少棘蜈蚣活性蛋白提取及纖溶作用性質(zhì)研究

1、少棘蜈蚣活性蛋白提取及纖溶作用性質(zhì)研究         09-08-30 15:55:00     編輯：studa20               作者：劉兵，譚竹鈞，陳明軍，劉浩，陳雅雄【摘要】  目的研究少棘蜈蚣活性蛋白的纖溶性及其性質(zhì)。方法通過(guò)硫酸銨分段鹽析、DEAE纖維素柱和Sephadex G-75柱層析從少棘蜈蚣S

2、colopendra subspinipes mutilans L. Koch組織分離純化出纖溶性活性蛋白，纖維蛋白平板法測(cè)定其纖溶性，SDS-PAGE測(cè)定樣品純度和分子量，溫度、pH改變對(duì)少棘蜈蚣纖溶性蛋白活性的影響。結(jié)果分離純化到一種相對(duì)分子質(zhì)量約為48.3 kD的纖溶性蛋白，水解纖維蛋白的比活力為42.36 u/mg。結(jié)論少棘蜈蚣活性蛋白具有纖溶性，該成分在40下基本穩(wěn)定，最適溫度35，最適pH8.0。 【關(guān)鍵詞】  少棘蜈蚣 活性蛋白 分離提取 纖溶活性Abstract：ObjectiveTo study the fibrinolytic activity of the ac

3、tive protein of Scolopendra sulspinipes multicans.MethedA novel of fibrinolytic protein was separated and purified by ammonium suplhate sub-precipitation, DEAE-cellulose and SephadexG-75 column chromatography from the tissue of the Scolopendra subspinipes mutilans L. Koch. ResultThe protein showed a

4、n apparent molecular weight of about 48.3kD in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis analysis. Its specific activity to hydrolyze fibrin was 42.36 u/mg. The activity of enzyme was inhibited by serine protease inhibitor such as phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF), but wasn'

5、t inhibited by ethylenediaminotetraacetic acid (EDTA). CorclusionThe protein is stable under 40, the optimum temperature is 35, and the optimum pH is 8.0.Key words：Sclopendra subspinipes mutilans L. Koch;  Active protein;  Purification;  Fibrinolytic activity 蜈蚣屬陸生節(jié)肢動(dòng)物，是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材之

6、一。目前蜈蚣藥材主流商品為少棘蜈蚣，產(chǎn)量約占95，少棘蜈蚣Scolopendra subspinipes mutitans全蟲(chóng)入藥，已有二千多年的使用歷史，有熄風(fēng)解痙、消腫解毒的功能，主治小兒驚風(fēng)、破傷風(fēng)、抽搐、口眼歪斜、淋巴結(jié)結(jié)核、腫毒瘡瘍等。對(duì)其活性蛋白研究有利于進(jìn)一步探索其藥用作用機(jī)理，纖溶活性研究為進(jìn)一步研究其溶栓和抗癌活性奠定基礎(chǔ)。1   材料與儀器1.1  藥材少棘蜈蚣Scolopendra subspinipes mutilans L. Koch購(gòu)自安徽滁州大豐養(yǎng)殖場(chǎng)，由譚竹鈞教授對(duì)其進(jìn)行種類(lèi)鑒定，挑取活體于-80冰箱中凍存。1.2 儀器自動(dòng)柱層儀(

7、包括梯度混合器、橫流器、自動(dòng)部分收集器、紫外檢測(cè)儀、小型臺(tái)式記錄儀)，上海滬西分析儀器廠有限公司產(chǎn)品；pH計(jì)梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，其精度為±0.01pH；高速冷凍離心機(jī)（KDC-160HR，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；真空冷凍干燥器（LABCONCO，美國(guó)）；HHS電熱恒溫水浴鍋（上海博泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；DYY穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和DYY28垂直夾芯電泳槽（北京六一儀器廠）。1.3 試劑Sephadexg-75，臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠出品；DEAE-32，廣東省汕頭市西隴化工廠分裝；十二烷基硫

