消毒劑消毒效力及有效期驗(yàn)證方案

1、消毒劑的選用原那么：目的：確認(rèn)各干凈級別的操作間與設(shè)備外外表按照規(guī)定的消毒程序消毒能夠到達(dá)消毒、防止污染 的目的，并在消毒劑有效期能確保其消毒效力能符合要求。圍：本驗(yàn)證方案適用于本公司干凈區(qū)的墻面、天花板、門窗、機(jī)器設(shè)備、儀器、操作臺、地漏、 推車、桌椅等外表以與操作人員雙手手套的消毒等。1. 參考文件1.1. ?醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)?1.2. ?中國藥典?2021版 第4部 微生物限度檢查法2. 概述2.1. 本公司的干凈區(qū)為D級，擬定用于干凈區(qū)外表消毒的有五種消毒劑：75聽醇、0.1%新潔爾滅溶液、0.2%新潔爾滅溶液、0.5%醋酸氯己定溶液、0.1%醋酸氯己定溶液。本次驗(yàn) 證方案將選用

2、以上5種消毒劑分別進(jìn)展驗(yàn)證試驗(yàn)。作用對象一樣的消毒劑每月輪換使用， 防止外表微生物產(chǎn)生耐藥菌株。在利用消毒劑進(jìn) 展外表擦拭消毒過程中消毒劑的作用時間應(yīng)不少于 10分鐘，利用消毒劑進(jìn)展浸泡消毒 的不少于5分鐘。消毒劑的種類、消毒對象、消毒方法和有效期序號名稱消毒對象消毒方法有效期175%乙 醇用于設(shè)備外表、器具和手消毒。米用擦拭或噴灑方式密閉保存D級：30天20.1%新潔爾滅溶 液用于地面、墻面、器具、工作服、 清潔布、拖布和干凈鞋的消毒米用擦拭或浸泡方式密閉保存D級：30天30.2%的新潔爾火 溶液用于水池和地漏的消毒用于液封密閉保存D級：30天40.5%醋酸氯己定 溶液用于水池和地漏的消毒用

3、于液封密閉保存D級：30天50.1%醋酸氯己定 溶液用于工作服、清潔布、拖布和干 凈鞋的消毒采用浸泡方式密閉保存D級：30天2.2. 為了確認(rèn)消毒劑的消毒效力，通過實(shí)驗(yàn)室考察局部和現(xiàn)場考察局局部別進(jìn)展驗(yàn)證。 其中, 用定量懸浮試驗(yàn)法和外表實(shí)驗(yàn)法進(jìn)展實(shí)驗(yàn)室考察試驗(yàn)局部。干凈區(qū)設(shè)施外表材質(zhì)根本都是不銹鋼和玻璃兩種，故外表試驗(yàn)法選用不銹鋼載片和玻璃 裁片模擬干凈區(qū)設(shè)施外表進(jìn)展驗(yàn)證試驗(yàn)。兩種試驗(yàn)方法作用的消毒劑見表。序號試驗(yàn)方法消毒劑1外表實(shí)驗(yàn)法75%乙 醇20.1%新潔爾滅溶液3定量懸浮試驗(yàn)法0.3%的新潔爾滅溶液40.1%新潔爾滅溶液50.5%醋酸氯己定溶液60.1%醋酸氯己定溶液現(xiàn)場考察試驗(yàn)局部

4、選擇車間D級的配液間、灌裝間設(shè)備外表消毒前和消毒后分別進(jìn)展 取樣，測定其微生物數(shù)量。3. 確認(rèn)前準(zhǔn)備3.1. 驗(yàn)證用試劑與材料3.1.1. 菌種序號名稱序列號1金黃色葡萄球菌CMCC(B)260032大腸埃希菌CMCC(B)441023枯草桿菌芽孢CMCC(B)63501白色念珠菌CMCC(F) 980013.1.2. 培養(yǎng)基序號名稱備注1營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)基經(jīng)121 C, 20min滅菌備用2宮養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基3胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基4胰酪大豆胨培養(yǎng)基5大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基接觸碟編號：BZW12085規(guī)格：55mm取樣面積為25m6玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)接觸碟編號：BZW151293.13消毒液擬定選用

