含人突變DHFR基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒對(duì)造血細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)及造血功能的作用

1、    含人突變DHFR基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒對(duì)造血細(xì)胞 的轉(zhuǎn)導(dǎo)及造血功能的作用        利用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)，成功地將許多基因?qū)肓嗽煅杉?xì)胞，含人突變二氯葉酸還原酶(human dihydrofolate reductase,hDHFR)基因的產(chǎn)病毒細(xì)胞AM12-S31，能穩(wěn)定產(chǎn)生高滴定、安全有效的非復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒，并能成功轉(zhuǎn)染小鼠造血細(xì)胞，表達(dá)hDHFR基因1。本研究應(yīng)用該載體系統(tǒng)，將hDHFR基因?qū)胄∈蠊撬杓?xì)胞，通過(guò)ex vivo方式回輸給經(jīng)致死劑量照射的

2、小鼠，于體內(nèi)研究了其對(duì)小鼠造血功能的作用。 材料與方法1.載體：DC/SV-hDHFRS31質(zhì)粒由美國(guó)Sloan-Kettering癌癥研究所趙實(shí)誠(chéng)教授惠贈(zèng)。系衍生于Moloney小鼠白血病病毒的雙拷貝逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，克隆了655bp人31位突變(PheSer)的DHFR cDNA片段2。2.動(dòng)物及細(xì)胞株：C57BL/6J小鼠，雄性，811周齡。購(gòu)自北京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部。隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組810只動(dòng)物。由北京醫(yī)科大學(xué)放射醫(yī)學(xué)研究所鈷源室照射。WEIHI-3b細(xì)胞、兼性包裝細(xì)胞EP-EAM12(簡(jiǎn)稱AM12)和產(chǎn)病毒細(xì)胞AM12-S31由本室凍存。后者是將DC/SV-hDHFRS31載體

3、導(dǎo)入包裝細(xì)胞AM12，經(jīng)G418篩選生成的陽(yáng)性克隆細(xì)胞培養(yǎng)而成。上述細(xì)胞生長(zhǎng)于含20% FCS、1% L-谷氨酰胺和1%青、鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中。3.小鼠骨髓細(xì)胞的分離和轉(zhuǎn)染：雄性811周齡C57BL/6J小鼠35只，尾靜脈注射5-FU(150mg/kg),3天后常規(guī)收集股骨和脛骨骨髓的有核細(xì)胞。以含20% FCS和10% WEIHI-3b培養(yǎng)上清的IMDM培養(yǎng)1天。轉(zhuǎn)染前2小時(shí)以15Gy(1Gy=100rad)照射產(chǎn)病毒細(xì)胞和AM12細(xì)胞，然后與骨髓細(xì)胞以11細(xì)胞數(shù)比共培養(yǎng)于含8g/ml polybrene、1ng/ml mSCF和100ng/ml mIL-6上述IMDM中，轉(zhuǎn)染48

4、小時(shí)。4.骨髓移植和體內(nèi)篩選：收集轉(zhuǎn)導(dǎo)后的骨髓細(xì)胞，尾靜脈注入經(jīng)(8.59.0)Gy照射的同系小鼠(2×106細(xì)胞/鼠)。2天后腹腔注射甲氨喋呤(methotrexate,MTX)篩選，第一周劑量為4mg/kg,每周2次;以后各周10mg/kg，每周2次。觀察白細(xì)胞、紅細(xì)胞壓積、體重和總的生存率等指標(biāo)。5.小鼠組織基因組DNA的提取3：6.PCR分析及其產(chǎn)物的Southern印跡雜交4：利用PCR分析小鼠組織DNA中標(biāo)志基因Neor的整合情況。50l體系含510l染色體DNA，1.25mmol/L dNTP,1×PCR buffer,1.5mmol/L MgCl2，兩種引物

5、各1l(300ng/ml)。0.7l Taq DNA polymerase。引物序列為：5GGA AGC CGG TCT TGT CGA TC-3及5-CGA AAT CTC GTG ATG GCA GG-3。利用自動(dòng)PCR儀擴(kuò)增。第一循環(huán)為94變性3分鐘，55退火2分鐘，72延伸2分鐘；3540循環(huán)之后為941分鐘，551分鐘，721分鐘。取5l產(chǎn)物以0.8%瓊脂糖凝膠電泳。按文獻(xiàn)3進(jìn)行轉(zhuǎn)膜及烤膜，以地高辛標(biāo)記的Neor基因探針進(jìn)行Southern印跡雜交、免疫沉淀、照像。結(jié)果與討論1.骨髓移植和體內(nèi)篩選下小鼠血象、體重及生存情況：以不同劑量照射小鼠，在不同的移植和選擇條件下，觀察小鼠造血功

6、能重建情況，8.0Gy照射劑量為亞致死劑量(8.59.0)Gy照射劑量為合適的致死劑量。將轉(zhuǎn)導(dǎo)后的骨髓細(xì)胞回輸給經(jīng)致死劑量照射的小鼠后，用MTX篩選。結(jié)果第14天致死劑量照射的對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠白細(xì)胞、紅細(xì)胞和紅細(xì)胞壓積明顯下降，隨后實(shí)驗(yàn)組血象逐漸恢復(fù)，第28天紅細(xì)胞和紅細(xì)胞壓積恢復(fù)正常，白細(xì)胞明顯回升。致死劑量照射的對(duì)照組小鼠于21天內(nèi)全部死于嚴(yán)重貧血、胃腸道出血和極度消瘦。亞致死劑量照射的對(duì)照組血象變化類似于實(shí)驗(yàn)組，但第14天其白細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和紅細(xì)胞壓積均明顯高于致死劑量照射組，說(shuō)明8.0Gy劑量不能完全破壞小鼠造血功能。致死劑量照射的實(shí)驗(yàn)組和亞致死劑量照射的對(duì)照組生存率(第21天

