生物化學(xué)實驗報告：Western-blotting檢測大腸桿菌重組蛋白(共9頁)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上實驗三 Western blotting檢測大腸桿菌重組蛋白一、實驗?zāi)康?利用Western Blotting技術(shù)，定性（或定量）檢測苦蕎黃酮醇合酶基因（Flavonol synthase gene, FtFLS）在大腸桿菌表達(dá)宿主菌Escherichia coli BL(DE3)中的誘導(dǎo)表達(dá)。二、 實驗原理黃酮醇合酶（FLS，EC 1.14.11.23）屬于2-ODD家族，催化黃酮醇合成支路中最后一步氧化反應(yīng)，也是直接合成黃酮醇的反應(yīng)。FLS可以使二氫黃酮醇在C3鏈中C2和C3之間氧化形成雙鍵，從而生成黃酮醇：a Dihydroflavonol + 2-oxoglu

2、tarate + O2  a Flavonol + succinate + CO2 + H2O。本實驗采用PCR的方法，在苦蕎黃酮醇合酶基因（FtFLS）ORF起始密碼子前引入Kpn 酶切位點，去掉終止密碼并引入BamH 酶切位點?？寺∫朊盖形稽c后的FtFLS到表達(dá)載體pET-30b(+)質(zhì)粒中，其表達(dá)產(chǎn)物分別在N-末端和C-末端各含有6 × His標(biāo)簽。重組質(zhì)粒（pET-30b(+)-FtFLS）經(jīng)鑒定后轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌E. coli BL21(DE3)并使用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。收集誘導(dǎo)0 h、2 h、4 h、6 h和8 h的產(chǎn)物，經(jīng)SDS

3、-PAGE后用于考馬斯亮藍(lán)R-250染色或Western blotting分析。Western blotting的標(biāo)準(zhǔn)流程如下：蛋白質(zhì)首先通過SDS-PAGE胺凝膠電泳分離，通過電泳轉(zhuǎn)移到固相支持物上（硝酸纖維素膜、PVDF膜和尼龍膜）；將膜上未反應(yīng)的位點封閉起來，以抑制抗體的非特異性吸附，固定的蛋白質(zhì)即可與特異性的多克隆或單克隆抗體相互作用并通過放射、生色或化學(xué)發(fā)光的方法進(jìn)行定位。本實驗采用小鼠抗聚組氨酸單克隆抗體（Anti-His tag IgG，一抗）與重組FtFLS蛋白的N-末端和C-末端6 × His發(fā)生抗原-抗體特異反應(yīng)，再利用辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG（perox

4、idase-Goat Anti- Mouse IgG，二抗）與一抗發(fā)生特異結(jié)合，最后使用DAB進(jìn)行顯色。DAB即：二氨基聯(lián)苯胺（3, 3'-diaminobenzidine），是過氧化物酶（Peroxidase）的生色底物。DAB在過氧化氫的存在下失去電子而呈現(xiàn)出顏色變化和積累，形成淺棕色不溶性產(chǎn)物。該方法常用于檢測過氧化物酶的活性，它靈敏度高，特異性好，在免疫組化，原位雜交，Western blotting等膜顯色中應(yīng)用廣泛。三、 操作步驟3.1 樣品的制備原始樣品可為細(xì)胞、組織、培養(yǎng)上清、免疫沉淀或親和純化的蛋白，以下為定性檢測大腸桿菌重組蛋白時細(xì)胞樣品的處理方法，其余的樣品制備方

5、法參閱相關(guān)文獻(xiàn)。材料與試劑：重組pET-30b(+)-FtFLS質(zhì)粒、表達(dá)宿主菌E. coli BL21(DE3)、LB固體培養(yǎng)基（Kan 50g/mL）、LB 液體培養(yǎng)基（10mL、50mL）、Kan（50 mg/mL）、IPTG（24 mg/mL）、PBS緩沖液、5 X SDS上樣緩沖液。儀器與設(shè)備：恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、超凈工作臺、酒精燈、消毒酒精（75%）、棉球、接種環(huán)、臺式離心機、冰盤、Tip（10 L、200 L、1 mL）、微量加樣器（10 L、200 L、1 mL）、離心管（1.5 mL、10 mL）。操作步驟：含重組質(zhì)粒pET-30b(+)-FtFLS的表達(dá)宿主菌E. col

