全菌體滅活菌苗的現(xiàn)狀和新策略

1、全菌體滅活菌苗的現(xiàn)狀和新策略            摘要 對全菌體滅活菌苗（WCV）防治傳染病已進(jìn)行了廣泛的研究，WCV是預(yù)防疾病的一種經(jīng)濟(jì)、安全、有效的方法，但WCV的缺點(diǎn)是，胃腸外免疫能引起不良反應(yīng)，而口服免疫常需大劑量，縣免疫力短暫。近期研究表明，能提高WCV免疫原性和增強(qiáng)口服免疫應(yīng)答的新方法極有希望提高這些菌苗的效力。 動物模型和人研究顯示，WCV口服或胃腸外免疫均具有免疫原性，也具有預(yù)防呼吸道、腸道和全身性細(xì)菌感染的效力。雖然僅百日咳WCV被普遍應(yīng)用，但其他WCV也

2、具有普遍應(yīng)用的潛力。本文報(bào)道了WCV研制的進(jìn)展，重點(diǎn)闡述了制備更優(yōu)質(zhì)菌苗制劑的可能性。 腸道菌苗 空腸彎曲菌 空腸彎曲菌是引起胃腸炎的主要原因，估計(jì)全世界每年發(fā)病4億多例。某些地區(qū)的罹患率高達(dá)2.5萬"4萬/10萬。這種病原菌感染的主要后遺癥是Guillain-Rarré綜合征。一種傳統(tǒng)的空腸彎曲菌菌苗已在動物中進(jìn)行試驗(yàn)，這種菌苗（福馬林和加熱共同滅活，3劑）通過口飼給予小鼠，每劑間隔2天，并以大腸桿菌不耐熱腸毒素（LT，25g）為佐劑。免疫后4周在口服攻擊模型中評估各種劑量的含和不含佐劑菌苗（105、107或109個細(xì)菌）的效力。用活空腸彎曲菌（108個細(xì)菌，100

3、15;半數(shù)定居量）攻擊動物，并監(jiān)測排菌情況。最大劑量菌苗和較小劑量含LT菌苗能預(yù)防定居，含或不含佐劑的菌苗均能預(yù)防細(xì)菌全身播散。兩種配方的菌苗接種小鼠后，均檢得空腸彎曲菌特異性血清IgA和IgG升高，但僅在含LT菌苗免疫小鼠中檢得腸道IgA。 這種菌苗還在恒河猴中進(jìn)行試驗(yàn)。猴子間隔14天接種2劑1010空腸彎曲菌菌苗加0.5"1000gLT，未見不良反應(yīng)。部分動物在6周時接受1劑加強(qiáng)免疫。不管菌苗（福馬林滅活）是否含LT，接種者對空腸彎曲菌的特異性T細(xì)胞應(yīng)答均增強(qiáng)。由于初免程序后已獲得最大應(yīng)答，因此無需加強(qiáng)免疫。免疫后7天，IgA分泌細(xì)胞在含LT菌苗接種動物中增多。 第2種空腸彎曲菌

4、菌苗已產(chǎn)生，目前正在進(jìn)行期攻擊研究評估。這種菌苗是利用能生產(chǎn)“抗原增強(qiáng)”菌苗的營養(yǎng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（NST）技術(shù)制備的。制備菌苗所用的細(xì)菌是通過專門方法培養(yǎng)的，其對INT-407和Ca-Co-2人腸上皮細(xì)胞的粘附力和侵襲力均增強(qiáng)，并在福馬林滅活前與剛果紅的結(jié)合力提高。這些表型被認(rèn)為是空腸彎曲菌和其他腸道病原菌毒力和相關(guān)抗原表達(dá)的重要標(biāo)志。為了獲得這些特征，可將細(xì)菌置于含0.1%脫氧膽酸鈉的腦心浸液肉湯中，37、10%CO2條件下培養(yǎng)至穩(wěn)定期。 用上述細(xì)菌制備的NST菌苗在動物中的免疫原性強(qiáng)于傳統(tǒng)方法制備的菌苗。NST菌苗免疫鼠腸道產(chǎn)生的抗原特異性IgA大于傳統(tǒng)菌苗免疫鼠?？诜琇T nST菌苗的雪貂產(chǎn)

5、生的血清IgG水平比含佐劑傳統(tǒng)菌苗免疫雪貂高15倍。用同源泉空腸彎曲菌口飼攻擊雪貂，17%的NST菌苗免疫動物發(fā)病，而接受傳統(tǒng)菌苗的動物的發(fā)病率達(dá)67%。 產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌 產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（ETEC）是造成兒童嚴(yán)重脫水性腹瀉的最主要細(xì)菌，估計(jì)每年發(fā)病4億例，死亡70萬例。ETEC是造成旅游者腹瀉的主要原因，僅美國就影響800萬人。表達(dá)定居因子CFA/和CFA/的ETEC經(jīng)福馬林滅活制成的菌苗已在人中進(jìn)行評估。間隔2周口服3劑含或不含霍亂毒素B亞單位（CTB）的菌苗（1011個細(xì)菌/劑，5個菌毛型），免疫后7天檢測外周血抗體分泌細(xì)胞（ASC）。對CFA/ cFA/和CFA/抗原產(chǎn)生應(yīng)答的細(xì)