7、分別為100%和87.5%)明顯高于致死劑量照射的對(duì)照組(第21天，0%)，生存期亦較后者延長(zhǎng)(1)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠體重第14天明顯下降，以后對(duì)照組繼續(xù)下降，而實(shí)驗(yàn)組小鼠體重逐漸回升。說(shuō)明小鼠移植轉(zhuǎn)導(dǎo)了hDHFR基因的骨髓后，在MTX選擇壓力下，能夠重建致死劑量照射后小鼠的造血功能并保護(hù)其免遭MTX的細(xì)胞毒作用。1骨髓移植和MTX篩選后小鼠的生存率AM12-1:8.5Gy照射小鼠；AM12-2:8.0Gy照射小鼠；AM12-S31：9.0Gy照射小鼠2.含突變hDHFR基因的前病毒DNA在小鼠基因組中的整合：為了解目的基因在體內(nèi)的整合情況，以小鼠肝、脾、腎和骨髓細(xì)胞的DNA為模板，利用Ne

8、o 1和Neo 2引物行PCR分析，擴(kuò)增前病毒DNA中的Neor基因。結(jié)果所有實(shí)驗(yàn)組脾臟、骨髓細(xì)胞和部分肝臟、腎臟組織均出現(xiàn)了415bp的條帶。內(nèi)臟組織PCR產(chǎn)物非特異性帶較多，為確定特異性條帶，我們用Neor基因探針進(jìn)行了Southrn印跡分析，所有實(shí)驗(yàn)組脾臟、部分肝臟和腎臟均有特異陽(yáng)性帶。非特異性帶沒(méi)有顯色(2)。對(duì)照組沒(méi)有陽(yáng)性帶。脾臟陽(yáng)性信號(hào)系轉(zhuǎn)導(dǎo)后的造血干/祖細(xì)胞著床脾臟并增殖分化成脾集落所致；肝、腎臟的陽(yáng)性信號(hào)可能是其混有外周血有核細(xì)胞所致，亦不排除有髓外造血(尤其是肝臟)因素存在，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。2BMT和MTX篩選后小鼠組織Neor基因PCR產(chǎn)物的Southern印跡分析1.

9、DNA marker(DNA +EcoR/Hind)；2.陽(yáng)性對(duì)照(DC/SV-hDHFRS31 plasmid)；3.陰性對(duì)照；4.實(shí)驗(yàn)組-1 肝；5.實(shí)驗(yàn)組-1 脾；6.實(shí)驗(yàn)組-1 腎；7.實(shí)驗(yàn)組-2 肝；8.實(shí)驗(yàn)組-2 腎；9.實(shí)驗(yàn)組-2 腎；a.實(shí)驗(yàn)組-3 脾；b.實(shí)驗(yàn)組-3 肝；c.空白；d.實(shí)驗(yàn)組-4 肝；e.實(shí)驗(yàn)組-4 脾；f.實(shí)驗(yàn)組-4 腎DHFR是細(xì)胞內(nèi)葉酸代謝和細(xì)胞合成DNA 、RNA及蛋白質(zhì)的關(guān)鍵酶?？焖僭鲋臣?xì)胞，抑制DHFR活性會(huì)導(dǎo)致四氫葉酸耗竭、DNA合成下降乃至細(xì)胞死亡。MTX是一種葉酸類似物，能與DHFR的活性位點(diǎn)緊密結(jié)合使其失活，常用于治療乳腺癌、急性白血病、胃

10、癌等腫瘤。但因腫瘤細(xì)胞很快會(huì)對(duì)其產(chǎn)生耐藥；且其骨髓抑制和胃腸道粘膜的損傷作用亦較嚴(yán)重，限制了臨床應(yīng)用。MTX耐受的主要機(jī)制之一是DHFR基因的突變。該基因的許多突變形式均能改變其對(duì)MTX的親和力和耐受性。用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)將突變的DHFR基因?qū)朊舾屑?xì)胞，能使之獲得耐MTX表型。以產(chǎn)病毒的AM12-S31細(xì)胞上清與小鼠骨髓有核細(xì)胞共培養(yǎng)后，能有效地將hDHFR基因?qū)胄∈蠊撬杓?xì)胞，使其獲得耐藥表型1。本實(shí)驗(yàn)將轉(zhuǎn)導(dǎo)后的骨髓有核細(xì)胞通過(guò)ex vivo方式回輸給經(jīng)致死劑量照射小鼠后，在高劑量MTX篩選下，進(jìn)一步證實(shí)了hDHFR基因能保護(hù)骨髓免遭MTX的抑制，重建小鼠造血功能。作者單位：100034

11、 北京醫(yī)科大學(xué)臨床腫瘤學(xué)院 北京腫瘤防治研究所 北京腫瘤醫(yī)院(張文卿，許佐良，于杰，張桂國(guó)，王黎明，徐光煒)；美國(guó)Sloan-Kettering癌癥研究所(趙實(shí)誠(chéng))參考文獻(xiàn)1張文卿，許佐良，于杰，等.人突變DHFR基因高效逆轉(zhuǎn)錄病毒載體及其在小鼠造血細(xì)胞的表達(dá).中國(guó)腫瘤生物治療雜志，1997，485-89.2LI MX,Banerjee D,Zhao SC,et al.Development of a retroviral construct containing a human mutated dihydrofolate reductase cDNA for hematopoietic stem cell transduction.Blood,1994,833403-3408.3Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.Molecular Cloning:A laboratory manual.2nd