6、i BL21(DE3)劃線于LB 固體培養(yǎng)基（Kan抗性），37培養(yǎng)16 h。挑選單菌落，接種至10 mL LB培養(yǎng)基（按0.1%加入Kan，10 L）于37 過夜培養(yǎng)，即為種子液。按2 %的接種量（1 mL）將種子液接種到50 mL LB Kan培養(yǎng)基中（按0.1%加入Kan，50 L），于37 培養(yǎng)OD600至0.5（約2.5 h）。加入IPTG至終濃度為1 mmol/L（100 L），置于25連續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)8 h，分別取誘導(dǎo)前0 h，誘導(dǎo)后2 h、4 h、6 h和8 h的培養(yǎng)液5 mL于10 mL離心管中，置于冰水混合物上備用。誘導(dǎo)完畢后，各樣品于8000 rpm（12000 rpm易爆管

7、）離心5 min收集沉淀，用等體積PBS（5 mL）重懸漂洗細(xì)胞2次，收集菌體。各管分別加入400 L PBS重懸細(xì)胞，加入100 L 5 X SDS上樣緩沖液，置于沸水浴中10 min（注意防止爆管）。注意事項：重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)應(yīng)進(jìn)行正確的無菌操作并加入適宜濃度的抗生素，避免可能的污染。在合適的鹽濃度下，應(yīng)保持蛋白質(zhì)的最大溶解性。選擇合適的表面活性劑和還原劑，破壞所有非共價結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和共價鍵二硫鍵。盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子。制備過程應(yīng)在低溫下進(jìn)行，以避免細(xì)胞破碎釋放出的各種酶類的修飾。樣品建議分裝成合適的量（比如分裝出20ul檢測蛋白質(zhì)定量用），然后保存與-20°

8、;或-80中長期保存，但要注意不要反復(fù)凍融，因為會使蛋白的抗原特性發(fā)生改變。3.2 SDS-PAGESDS-PAGE（SDS變性不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳）的分離原理則僅根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量的差異。因為SDS-PAGE上樣緩沖液含有SDS和巰基乙醇（2-ME）或二巰基赤蘚醇（DTT），其可以斷開半胱氨酸殘基之間的二硫鍵、分子內(nèi)氫鍵、破壞蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)、形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物。該復(fù)合物形成榛狀結(jié)構(gòu)，平均每兩個氨基酸殘基結(jié)合一個SDS分子，使其帶有大量的負(fù)電荷（蛋白質(zhì)分子本身的電荷完全被SDS掩蓋），從而消除了不同分子之間原有的電荷差別。材料與試劑： 分離膠緩沖液（1.5 mol/L Tris-H

9、Cl，0.4% SDS，pH 8.8）。 濃縮膠緩沖液（0.5 mol/L Tris-HCl，0.4% SDS，pH 6.8）。 30%丙烯酰胺/N, N'-亞甲基雙丙烯酰胺（Arc/Bis）：29.2 g Acr，0.8 g Bis，定容至100 mL。 10%過硫酸銨（W/V），需新鮮配制。 2 X 上樣緩沖液（pH 8.0）：含0.5 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）2 mL，甘油2 mL，20% SDS 2 mL（W/V），0.1%溴酚藍(lán) 0.5 mL，2-巰基乙醇（2-ME）1.0 mL，定容至10 mL。 電極緩沖液（pH 8.3）：3.03 g Tris，14

10、.41 g Gly，1.0 g SDS，調(diào)整pH后定容至1000 mL。 染色液：45%甲醇，10%乙酸，0.25%考馬斯亮藍(lán)R-250。 脫色液：10%（V/V）乙酸，5%（V/V）乙醇。 封底膠：1g瓊脂糖溶于100 mL電極緩沖液。 預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白質(zhì)Marker。儀器與設(shè)備：垂直板電泳槽及其附件，電爐，電泳儀，微量加樣器（10 L），Tip（10 L）。操作步驟： 電泳槽的安裝：將成套的兩塊玻璃板正確放入硅膠條中，夾在電泳槽里，按對角線順序旋緊螺絲（注意分辨上下槽）。用1%的瓊脂糖封底（封于下槽底部），待瓊脂糖凝固后即可制膠。 制膠：選擇合適的膠濃度，按下表配制分離膠，灌入兩玻璃板之