8、酸鈉（SDS），天津市瑞金特化學(xué)品有限公司產(chǎn)品；丙烯酰胺，天津市大茂化學(xué)試劑廠產(chǎn)品；考馬斯亮藍(lán)R-250、G-250，北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白（BSA），牛血纖維蛋白原sigma-F8630、凝血酶sigma-T4648，廣州寬林儀器科技有限公司產(chǎn)品；尿激酶，中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。2 方法2.1 少棘蜈蚣粗提物的制備1取-80凍死的新鮮蜈蚣16條，4冰箱中解凍后稱(chēng)重46.72g，剪刀絞碎于研缽中研磨至糜狀，按W/V=15加入預(yù)冷的0.02 mol/L磷酸鈉緩沖液(pH7.6)， 4冰箱中浸提過(guò)夜。4 000 r/min，4離心15 min，去沉淀，16層砂布過(guò)濾，上

9、清液加固體硫酸銨分段鹽析,取35%70%飽和度鹽析組分透析濃縮,得到少棘蜈蚣粗提物。2.2 提取物的分離、純化2將上述蜈蚣粗提取物用聚乙二醇濃縮后上DEAE-纖維素柱(2.5 cm×45 cm)（預(yù)先用0.02 mol/L  pH 8.0 的 Tris-HCl 緩沖液平衡過(guò)夜），用含1 mol/L NaCl的0.02mol/L  pH 8.0 的 Tris-HCl緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，流速0.6 ml/min,每管收集6 ml。合并活性峰，透析，冷凍干燥，再上經(jīng)0.02 mol/L pH 8.0的Tris-HCl緩沖液平衡過(guò)的SephadexG-75(1.0 c

10、m×100 cm)柱純化，用同樣緩沖液洗脫，流速為0.2 ml/min, 每管收集3 ml。收集活性峰，凍干備用。用核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)層析過(guò)程蛋白含量，用纖維蛋白平板法進(jìn)行活力測(cè)定。2.3 纖溶活性測(cè)定制備纖維蛋白平板，牛血纖維蛋白原、牛凝血酶用0.02 mol/L的Tris-HCl的 (pH8.0)溶解，先配制1.0%的瓊脂糖10 ml，煮沸，冷卻至5060，加入5 mg/ml的牛血纖維蛋白原0.8 ml及10 U/ml的凝血酶0.5 ml，迅速搖勻，倒入直徑9 cm的培養(yǎng)皿中，蓋上玻璃蓋，冷卻凝固（大概5 min）后轉(zhuǎn)移到4冰箱保存約30 min。將制備好的纖維蛋白平板置80處理

11、30 min，使其中纖維蛋白溶酶原全部失活，制成去纖溶酶纖維蛋白平板，可以檢驗(yàn)少棘蜈蚣纖溶蛋白是否具有纖溶酶活性。用0.2 ml槍頭在制備好的纖維蛋白平板上打孔，孔與孔之間要保持一定距離，每孔加樣品20 l，以尿激酶為標(biāo)準(zhǔn)品，PBS孔為空白對(duì)照組，置37培養(yǎng)箱保溫24 h。取出用考馬斯亮藍(lán)R-250染色10 min，再用脫色液脫色30 min，觀察纖維蛋白溶解情況，樣品若有纖溶活性會(huì)在樣品孔周?chē)霈F(xiàn)清晰透明的纖維蛋白溶解圈。測(cè)量溶圈兩垂直直徑，計(jì)算纖溶圈面積。曲線制作以尿激酶為標(biāo)準(zhǔn)品4，PBS液作空白對(duì)照。在纖維蛋白平板上作纖溶活性標(biāo)準(zhǔn)曲線，以兩垂直直徑之積制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算樣品的纖溶活性時(shí)將

12、樣品的纖溶圈大小對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成尿激酶單位即可。2.4 樣品純度和分子量的測(cè)定SDS-PAGE濃縮膠濃度為3, 分離膠濃度為12%,用考馬斯亮藍(lán)R-250染色。2.5 纖溶活性蛋白濃度測(cè)定蛋白質(zhì)濃度采用Bradford法5，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.6 少棘蜈蚣纖溶活性蛋白性質(zhì)研究6將樣品溶液分別置于11組(1565)溫度下處理10 min,然后用纖維蛋白平板法測(cè)定其酶活力。將樣品溶液稀釋于不同pH值緩沖液中(pH68用磷酸緩沖液, pH 8.510用甘氨酸-NaOH緩沖液, pH10.511.5用NaOH調(diào)生理鹽水后),纖維蛋白平板法測(cè)定酶活力。   &#

