaled ipratropium bromide.【Key words】Receptors, MuscarinicPulmonary disease, obstructiveIpratropium bromide吸入溴化異丙托品對于慢性阻塞性肺疾病(COPD)的短期療效已被大量的臨床實踐所證實1， 但其長期應用后的臨床效果尚有爭議, 本實驗采用長期吸入高濃度SO2氣體的方法建立大鼠COPD模型, 應用放射配基結合研究的方法

8、測定大鼠氣道和肺組織M受體, 目的在于探索吸入溴化異丙托品對大鼠COPD模型氣道和肺組織M受體的影響及其規(guī)律, 為臨床的抗膽堿治療提供理論指導。 材料與方法23：放血處死動物, 迅速取出氣管、主支氣管及肺臟, 用冰冷的生理鹽水洗去血污, 留左肺作病理標本, 將整個右肺連同氣管、主支氣管一起作為氣道和肺標本, 吸干, 稱重后, 移至冰冷的50 mmol/L K+/Na+磷酸緩沖液(pH 7.4)中, 剪碎后, 在冰浴中勻漿。組織勻漿以600g的速度在4下離心10分鐘后, 棄沉淀,上清再以35 000g離心20分鐘, 所得沉淀懸于適量的緩沖液中, 調(diào)整蛋白含量至12 g/L，立即供實驗用。4.蛋白

9、定量：采用考馬斯亮藍法測定膜標本中蛋白含量4 。5.結合試驗：膜制劑100 l, 加入最終濃度為301 000 pmol/L的3H-QNB（比放射性1.8109 Bq/mol，放化純度97，Dupont公司生產(chǎn)）, 并加緩沖液使總容量為500 l, 在27水浴中孵育60分鐘后, 加入5 ml冰冷的生理鹽水終止反應, 迅速通過玻璃纖維濾膜行負壓抽濾, 濾膜用5 ml冰冷的生理鹽水沖洗2次后, 涼干, 液閃儀測量放射性, 非特異性結合系向反應體系中加入最終濃度為1 mol/L的阿托品溶液而得。三、統(tǒng)計學處理由總結合減去非特異性結合, 所得特異結合數(shù)據(jù)依Scatchard公式計算, 求出最大結合容量

10、(Bmax)及平衡解離常數(shù)(kd), 結果以s表示,顯著性檢驗用t檢驗, 資料的整理及統(tǒng)計分析由SAS軟件處理。結果COPD大鼠氣道和肺組織細胞膜制劑與M受體的標記配基3H-QNB在上述條件下所進行的結合試驗，隨著后者濃度的遞增而達到飽和，Scatchard作呈一直線（表1）。表1吸入溴化異丙托品對大鼠COPD模型氣道和肺組織M受體的影響(s)組別只數(shù)Bmax(pmol/mg蛋白)t值P值Kd(pmol/L)t值P值治療5天組8*3520*對照組72919治療30天組9*6137*對照組84728停藥6天組8*5026*?對照組75326注：*治療組與其對應對照組比較P0.05，*由表1可見，

11、吸入溴化異丙托品5天, COPD大鼠氣道和肺組織M受體雖有升高趨勢, 但無統(tǒng)計學意義，吸入30天，COPD大鼠氣道和肺組織M受體密度顯著升高(P0.05)，停藥6天后，M受體的密度基本恢復正常。M受體與拮抗劑的親和力Kd值各組差異均無顯著性。討論迷走神經(jīng)張力的增加與COPD患者氣道狹窄及粘液分泌過度有著密切的關系，膽堿能張力是COPD患者氣道最主要的可逆成分, 抗膽堿治療已成為治療COPD的首選措施1。有報道，COPD患者長期吸入溴化異丙托品可使氣流阻塞產(chǎn)生可逆性改變，并可降低一秒鐘用力呼氣容積(FEV1)下降的速率5，而另一些研究則認為，溴化異丙托品只能暫時擴張支氣管，并不能減緩FEV1的逐

