嵌套PCR巢氏PCR過程與原理

1、巢式PCR：是一種變異的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，使用兩對（而非一對）PCR引物擴(kuò)增完整的片段。第一對PCR引物擴(kuò)增片段和普通PCR相似。第二對引物稱為巢式引物（因為他們在第一次PCR擴(kuò)增片段的內(nèi)部）結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴(kuò)增片段短于第一次擴(kuò)增。巢式PCR的好處在于，如果第一次擴(kuò)增產(chǎn)生了錯誤片斷，則第二次能在錯誤片段上進(jìn)行引物配對并擴(kuò)增的概率極低。因此，巢式PCR的擴(kuò)增非常特異。巢式PCR通過兩輪PCR反應(yīng)，使用兩套引物擴(kuò)增特異性的DNA片斷。第二對引物的功能是特異性的擴(kuò)增位于首輪PCR產(chǎn)物內(nèi)的一段DNA片斷。 第一輪擴(kuò)增中，外引物用以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，此產(chǎn)物在內(nèi)引物的存在下進(jìn)

2、行第二輪擴(kuò)增。從而提高反應(yīng)的特異性。 巢式PCR反應(yīng)模式圖：巢式PCR的實驗步驟：第一步：目標(biāo)的DNA模板藍(lán)色的第一對引物結(jié)合。第一對引物也可能結(jié)合到其他具有相似結(jié)合位點的片段上并擴(kuò)增多種產(chǎn)物。但只有一種產(chǎn)物是目的片斷（圖中未顯示可能的多種產(chǎn)物）。 第二步：使用圖中紅色標(biāo)記的第二套引物對第一輪PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。 由于第二套引物位于第一輪PCR產(chǎn)物內(nèi)部，而非目的片斷包含兩套引物結(jié)合位點的可能性極小，因此第二套引物不可能擴(kuò)增非目的片斷。這種巢式PCR擴(kuò)增確保第二輪PCR產(chǎn)物幾乎或者完全沒有引物配對特異性不強造成的非特異性擴(kuò)增的污染。如果用普通PCR檢測不到條帶是因為擴(kuò)增模板量太低造成的，為了提高檢測靈敏度和特異性，可以采用巢式PCR。其優(yōu)點是：1、克服了單次擴(kuò)增“平臺期效應(yīng)”的限制，使擴(kuò)增倍數(shù)提高，從而極大的提高了PCR的敏感性；2、由于模板和引物的改變，降低了非特異性反應(yīng)連續(xù)放大進(jìn)行的可能性，保證了反應(yīng)的特異性；3、內(nèi)側(cè)引物擴(kuò)增的模板是外側(cè)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物，第二階段反應(yīng)能否進(jìn)行，也是對第一階段反應(yīng)正確性的鑒定，因引可以保證整個反應(yīng)的準(zhǔn)確性及可行性。但其亦有缺點：進(jìn)行第二次PCR墳增引起交叉污染的幾率大。為了克服此缺點，可彩用同一反應(yīng)管中巢式PCR，主要利用內(nèi)外引物Tm值不同。如果你已排除引物，酶，RNA提取，逆轉(zhuǎn)錄等等其他原因引起的PCR不成功，確