5、的中和劑序號消毒劑名稱中和劑備注175%乙 醇中和劑經(jīng)20.1%新潔爾滅溶液1%卵磷脂+0.1%聚山梨酯80121 C，20min 滅30.2%的新潔爾滅溶液菌備用。3.14稀釋液0.9%無菌氯化鈉溶液NS3.1.5.器具與設(shè)備序號名稱1無菌移液管2錐形瓶3無菌試官4恒溫水浴鍋5恒溫恒濕培養(yǎng)箱6恒溫恒濕培養(yǎng)箱3.2. 驗(yàn)證用試劑與材料記錄見附錄1。4. 消毒劑消毒效力試驗(yàn)4.1. 中和劑鑒定試驗(yàn)4.1.1 .試驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^該試驗(yàn)，確認(rèn)所用的中和劑對對應(yīng)的消毒劑有良好的中和作用，對試驗(yàn)用菌劑與其恢復(fù)期培養(yǎng)示有害或不良影響。4.1.2. 菌液的制備與計數(shù)4.121金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌

6、芽抱菌工作菌液的制備接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽抱菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，3035C培養(yǎng)1824小時。取上述培養(yǎng)物用0.9 %無菌氯化鈉溶液做10倍系列稀釋成 1X1085X 108CFU/ml的工作菌液如肉湯培養(yǎng)物的濃度已為 1 X 1085X 108CFU/ml,可 不再用0.9 %無菌氯化鈉溶液稀釋。計數(shù)時，將1X 1085X 108CFU/ml的工作菌液10倍系列稀釋成含50100CFU/ml菌液, 并同時采用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基3035C培養(yǎng)2天計數(shù)。計算該稀釋級的平均菌落數(shù)，將計數(shù)結(jié)果換算成每毫升濃菌液的菌落數(shù)4.122白色念珠菌工作菌液的制備接種白色念珠菌的新鮮

7、培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中， 2328C培養(yǎng)2448小時。取上 述培養(yǎng)物用0.9 %無菌氯化鈉溶液做10倍系列稀釋成1O085Xl08CFU/ml的工作菌液如肉湯培養(yǎng)物的濃度已為1X 1085Xl08CFU/ml,可不再用0.9 %無菌氯化鈉溶液稀釋。計數(shù)時，將1X1085X108CFU/ml的工作菌液10倍系列稀釋成含50100CFU/ml菌液，并同時采用改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基 2328C培養(yǎng)3天計數(shù)。計算該稀釋級的平均菌 落數(shù)，將計數(shù)結(jié)果換算成每毫升濃菌液的菌落數(shù)。4.1.3. 鑒定試驗(yàn)操作配制9 75匯醇、0.1%新潔爾滅溶液、0.2%新潔爾滅溶液、40mg/L的二氧化氯、60mg/L 的二氧

8、化氯，具體操作執(zhí)行?清潔劑和消毒劑管理?。將配置好的消毒劑置20°C± 1C恒溫水浴鍋中備用。分組操作試驗(yàn)分組與稀釋操作方法簡表組號混合液A混勻作用10mi n混合液B混勻作用10mi n取混合液B或混合液B的稀釋級溶液0.5ml平板計數(shù)2皿/組取0.5ml工作菌液參加以下溶液中取混合液A 0.5ml參加以下溶液1消毒劑4.5ml稀釋液4.5ml混合液B 10-12消毒劑4.5ml中和齊U 4.5ml混合液B 10-13中和劑4.5ml稀釋液4.5ml10-2、10-34中和產(chǎn)物4.5ml消 毒液與中和劑比例為 1:1稀釋液4.5ml-2-310、05稀釋液4.5ml稀釋液