11、間，加至距短玻璃板頂端3 cm處，立即覆蓋5 mm左右水層，靜置等待聚合，當(dāng)分離膠與水層之間的界面重新出現(xiàn)時表明膠已聚合。小心倒掉分離膠上水層，配制濃縮膠后加入玻璃板中，插入梳子并及時補充由于濃縮膠聚合產(chǎn)生的空隙（該過程避免氣泡的產(chǎn)生）。本實驗選用12.5%的SDS-PAGE膠對重組FtFLS進(jìn)行分離。試劑分離膠濃縮膠濃度7.5%10%12.5%15%30%4%分離膠緩沖液 mL4.04.04.04.04.0-濃縮膠緩沖液 mL-1.25Acr/Bis mL4.05.36.78.010.70.75H2O mL8.06.75.34.01.33.010% AP mL0.30.30.30.30.30

12、.15TEMED mL0.0080.0080.0080.0080.0080.005 點樣：分別在上下電泳槽中倒入電極緩沖液，上槽淹沒短玻璃板，下槽淹沒電極即可。此時，小心拔出梳子，用微量加樣器調(diào)整點樣孔之間的濃縮膠（此步驟應(yīng)檢查電泳槽是否漏液）。使用微量進(jìn)樣器分別在樣品槽內(nèi)分別加入預(yù)染的標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白質(zhì)、誘導(dǎo)前0 h，誘導(dǎo)2 h、4 h、6 h和8 h后處理好的樣品18 L（上樣總體積一般不超過15 L，加樣孔的最大限度可加20 L樣品）。 電泳：接通電源，調(diào)節(jié)電壓至100 V，恒壓電泳；待指示劑進(jìn)入分離膠后，調(diào)節(jié)電壓至200 V恒壓電泳。待指示劑在分離膠中遷移5-6 cm左右時，停止電泳。剝

13、膠：小心剝膠，將濃縮膠（濃縮膠影響操作）和分離膠上不用的部分切去（便于識別），見圖3和圖4. 染色：凝膠經(jīng)蒸餾水漂洗1次后加入染色液，電爐加熱處理10-20 min染色。 脫色：使用蒸餾水漂洗取出染色液，加入脫色液，電爐加熱脫色至出現(xiàn)清晰的蛋白條帶。注意事項：上樣總體積一般不超過15mL，膠孔的最大限度可加20mL樣品。微量加樣器應(yīng)貼壁吸取樣品，避免吸進(jìn)氣泡；將微量加樣器Tip頭插至加樣孔中緩慢加入樣品，避免樣品溢出。電泳設(shè)備應(yīng)注意檢查正負(fù)極、是否短路或接觸不良、是否漏液、電流電壓大?。娏鲝姸葧S電泳的進(jìn)行有所降低）。電極緩沖液和AP應(yīng)新鮮配制，上下槽緩沖液不可混用（電泳完畢分別收集）。3.

14、3 轉(zhuǎn)膜與雜交雜交膜的選擇是決定Western blotting成敗的重要環(huán)節(jié)。應(yīng)根據(jù)雜交方案、被轉(zhuǎn)移蛋白的特性以及分子大小等因素，選擇合適材質(zhì)、孔徑和規(guī)格的雜交膜。用于Western blot 的膜主要有兩種：硝酸纖維素膜（NC）和聚偏氟乙烯（PVDF）膜。NC膜是蛋白印跡實驗的標(biāo)準(zhǔn)固相支持物，在低離子轉(zhuǎn)移緩沖液的環(huán)境下，大多數(shù)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)會與膜發(fā)生疏水作用而高親和力的結(jié)合在一起，但在非離子型的去污劑作用下，結(jié)合的蛋白還可以被洗脫下來。根據(jù)被轉(zhuǎn)移的蛋白分子量大小，選擇不同孔徑的NC膜。因為隨著膜孔徑的不斷減小，膜對低分子量蛋白的結(jié)合就越牢固。通常用0.45 m和0.2 m兩種規(guī)格的NC膜