12、年下降率6，哮喘和慢性支氣管炎(慢支)患者長期吸入異丙托品可加速肺通氣功能的惡化7。此外，還有一些研究發(fā)現(xiàn)，長期吸入異丙托品的患者停藥后，氣道對擬膽堿藥發(fā)生超敏反應，出現(xiàn)氣道反應性的異常增高及肺功能的短暫惡化8，9，這種停藥后的反跳現(xiàn)象，推測可能與用藥后氣道M受體的上調(diào)有關。大量的研究已證實, 長期應用阿托品可上調(diào)細胞膜表面的M受體, 導致中樞神經(jīng)系統(tǒng), 唾液腺, 氣道等多個組織對膽堿能剌激產(chǎn)生超敏反應9。本實驗結果表明, 大鼠慢支模型吸入異丙托品5天后, 氣道M受體有上調(diào)趨勢, 但無統(tǒng)計學意義, 吸入30天, 氣道M受體的密度顯著增加, 停止治療6天后, M受體的密度基本恢復正常。氣道M受體

13、的上調(diào)與長期應用異丙托品患者停藥后所出現(xiàn)的氣道反應性異常增高及肺功能的暫時惡化有關。氣道M受體的上調(diào), 從理論上講, 也可能導致耐藥的產(chǎn)生。在Vaughan等10的一個有安慰劑對照的, 交叉設計的雙盲試驗中, 22例哮喘患者霧化吸入硝酸甲基阿托品(atropine methylnitrate)2周后產(chǎn)生顯著性的失敏, 由于硝酸甲基阿托品和溴化異丙托品均為阿托品的季胺類衍生物, 因此我們認為, 長期應用溴化異丙托品也會導致失敏。但是, 迄今為止, 極少有吸入溴化異丙托品引起耐藥的報道, 我們認為可能的原因有(1)實驗設計本身的缺陷：如實驗未設對照組, 實驗對象在使用異丙托品的同時, 還應用其他的

14、藥物如沙丁胺醇, 皮質(zhì)激素等, 從而影響實驗結果的準確性。(2)選用的指標不夠敏感：應用異丙托品后, 肺功能改善最明顯的指標是最大呼氣中段流量(MMEF)，而不是FEV1,但是在臨床試驗時, 幾乎都用FEV1作為觀察指標, 有可能對結果的判斷造成一定的影響。(3)異丙托品的應用劑量偏?。耗壳芭R床治療及試驗觀察所用的異丙托品大多為每次40 g, 34次/天, 這一劑量實際上是比較小的, 其上調(diào)M受體的作用較弱, 不大可能充分誘導失敏的產(chǎn)生10。我們認為, 雖然溴化異丙托品誘導M受體上調(diào)持續(xù)時間較短, 對于大多數(shù)患者可能并不產(chǎn)生明顯的影響, 但是對于嚴重氣道阻塞的患者應遞減停藥, 以防病情加重。作

15、者單位：100083 北京醫(yī)科大學第三臨床醫(yī)學院呼吸內(nèi)科參考文獻1Ikeda A, Nishimura K, Koyama H,et al. Bronchodilating effects of combined therapy with clinical dosages of ipratropium bromide and salbutamol for stable COPD: Comparison with ipratropium bromide alone. Chest,1995，107:401-405.2衛(wèi)生部防治慢性支氣管炎辦公室.慢性支氣管炎實驗方法匯編. 北京:人民衛(wèi)生出版社,1

16、973.260-262.3Chiba Y, Misawa M. Characteristic of muscarinic cholinoceptors in airways of antigen-induced airway hyperresponsive rats. Comp Biochem Physiol,1995,111:351-357.4Bradford MM, A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of p

17、rotein-dye binding. Anal Biochem,1976，72:248-254.5Combivent Inhalation Aerosol Study Group. In chronic obstructive pulmonary disease, a combination of ipratropium bromide and albuterol is more effective than either agent alone. Chest,1994，105:1411-1419.6Anthonisen NR, Connett JE, Kiley JP, et al. Ef

18、fects of smoking intervention and the use of an inhaled anticholinergic bronchodilation on the rate of decline of FEV1-The lung health study. JAMA,1994，272:1497.7Van Schayck CP, Dompeling E, Van Herwaarden CLA, et al. Bronchodilator treatment in moderate asthma or chronic bronchitis: continuous or on demand? A randomised controlled study. Br Med J,1991，303:1426-1431.8Newcomb R, Tashkin DP, Hui KK, et al. Rebound hyperresponsiveness to muscarinic stimulation after chronic therapy with an inhaled muscarinic antagonist. Am Rev Respir Dis,1985，132:12-15.9Wilding PJ, Clark MM, Pavord ID, et