9、4.5ml10-2、10-36稀釋液和中和劑各 1.0ml注入無菌平皿中，各制備 2皿。具體操作第1組目的：觀察消毒液對試驗(yàn)菌有無殺滅或抑制能力操作： 取消毒劑4.5ml+工作菌液0.5ml，混勻作用10min后，取混合液0.5ml+稀釋液4.5ml，混勻作用10min,取0.5ml注皿，平行制備2皿。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽抱菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，倒置3035C培養(yǎng)3天計數(shù)；白色念珠菌用玫瑰紅鈉 瓊脂培養(yǎng)基，倒置2328C培養(yǎng)5天計數(shù)計數(shù)。第2組目的：觀察殘留消毒劑被中和后受到消毒劑作用后的試驗(yàn)菌是否恢復(fù)生長。操作：取消毒劑4.5ml+工作菌液0.5ml，混勻作用10min后，取

10、混合液0.5ml +中和劑4.5ml， 混勻作用10min,用稀釋液稀釋成10-1。分別取未稀釋溶液混合液0.5mll+中和劑4.5ml 的混合液與10-1 0.5ml注皿，各平行制備2皿。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草 桿菌芽抱菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，倒置于3035°C培養(yǎng)3天計數(shù)；白色念珠菌用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，倒置于2328C培養(yǎng)5天計數(shù)。第3組目的：觀察中和劑是否有抑菌性操作：取中和劑4.5ml+工作菌液0.5ml，混勻作用10min,取混合液0.5ml 1+稀釋液4.5ml， 混勻作用10min后，用稀釋液進(jìn)展10倍系列稀釋成10-2、10-3。取相應(yīng)稀釋級0.5ml注 皿，

11、各稀釋級平行制備2皿。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽抱菌用營養(yǎng)瓊 脂培養(yǎng)基, 倒置3035 C培養(yǎng)3天計數(shù)；白色念珠菌用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，倒置30 35C培養(yǎng)3天計數(shù)計數(shù)。第4組目的：觀察中和產(chǎn)物，或未被完全中和殘留消毒劑對試驗(yàn)菌的生長繁殖是否有影響。操作：取消毒劑和中和劑1:1的混合液4.5ml+工作菌液0.5ml，混勻作用10min,取混合液 0.5ml l+稀釋液4.5ml，混勻作用10min后，用稀釋液進(jìn)展10倍系列稀釋成10-2、10-3。 取相應(yīng)稀釋級0.5ml注皿，各稀釋級平行制備2皿。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯 草桿菌芽抱菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，倒置3035C培養(yǎng)3天

12、計數(shù)；白色念珠菌用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，倒置3035 C培養(yǎng)3天計。第5組目的：作菌落數(shù)對照用操作：取稀釋液4.5ml+工作菌液0.5ml，混勻作用10min,取混合液0.5ml 1+稀釋液4.5ml，混勻作用10min后，用稀釋液進(jìn)展10倍系列稀釋成10-2、10-3。取相應(yīng)稀釋級0.5ml注 皿，各稀釋級平行制備2皿。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽抱菌用營養(yǎng)瓊 脂培養(yǎng)基， 倒置3035C培養(yǎng)3天計數(shù)；白色念珠菌用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，倒置30 35C培養(yǎng)3天計數(shù)。第6組目的：作為陰性對照用操作：分別取稀釋液和中和劑各1.0ml注入無菌平皿中，各制備2皿。4.133結(jié)果判斷試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)符合

13、以下全部條件，判斷所選中和劑合格。第1組無菌生長，或僅有少數(shù)試驗(yàn)菌菌落生長。第2組菌落數(shù)比第1組菌落數(shù)多，但比第3、4、5組菌落數(shù)少，且符合下表要求第1組平板平均菌落數(shù)第2組平板平均菌落數(shù)05xx+5yy+0.5y第3、4、5組有相似菌落數(shù)生長，其每組間菌落數(shù)誤差率不超過15%計算公式如下：3組間菌落平均數(shù)-各組菌落平均數(shù)的絕對值之和誤差率=X100%3X3組間菌落平均數(shù)第6組無菌生長。否那么，說明試劑有污染，應(yīng)重新進(jìn)展試驗(yàn)。4.1.4. 中和劑鑒定試驗(yàn)記錄見附錄2。4.2. 定量懸浮試驗(yàn)4.2.1 .試驗(yàn)?zāi)康挠捎?.2%的新潔爾滅溶液、0.1%新潔爾滅溶液、60mg/L二氧化氯溶液、0.5%