15、。大于20 kDa的蛋白可用0.45 m 的膜，小于20 kDa的蛋白用0.2 m的膜。PVDF 膜靈敏度、分辨率和蛋白親和力比常規(guī)的膜要高，非常適合于低分子量蛋白的檢測。但PVDF 膜在使用之前必需用純甲醇浸泡飽和1-5 sec。蛋白質(zhì)常用的轉(zhuǎn)移方法主要有兩種：槽式濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)移。前者操作容易，轉(zhuǎn)移效率高；而后者適用于大膠的蛋白轉(zhuǎn)移，所用緩沖液少。以下為槽式濕轉(zhuǎn)的操作步驟。材料與試劑：材料：PVDF膜，Whatman 濾紙，搪瓷盤，一次性PE手套，鑷子，玻棒，試劑：轉(zhuǎn)移緩沖液 pH 8.3（25 mmol/L Tris，0.2 M 甘氨酸，20%甲醇），1000 mL 10 X TBS緩沖液

16、pH 7.6（24.2 g Tris base，80 g NaCl，用1N HCl調(diào)pH=7.6），脫脂奶粉、BSA或試劑盒自帶的蛋白質(zhì)干粉，洗滌緩沖液（1 X TBS，0.1% Tween-20），封閉緩沖液（1×TBS，0.1% Tween-20，5% w/v脫脂奶粉或BSA），抗體稀釋液1×TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA（多抗）或5%脫脂奶粉（單抗）。儀器與設(shè)備：轉(zhuǎn)膜電泳儀及其附件，雜交儀，培養(yǎng)皿，凝膠成像系統(tǒng)。操作步驟：轉(zhuǎn)膜 準(zhǔn)備轉(zhuǎn)移緩沖液，依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，將凝膠和PVDF膜和濾紙放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10min。 裝配轉(zhuǎn)移三明治（

17、海綿3層濾紙膠膜3層濾紙海綿）：在加有轉(zhuǎn)移液的搪瓷盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和浸過的膜；將夾子打開使一面保持水平（規(guī)定為正極）。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡。在墊子上墊三層濾紙，一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。依次加膜、加膠，再在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡，見圖5。 將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，加轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V電泳1h（電流約為0.3 A）。 電泳結(jié)束，觀察預(yù)染的蛋白質(zhì)Marker是否轉(zhuǎn)移到膜上。雜交 用25-50 mL洗滌緩沖液洗滌硝酸纖維素膜5 min, 1 次。 封閉硝酸纖維膜：加封閉緩沖液25 mL，37封閉2 h。

18、用量以浸沒整張膜為準(zhǔn)，圖6。 抗體的稀釋（已依?。盒∈罂咕劢M氨酸單克隆抗體使用100 L抗體稀釋液進(jìn)行溶解稀釋，儲存與4。（一般特異性抗體濃度1 g/mL） 硝酸纖維膜孵育一抗：加入20 mL抗體稀釋液，將25 L一抗加入培養(yǎng)皿中（已完全覆蓋膜為準(zhǔn)），37孵育2 h左右，見圖7和圖8。（視實驗時間，也可以4孵育過夜） 用25 mL洗滌緩沖液振蕩洗滌硝酸纖維素膜3 次, 每次5 min。 硝酸纖維膜孵育二抗：加入25 mL抗體稀釋液，將25L二抗全部加入培養(yǎng)皿中（以完全覆蓋膜為準(zhǔn)），37 孵育2 h，見圖7和圖8。 用30 mL洗滌緩沖液振蕩洗滌硝酸纖維膜4 次, 每次5 min。 DAB 顯

19、色：按每2 mL蒸餾水加顯色劑A，B，C 各滴，混勻。混勻后加至膜上。室溫顯色。一般顯色130 分鐘。若無背景出現(xiàn)則可繼續(xù)顯色。顯色后用蒸餾水洗滌以終止反應(yīng)。注意事項：操作中戴手套，不要用手觸膜。如檢測小于20 kDa的蛋白應(yīng)用0.2m的膜，并可省略轉(zhuǎn)移時的平衡步驟。某些抗原和抗體可被Tween-20 洗脫，此時可用1.0% BSA代替Tween-20。關(guān)于封閉劑的選擇：5%脫脂奶/TBS or PBS: 能和某些抗原相互作用，掩蓋抗體結(jié)合能力；0.33% BSA in PBS：低的內(nèi)源性交叉反應(yīng)性。如用0. 1% Tween 20、0.02% NaN3 in PBS or TBS作封閉劑和抗體稀釋液，抗體檢測后可進(jìn)行蛋白染色。如要同時檢測大分子量和小分子蛋白，最好用梯度膠分離蛋白。四、實驗