不同病期白血病骨髓細(xì)胞端粒酶活性的檢測(cè)

1、    不同病期白血病骨髓細(xì)胞端粒酶活性的檢測(cè)        端粒是真核生物染色體末端的一種特殊結(jié)構(gòu)，由一富含鳥(niǎo)嘌呤的重復(fù)DNA序列及其相關(guān)蛋白組成1，2。端粒是保護(hù)染色體末端穩(wěn)定必不可少的結(jié)構(gòu)。端粒長(zhǎng)度的維持需要端粒酶活性的存在3。永生細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞能夠長(zhǎng)期生存，端粒酶起到了重要的作用。我們用端粒重復(fù)擴(kuò)增銀染法檢測(cè)了原代白血病細(xì)胞和白血病細(xì)胞系的端粒酶活性，以研究端粒酶活性在急性白血病不同病期和被誘導(dǎo)分化的白血病細(xì)胞系中的改變，初步探討端粒酶活性的調(diào)節(jié)機(jī)制及其在急性白血病中

2、的臨床意義。 材料和方法1細(xì)胞來(lái)源HL-60細(xì)胞株來(lái)自本校預(yù)防醫(yī)學(xué)院放射生物教研室。骨髓細(xì)胞來(lái)自近期本院住院的白血病患者和骨髓象完全正常的非血液病患者。急性白血病患者34例，男19例，女15例，其中M1型2例，M2型2例，M3型14例，M4型5例，M5型5例，ALL型6例。急性期（初發(fā)患者，未經(jīng)任何治療）20例，首次緩解期（首次治療2個(gè)療程以內(nèi)達(dá)完全緩解）6例，持續(xù)緩解6個(gè)月以上者4例，復(fù)發(fā)4例。非血液病患者10例，其中風(fēng)濕性疾病患者5例，敗血癥患者2例，正常人3名。年齡2065歲，中位年齡36歲。2試劑端粒酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院。3實(shí)驗(yàn)方法3.1骨髓細(xì)胞的處理：肝素抗凝的骨髓81

3、0 ml，常規(guī)密度梯度離心，分離單個(gè)核細(xì)胞，取細(xì)胞總數(shù)為1×106，白血病急性期患者的標(biāo)本經(jīng)涂片證實(shí)白血病細(xì)胞>70，標(biāo)本以常規(guī)方法經(jīng)程序冷凍儀冷凍后，置于液氮中保存待檢。3.2全反式維甲酸體外誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞：取生長(zhǎng)良好的HL-60細(xì)胞分別同終濃度為10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L全反式維甲酸培養(yǎng)0，2，4，6天后收集細(xì)胞，以臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)數(shù)活細(xì)胞所占百分率，洗滌取活細(xì)胞總數(shù)為1×106個(gè)，同上述方法冷凍保存。同時(shí)做硝基藍(lán)四氮唑（NBT）還原實(shí)驗(yàn)，離心涂片，瑞-吉染色，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。另取培養(yǎng)后的細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞涂片，瑞氏染

4、色，顯微鏡下觀察誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞形態(tài)改變，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞分類，取分化最明顯的一組細(xì)胞，進(jìn)行端粒酶活性的檢測(cè)。3.3檢測(cè)端粒酶活性：從液氮中取出凍存的細(xì)胞，立即加裂解液100 l，冰浴30分鐘，4 16 000×g離心30分鐘，取上清備用。將標(biāo)本置65 滅活5分鐘作為陰性對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照由試劑盒提供。在反應(yīng)管中加入以下組分：TRAP反應(yīng)液25 l，Taq酶0.2 l，提取液1 l，混勻，37 保溫30分鐘后，加入反向引物5 l，混勻，按以下條件進(jìn)行擴(kuò)增：94 變性30秒，55 退火30秒，72 延伸30秒，循環(huán)30次，72 延伸10分鐘。在反應(yīng)管中加入5 l 6×上

5、樣緩沖液，混勻，取30 l于120 g/L聚丙烯酰胺凝膠、1×TBE條件下電泳，硝酸銀染色，陽(yáng)性結(jié)果可見(jiàn)相隔6個(gè)核苷酸的梯形條帶，照相，以Photoshop軟件對(duì)條帶進(jìn)行輝度分析，以條帶的輝度值代表端粒酶的活性。4統(tǒng)計(jì)分析以t檢驗(yàn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果1急性期白血病患者骨髓細(xì)胞端粒酶活性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1和1。在急性白血病不同時(shí)期，即發(fā)病初期和首次緩解期，端粒酶活性無(wú)明顯差異（P>0.05），經(jīng)鞏固治療緩解期長(zhǎng)于6個(gè)月的患者，骨髓細(xì)胞端粒酶活性與發(fā)病初期相比明顯降低（P<0.05），白血病復(fù)發(fā)期骨髓細(xì)胞的端粒酶活性與發(fā)病初期相比，差異無(wú)顯著性（P>0.05）。急性白

