生物芯片技術(shù)

1、Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics生物芯片技術(shù)生物芯片技術(shù)溫州醫(yī)學院檢驗醫(yī)學院生命科學學院溫州醫(yī)學院檢驗醫(yī)學院生命科學學院分子生物學檢驗技術(shù)分子生物學檢驗技術(shù) 第九章第九章免疫共沉淀（Co-IP）Pull down assay章節(jié)提要 生物芯片始于上世紀90年代，隨著人類基因組計劃而誕生的一項新技術(shù)。它是由Southern印跡技術(shù)衍生而來，是一門多學個交叉的綜合技術(shù)，這項技術(shù)涉及到了生命科學、計算機、微機械、微電子、物理、化學、數(shù)學等領(lǐng)域。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics

2、定義：通過微加工和微電子技術(shù)，在固相基質(zhì)表面集成了成千上萬密集排列的分子微陣列，以實現(xiàn)對組織，細胞，核酸，蛋白質(zhì)及其他生物分子進行有效、準確、高通量的檢測。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics章節(jié)提要 種類：基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、組織芯片、液相芯片、縮微芯片實驗室。 各類芯片的定義。 最終目標：把生物和化學等領(lǐng)域所涉及的樣品制備，生化反應(yīng)和檢測分析的整個過程集成化，并縮微到一張芯片上自動完成，形成縮微芯片實驗室。章節(jié)提要章節(jié)提要 芯片技術(shù)的優(yōu)點：多樣品并行處理、分析速度快、所需樣品量少、污染少。 應(yīng)有的領(lǐng)域：基礎(chǔ)研究、臨床診斷、藥物篩選

3、，指導用藥與治療、農(nóng)作物優(yōu)育優(yōu)選、環(huán)境檢測、衛(wèi)生監(jiān)督、司法鑒定。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 以結(jié)構(gòu)與工作機制可分為微陣列芯片與微流體芯片 微陣列芯片：由生物材料微陣列構(gòu)成的芯片，以分子間的親和結(jié)合作為核心，以在固相載體表面固定一系列可尋址的識別分子陣列為結(jié)構(gòu)特征，如堿基配對，抗原抗體結(jié)合，包括基因芯片，蛋白質(zhì)芯片，組織芯片等。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics章節(jié)提要 微流體芯片：以微管道網(wǎng)絡(luò)為結(jié)構(gòu)特征，實現(xiàn)對各種生化組分的微流控操作和分析，包括毛細管電泳芯片，PCR

4、反應(yīng)芯片等 縮微芯片實驗室優(yōu)勢：將樣品制備、生化反應(yīng)、檢測等過程集成在一個系統(tǒng)中。它是未來芯片發(fā)展的主流方向之一，也是生物芯片發(fā)展的最終目標。章節(jié)提要Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics本章節(jié)主要的學習內(nèi)容本章節(jié)主要的學習內(nèi)容 基因芯片（gene chip） 蛋白質(zhì)芯片（protein chip） 縮微芯片實驗室（laboratory on a chip） Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics第一節(jié)第一節(jié) 基因芯片基因芯片 基因芯片(gene chip)又稱DNA芯片（DNA c

5、hip）或DNA微陣列（DNA microarray）。 將大量的基因片段有序地、高密度地排列在玻璃片或纖維膜等載體上，稱之為基因芯片。 DNA Microarray 的原理 經(jīng)過標記的待測樣品DNA通過與芯片上特定位置的探針按堿基配對原理雜交后，經(jīng)激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進行掃描，通過檢測雜交信號強度來獲取樣品分子的數(shù)量與序列信息，用計算機軟件進行數(shù)據(jù)比較與分析，從而對基因序列及功能進行大規(guī)模，高通量的研究。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics一、基因芯片的原理 基因芯片技術(shù)是建立在基因探針和雜交測序技術(shù)上的一種 高效、快速 核

6、酸序列分析手段。 同時也是最先發(fā)展，最為成熟，最先商品化的生物芯片 芯片分類 載體不同：玻璃芯片、膜芯片、硅芯片、陶瓷芯片 方法不同：原位合成、直接點樣 探針不同：寡核苷酸、cDNA、基因組芯片 用途不同：表達譜、測序芯片、診斷芯片、SNP分型分析步驟為：分析步驟為： 生物芯片的制作、樣品處理及標記、雜交或反應(yīng)、雜交檢測及數(shù)據(jù)處理等。 芯片設(shè)計芯片制作PCR擴增靶基因標記原位合成點樣方法實際應(yīng)用樣品處理芯片雜交數(shù)據(jù)分析雜交檢測放射顯影光化學電化學酶促反應(yīng)芯片技術(shù)發(fā)展的關(guān)鍵 無孔的固相載體，如玻璃 高密度寡核苷酸片段的原位合成技術(shù)Zhejiang Provincial Key Lab of Me