13、160; 09-08-30 15:55:00     編輯：studa203 結(jié)果3.1 少棘蜈蚣活性蛋白的分離純化少棘蜈蚣粗提物上DEAE-纖維素柱(2.5 cm×45 cm)（預(yù)先用0.02 mol/L  pH 8.0 的 Tris-HCl 緩沖液平衡過(guò)夜），用含1 mol/L NaCl的0.02 mol/L  pH8.0的 Tris-HCl緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，流速0.6 ml/min,每管收集6 ml。見(jiàn)圖1。 圖1  少棘蜈蚣活性蛋白DEAE-纖維素柱層析經(jīng)纖維平板活性檢測(cè),峰1無(wú)活性，峰2活

14、性大于峰3，峰2少棘蜈蚣活性成分過(guò)SephadexG-75(1.0 cm×100 cm)柱純化。結(jié)果見(jiàn)圖23。經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè),電泳圖譜顯示為一條帶，說(shuō)明得到的少棘蜈蚣纖溶活性成分為單一蛋白,相對(duì)分子質(zhì)量為48.3 kD。3.2 少棘蜈蚣活性蛋白纖溶活性測(cè)定以尿激酶為標(biāo)準(zhǔn)品，PBS液做空白對(duì)照在纖維蛋白平板上，以濃度為5，10，15，20，25，30 U/ml的尿激酶標(biāo)準(zhǔn)系列做纖溶活性標(biāo)準(zhǔn)曲線，以纖溶圈面積S(cm2)取對(duì)數(shù)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖4)。測(cè)定蜈蚣纖溶活性蛋白比活力為42.36 u/mg。3.3 少棘蜈蚣纖溶活性蛋白濃度測(cè)定測(cè)得蜈蚣纖溶蛋白595 nm的吸光度值為0.2

15、79，濃度約為80 g/ml。見(jiàn)圖5。3.4 溫度對(duì)少棘蜈蚣纖溶活性蛋白活性的影響作用結(jié)果見(jiàn)如圖6。11組不同溫度下其活性變化幅度較大，受溫度變化較為敏感，蜈蚣纖溶活性蛋白的最適溫度約為35。3.5 pH對(duì)少棘蜈蚣纖溶活性蛋白活性的影響作用結(jié)果（見(jiàn)圖7）在偏堿性環(huán)境下蜈蚣纖溶活性蛋白的活性迅速提高，當(dāng)pH>9時(shí)，其活性降低明顯，最適pH值為8.0。4 討論在提取過(guò)程中，通過(guò)多次離心避免用無(wú)水乙醇去脂，保護(hù)蛋白。抑制劑EDTA和PMSF對(duì)蜈蚣纖溶活性蛋白活力影響的實(shí)驗(yàn)表明，不同濃度EDTA對(duì)少棘蜈蚣纖溶蛋白影響不大，表明纖溶蛋白不屬于金屬酶類(lèi)；而絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF則能完全抑制該蛋白

16、的纖溶活性，表明少棘蜈蚣纖溶活性蛋白可能屬于絲氨酸類(lèi)蛋白酶類(lèi)7。市售纖維蛋白原內(nèi)常含有少量纖溶酶原，纖溶酶原可在纖溶激酶作用下變?yōu)槔w溶酶，纖溶酶作用于纖維蛋白后出現(xiàn)纖溶圈，為了探究少棘蜈蚣纖溶活性蛋白的作用機(jī)理，將制備好的纖維蛋白平板置80處理30 min，使其中纖維蛋白溶酶原全部失活，制成去纖溶酶纖維蛋白平板，以未加熱纖維蛋白平板做對(duì)照，對(duì)照結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個(gè)纖溶圈面積相等表明蜈蚣纖溶蛋白本身具有纖溶酶活性?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1陳少鵬,韓雅莉,郭桅，等.少棘蜈蚣纖溶活性蛋白的抗血栓作用J.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2007，23（8）：1088.2曾紅,張國(guó)剛,程巨龍，等.蜈蚣中抗癌活性成分提取J.湖南中醫(yī)雜志,2004,20(5):57.3Astrup T,Mullertz S.The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activityJ.Archs Biochem Biophys,1952,40:346.4李建武.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法M.北京:北京大學(xué)出版社,1994:216.5刁勁翩,沈忠耀.用于測(cè)定尿激酶原活性的纖溶板法的數(shù)字圖像處理和分析技術(shù)J.計(jì)算機(jī)與應(yīng)用化學(xué),2001,18(