14、醋酸氯己 定溶液、0.1%醋酸氯己定溶液是通過浸泡或液封消毒，通過定量懸浮試驗(yàn)，確定其消毒 效力是否符合要求。4.2.2 .試驗(yàn)操作配制9 0.2%的新潔爾滅溶液、0.1%新潔爾滅溶液、60mg/L二氧化氯溶液、0.5%醋酸氯己 定溶液、0.1%醋酸氯己定溶液，操作執(zhí)行?清潔劑和消毒劑管理?。將配置好的消毒劑 置20 C± 1C恒溫水浴鍋中備用。4.222由于0.2%的新潔爾滅溶液、0.1%新潔爾滅溶液中低效消毒劑，且不能殺滅芽抱，故定 量懸浮試驗(yàn)用菌為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌。0.5%醋酸氯己定溶液、0.1%醋酸氯己定溶液為高效消毒劑，能殺滅芽抱，故定量懸浮試 驗(yàn)用菌

15、枯金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、枯草芽抱桿菌。4.223將菌液制備成1O085Xl08CFU/ml的工作菌液，菌液的制備與計數(shù)同 。4.224將試管按需要分組排列在試管架上，試驗(yàn)組分3組4min、5min、6min各一組，并由左向右逐管標(biāo)明消毒劑、中和劑、10-1、10-2。對照組分1組，并由左向右逐管標(biāo)明稀 釋液、中和劑、10-1、10-2、10-3、10-4。向個試管參加4.5ml相應(yīng)的試劑，標(biāo)明10-1、10-2、10-3、10-4。參加4.5ml的稀釋液。吸取工作菌液0.5ml參加標(biāo)明消毒劑的試管中，對照組參加標(biāo)明稀釋液的試管中，迅速混勻，并開場計時。待菌液與消毒劑相互作用至

16、 8min、10min、12min,吸取菌液和消毒劑混合液0.5ml，參 加標(biāo)明中和劑的試管中，迅速混勻。中和作用10min后，吸取0.5ml參加標(biāo)明10-1的試管中，混勻后吸取0.5ml參加標(biāo)明 10-2試管中對照組以此類推，對照組直至 10-4。試驗(yàn)組分別取中和劑管、10-1、10-2管溶液1ml按平皿法測定存活菌數(shù)；對照組取 10-3、 10-41ml按平皿法測定存活菌數(shù)。每管平行制備 2皿。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽抱菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，倒置于3035C培養(yǎng)3天計數(shù)；白色念珠菌用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，倒置于2328C培養(yǎng)5天計數(shù)。4.2.3. 結(jié)果計算計算試驗(yàn)組和對照組的活菌

17、濃度CFU/ml，并換算為對數(shù)值N，并按下式計算殺滅對數(shù)值：殺滅對數(shù)值 (KL)=對照組平均活菌濃度的對數(shù)值NO-試驗(yàn)組活菌濃度對數(shù)值NX4.2.4. 可承受標(biāo)準(zhǔn)殺滅對數(shù)值 (KL)應(yīng)不低于35個對數(shù)單位。4.2.5. 定量懸浮試驗(yàn)記錄見附錄 34.3. 外表試驗(yàn)法4.3.1 .試驗(yàn)?zāi)康挠捎?5%醇、40mg/L二氧化氯溶液、0.1%新潔爾滅溶液是通過擦拭消毒，應(yīng)選用不銹鋼載片和玻璃裁片進(jìn)展外表試驗(yàn)法，確定其消毒效力是否符合要求。4.32菌種選擇由于75匯醇、0.1%新潔爾滅溶液中低效消毒劑，且不能殺滅芽抱，故定量懸浮試驗(yàn)用 菌為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌。0.5%醋酸氯己定溶液、