7、dical Genetics載體的定義與種類 定義：用于連接、吸附或包埋各類生物分子使其以水不溶性狀態(tài)行使功能的固相材料。 玻片 固體片狀 硅片 瓷片 硝酸纖維素膜 膜性材料 尼龍膜 聚丙烯膜 具有可以進行化學反應(yīng)的活性基團，便于與生物分子進行偶聯(lián)。 要有惰性與穩(wěn)定性：惰性（非特異吸附和其他性能不干擾生物分子的動能）穩(wěn)定性（能承受一定的壓力與酸堿條件的變化） 良好的兼容性(便于制作其他類型的芯片)載體材料的要求載體材料的要求載體的表面處理 原因：核苷酸片段無法直接連接到載體表面，故需要活化，便于固定生物分子。 試劑：碳二亞氨，N-羥基琥珀酰亞胺酯。 活性基團：氨基、羥基、巰基、醛基 處理依據(jù)：

8、載體表面性質(zhì)、生物分子的化學特征常見載體 薄膜狀載體 優(yōu)點：與核酸親和力強、技術(shù)成熟。 膜結(jié)合玻璃片 優(yōu)點：親和性、剛性Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics處理載體的基本要求 修飾后表面要均勻且硬質(zhì) 有效固定各種類型生物材料 在激發(fā)光下，熒光背景低 高密度，大量，均勻的點陣，變異系數(shù)小Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics探針固定到固相支持物上，方法有兩種：探針固定到固相支持物上，方法有兩種： 光去保護并行合成法原位合成 分子印章原位合成法 噴印合成法（壓電打印法） 合成點樣 通過

9、特定的高速點樣機器人直接將探針點在芯片上的技術(shù)。 合成cDNA探針的原則 設(shè)計于目的cDNA的3端。 避免長片段重復(fù)序列 長度為0.1-2.5kbZhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics寡核苷酸探針 長度16-26bp，G+C在40-60% 探針內(nèi)不用大于4bp的堿基互補配對序列，同一個堿基連續(xù)出現(xiàn)小于4個 與非靶序列的同源性低于70%，小于8個堿基相同。 設(shè)置多個序列相近的參考寡核苷酸探針。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics點突變檢測核苷酸探針 設(shè)計方法：等長移位設(shè)計法 按靶序列

10、從頭到尾依次去一定長度的互補的核苷酸序列組成的一套探針組合。這套探針是野生型探針，然后對每一野生型探針中間的某一堿基用其他三種堿基替代。 主要目的：進行點突變掃描Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics探針在載體表面的固定（一） 合成點樣法：通過PCR擴增或人工合成序列，通過計算機控制的三坐標工作平臺，用針頭和微噴頭分別把探針溶液分配在固相載體表的位點上，通過物理或化學法固定探針。 優(yōu)點：技術(shù)成熟，靈活性大，適用于單位自行合成。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 在硬質(zhì)表面上直接合

11、成寡核苷酸探針序列 原位光刻合成法、壓電打印合成法，分子原位合成法。 技術(shù)瓶頸：高空間分辨率的模板點位技術(shù)、高合成效率的DNA化學合成技術(shù) 優(yōu)點：標準化，規(guī)?；痁hejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics探針在載體表面的固定（二）Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics原位合成的原理原位合成的原理 基因芯片的原位合成法是基于組合化學的合成原理。 它通過一組定位模板來決定基片表面上不同化學單體的偶聯(lián)位點和次序，如要合成AGCT四種堿基所有序列組合的四聚體(44種)。 Zhejiang Prov

12、incial Key Lab of Medical Genetics原位光刻合成法原位光刻合成法 主要步驟為：1.首先用光敏保護支持物活化基團2.選擇合適的蔽光膜保護不需要聚合的地方，暴露需要聚合的位點3.在激光點光源的照射下，去除光敏感保護基團，使該位點顯露出活性的羥基或者氨基4.加入的單核苷酸，與活化端發(fā)生化學反應(yīng)5.然后更換蔽光膜，重復(fù)上步驟，完成核苷酸的固定連接（見圖）。 優(yōu)點：在較小的區(qū)域制造大量不同的探針。圖9-2基因芯片原位合成原理示意圖 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics噴印合成法（壓電打印法）噴印合成法（壓電打印法）