6、胞主要是產(chǎn)生IgA的ASC，其次是IgM-ASC，IgG-ASC極少。2劑后的免疫應(yīng)答最強(qiáng)。CTB不能增強(qiáng)對CFA/和CFA/抗原的應(yīng)答。檢得對CTB產(chǎn)生應(yīng)答的IgA-ASC，IgG-ASC，未檢得IgM-ASC，盡管對CFA的局部IgA應(yīng)答極少與血清抗體水平的升高有關(guān)。在埃及進(jìn)行的ETEC/重組CTB菌苗的研究中，74名21"45歲成人間隔2周接受2劑菌苗或安慰劑。受試者對CTB、CFA/、CS4、CS2和CS1的外周血IgA b細(xì)胞應(yīng)答率顯著高于對照者。對滅活WCV產(chǎn)生強(qiáng)免疫應(yīng)答的發(fā)現(xiàn)是重要的，因?yàn)榭诜兓亩ň右蜃诱T發(fā)的免疫應(yīng)答微弱，且無保護(hù)作用。對菌苗的特異性T細(xì)胞應(yīng)答也進(jìn)行

7、了評估。從接種者分離的人外周血單個核細(xì)胞中觀察到中等度的CFA依賴性體 外增殖應(yīng)答，用定居因子體外刺激應(yīng)答細(xì)胞可產(chǎn)生高水平的干擾素（IFN-），未檢得白細(xì)胞介素2（IL-2）。應(yīng)答細(xì)胞主要是CD4+T細(xì)胞，CD8+細(xì)胞較少。高水平IFN-的產(chǎn)生可能具有免疫學(xué)意義。IFN-能刺激B細(xì)胞分泌抗體，增加腸細(xì)胞分泌組分的表達(dá)。這種類型的應(yīng)答除產(chǎn)生IgA分泌細(xì)胞外，還能介導(dǎo)對ETEC攻擊的防御作用。 受試者還接種了由大腸菌素E2處理滅活的ETEC菌苗。這種滅活方法能殺死菌苗，且不為化學(xué)或加熱處理所改變。間隔1個月口服2劑此菌苗（3×1010個細(xì)菌）能在77%的接種者中誘導(dǎo)腸道抗CFA/IgA應(yīng)

8、答，86%的接種者產(chǎn)生增強(qiáng)的抗LT igA應(yīng)答。接種者均能抵御同源和異源菌的攻擊。 李斯德菌 單核細(xì)胞增多性李斯德桿菌是一種食物傳播的病原體，人群罹患率較低，但在易感人群中的死亡率很高。最常影響的人群是孕婦或其他免疫損害者。 加熱滅活的菌苗已在小鼠中進(jìn)行評估。觀察到的保護(hù)性免疫應(yīng)答的標(biāo)志是誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞和IFN-。在具有或缺少CD4+細(xì)胞的動物中均可誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，通過有免疫力動物CD8+細(xì)胞的導(dǎo)入可把免疫力移至無免疫力動物。菌苗是用在胰酷胨豆胨培養(yǎng)液中培養(yǎng)過夜、經(jīng)70、60分鐘加熱滅活的細(xì)菌制備的。 沙門菌 在空腸彎曲菌檢測前，沙門菌是美國引起胃腸炎的主要細(xì)菌，腸炎沙門菌仍是重要的病因。傷

9、寒桿菌是傷寒的主要病因，全世界每年發(fā)病3000萬例，死亡50多萬例。加熱滅活的鼠傷寒桿菌菌苗已在小鼠中進(jìn)行試驗(yàn)，細(xì)菌在盧氏肉湯中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用沸水浴加熱45分鐘進(jìn)行滅活。菌苗可經(jīng)腹腔（ip）或皮內(nèi)（id）途徑給予。ip接種鼠的淋巴細(xì)胞增殖應(yīng)答強(qiáng)于id接種鼠，但在免疫后42天降至相同水平。ip接種鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生的IL-4和IL-2水平亦較高。此外，T細(xì)胞免疫印跡檢測顯示，ip接種動物能對不同分子大小的抗原產(chǎn)生應(yīng)答，而id接種鼠主要對18kDa的抗原產(chǎn)生應(yīng)答。 福馬林、酚、丙酮滅活的鼠傷寒桿菌菌苗也在小鼠、大鼠和小牛中進(jìn)行試驗(yàn)，小鼠免疫丙酮滅活的WCV產(chǎn)生抗脂多糖（LPS）和全菌體（WC）抗體。小鼠免疫野型光滑株或粗糙突變株（不能產(chǎn)生O抗原）制備的菌苗所獲得的保護(hù)作用無差異。抵御致死攻擊的短期保護(hù)作用與WC凝集滴度密切相關(guān)，而長期保護(hù)作用與之無關(guān)。大鼠免疫福馬林滅活的菌苗能產(chǎn)生抗鼠傷寒桿菌抗體，且能抵御低水