18、0.1%醋酸氯己定溶液為高效消毒劑，能殺滅芽抱，故定量懸浮試 驗(yàn)用菌枯金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、枯草芽抱桿菌。4.3.3. 工作菌液制備工作菌液的制備方法、濃度與驗(yàn)證同步計數(shù)操作同。4.3.4. 試驗(yàn)操作4.3.4.1 (1)染菌不銹鋼載片制備將經(jīng)滅菌的載片平鋪于無菌平皿，滴加金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌、白色念珠菌含 菌量為1X 1085X108CFU的菌液0.1ml，并均勻涂布于整個載體外表。滴染菌液后，載 片置超凈工作臺晾干后備用。每種菌平行制備兩個染菌不銹鋼載片。2染菌玻璃載片制備因培養(yǎng)皿的材質(zhì)為玻璃，故用培養(yǎng)皿代替玻璃載片進(jìn)展染菌試驗(yàn)。 進(jìn)展菌液滴染前，用 記號筆在培養(yǎng)

19、皿菌液滴染面的反面畫出染菌面積50mX 50mri，標(biāo)注清晰。菌液滴染 操作同染菌不銹鋼載片制備。4.3.4.2 試驗(yàn)組：將消毒劑擦拭在制備好的染菌載片上，消毒劑作用時間分別為8mi n、10mi n、12mi n,不銹鋼載片和玻璃載片每個作用時間分別制備2個。作用完畢后，用接觸碟取樣接觸碟規(guī)格：55mm取樣面積為25m。取金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽抱 菌用大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基接觸碟編號：BZW12085 ;取樣白色念珠菌用玫瑰紅鈉瓊 脂培養(yǎng)基接觸碟編號：BZW1512。接觸碟取樣方法：翻開接觸碟蓋，使無菌培養(yǎng)基外表與取樣面直接接觸， 均勻按壓接觸 碟底板，確保全部瓊脂外表與取樣面

20、外表均勻接觸10秒左右，在蓋上跌蓋。對照組對照組的活菌濃度計數(shù)見。.陰性對照：用接觸碟在已滅菌的載片上未染菌片的載按壓取樣，操作同上。每種載片與每種接觸碟平行制備兩份。4.3.4.3 培養(yǎng)將取樣金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽抱菌的接觸碟倒置于3035C培養(yǎng)3 天計數(shù)；取樣白色念珠菌的接觸碟倒置于 2328C培養(yǎng)5天計數(shù)計數(shù)。4.344結(jié)果計算計算試驗(yàn)組和對照組的活菌濃度CFU/m，并換算為對數(shù)值N，并按下式計算殺滅對數(shù)值：殺滅對數(shù)值 KL=對照組平均活菌濃度的對數(shù)值NO-試驗(yàn)組活菌濃度對數(shù)值NX 可承受標(biāo)準(zhǔn)殺滅對數(shù)值 KL應(yīng)不低于35個對數(shù)單位。4.3.5. 外表試驗(yàn)法記錄見附錄54.4. 現(xiàn)場考察試驗(yàn)4.4.1. 消毒前對干凈區(qū)進(jìn)展外表微生物取樣。取樣地點(diǎn)：D級車間的配料間墻壁和設(shè)備外表、灌裝間墻壁和設(shè)備外表、中間站墻壁外 表。取樣操作與檢驗(yàn)執(zhí)行?外表微生物檢驗(yàn)?。4.4.2. 生產(chǎn)操作完畢后操作人員按照?生產(chǎn)區(qū)清潔?對干凈區(qū)進(jìn)展清潔消毒。4.4.3. 清潔消毒完畢15分鐘后，現(xiàn)場QA對清潔消毒后的干