6、血病各個(gè)時(shí)期的骨髓細(xì)胞的端粒酶活性均明顯高于正常骨髓細(xì)胞（P<0.001）。表1急性白血病不同病期骨髓細(xì)胞的端粒酶活性(輝度值,例數(shù)=3)病期端粒酶活性發(fā)病初期111.0±9.2首次緩解期118.3±6.4緩解期(>6個(gè)月)70.5±7.6復(fù)發(fā)期120.1±3.2正常骨髓4.3±4.3     1:陽(yáng)性對(duì)照；3：陰性對(duì)照；2，48：急性白血病急性期患者1急性白血病急性期患者骨髓細(xì)胞端粒酶活性檢測(cè)結(jié)果2不同濃度維甲酸作用于HL-60細(xì)胞第2，4，6天時(shí)，NBT反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞率均明顯高于對(duì)照組，且差

7、異具有顯著性（P<0.01）。各劑量組之間，在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)上均以10-6組陽(yáng)性率最高，差異具有顯著性（P<0.01），其陽(yáng)性率分別為49%，84%，97% 。從形態(tài)上觀察，隨著維甲酸作用時(shí)間的延長(zhǎng)，HL-60細(xì)胞逐漸分化為中幼粒、晚幼粒，直至成為成熟細(xì)胞。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)10-6組細(xì)胞分化最明顯，與NBT還原試驗(yàn)結(jié)果一致。對(duì)10-6組細(xì)胞進(jìn)行端粒酶活性的檢測(cè)，結(jié)果為隨著細(xì)胞的分化，其端粒酶活性也隨之下降，與對(duì)照組相比其活性分別下降了33%，65%，100%。討論90年代Kim等4建立了端粒重復(fù)擴(kuò)增法，大大提高了檢測(cè)端粒酶活性的靈敏度。人們已經(jīng)在胃癌、前列腺癌、結(jié)腸癌等多種惡性

8、腫瘤中檢測(cè)到了端粒酶活性，證明腫瘤的發(fā)生與端粒酶的激活有密切的聯(lián)系，端粒酶被認(rèn)為是新的腫瘤標(biāo)記物并可能成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。急性白血病各個(gè)時(shí)期的骨髓細(xì)胞的端粒酶活性均明顯高于正常骨髓，說(shuō)明端粒酶的激活在白血病的形成和發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用。在急性白血病治療的各個(gè)階段，表現(xiàn)出不同的端粒酶活性，提示我們是否可以將端粒酶活性作為判定白血病預(yù)后和預(yù)示早期復(fù)發(fā)的指標(biāo)。另外，端粒酶活性檢測(cè)是否可以作為監(jiān)測(cè)白血病前期病變和骨髓增生異常綜合征及其它骨髓增殖性疾病向急性白血病轉(zhuǎn)化的指標(biāo)，也是值得進(jìn)一步探討的問(wèn)題。全反式維甲酸，可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞分化并逆轉(zhuǎn)其惡性表型5。我們發(fā)現(xiàn)維甲酸誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化的過(guò)程中，隨著細(xì)胞的分化，其端粒酶活性持續(xù)下降。一般認(rèn)為具有增殖能力的細(xì)胞有三種可能的去向：長(zhǎng)期處于G0期，保持穩(wěn)定狀態(tài)；啟動(dòng)增殖程序，進(jìn)行增殖；進(jìn)入分化階段，成為更成熟的細(xì)胞，直至成為終末細(xì)胞。維甲酸是通過(guò)與細(xì)胞受體結(jié)合而啟動(dòng)細(xì)胞的分化過(guò)程6，而端粒酶是保持細(xì)胞增殖的因素。若維甲酸使細(xì)胞分化，那必然首先或同時(shí)阻斷細(xì)胞增殖，維甲酸通過(guò)哪一種機(jī)制阻斷早幼粒細(xì)胞的增殖，是否與抑制端粒酶活性有關(guān)，值得我們進(jìn)一步研究。端粒酶與腫瘤發(fā)生存在明確的相關(guān)性