13、 原理： 墨盒內(nèi)所用的ATCG四種堿基而非碳粉。 步驟： 將特定的DNA堿基合成試劑噴灑到特定位置上，以固相合成的原理與支持物發(fā)生偶聯(lián)，然后固定，沖洗，去保護，偶聯(lián)，直至合成完所需長度的探針。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics分子印章原位合成法分子印章原位合成法 分子印章的制備和壓印過程如見圖Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics（三）合成點樣（三）合成點樣 由具有多個微細加樣孔的陣列復(fù)制器(arraying and replicating device，ARD)或陣列器及由電

14、腦控制的機器人來完成。 機器人準確、快速地將不同探針樣品定量(0.251.0l)點樣于預(yù)處理好的基板相應(yīng)位置上，在基板上產(chǎn)生直徑為100150m斑點，再由紫外線交聯(lián)固定后即得到DNA微陣列或芯片。 合成點樣法分類 接觸式點樣 噴墨式打印 定位準確，重復(fù)性好 斑點大，大小分布不均，密度低。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical GeneticsZhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics二、樣品的制備及標記二、樣品的制備及標記（一）樣品的制備 樣品的擴增 在標記和分析前對樣品進行適當程度的擴增，以提高閱讀靈敏

15、度。 待測樣品的標記 多采用熒光標記（cy3、cy5和FAM）方法，對于陣列密度較小的基因芯片可以用同位素檢測法。 熒光標記的優(yōu)點 激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的STOCKs位移大，故分辨率強，靈敏度高 可以進行定量檢測 避免放射性同位素好的污染。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics三 樣品與基因芯片的雜交 本質(zhì)：DNA探針與靶基因堿基雜交形成DNA雙鏈或DNA/RNA雜合鏈。 影響因素： 靶分子濃度 探針濃度 序列組成 鹽濃度 雜交溫度 反應(yīng)時間基因表達檢測低溫，高鹽，長時間突變檢測高溫，低鹽，短時間Zhejiang Provincial

16、Key Lab of Medical Genetics四、雜交結(jié)果的檢測 檢測方法很多，如熒光顯影法熒光顯影法、質(zhì)譜法、化學發(fā)光和光導纖維等。 熒光檢測器 激光共聚焦 快速傳輸 高質(zhì)量圖像，靈敏度高，分辨率好 價格昂貴 偶聯(lián)裝置照相機 掃描速度快，價格便宜 靈敏度低熒光顯影法 完全匹配產(chǎn)生的熒光強度比存在一兩個錯配的高5-35倍 熒光強度與待測分子的含量呈線性關(guān)系 問題 只要結(jié)合就會有陽性信號，無法確認是否完全匹配 解決方法 使用多色熒光技術(shù)不同靶基因使用不同激發(fā)波長的熒光標記物。芯片激光光源電子束分裂器聚焦小孔檢檢測測器器濾光鏡聚光鏡物鏡使用最廣泛的是熒光顯影法光纖DNA生物傳感器微陣列 原

17、理： 將合成的氰尿酰氯活化的探針固定在光纖的末端，集成含有不同探針的光纖，形成傳感裝置，探針伸入樣品中，信號由另一端的CCD檢測。 優(yōu)勢 方便，可在沒有confocal的實驗室中開展實驗。五、雜交結(jié)果的分析 標準化：消除不同芯片，不同標記物的差異 數(shù)據(jù)精簡：去掉無顯要意義的數(shù)據(jù) 統(tǒng)計學分析：對數(shù)據(jù)進行分析歸類，并進行統(tǒng)計學檢驗，保證器準確性 生物學意義分析：基于統(tǒng)計結(jié)果，研究其代表的生物學意義，得出相應(yīng)結(jié)論 數(shù)據(jù)庫：Genesist，AMADA，TIGR。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics三、基因芯片技術(shù)在醫(yī)學領(lǐng)域的應(yīng)用三、基因芯片技

18、術(shù)在醫(yī)學領(lǐng)域的應(yīng)用 基因芯片技術(shù)的基本應(yīng)用可以分為兩個主要方面： 定量分析（主要指測序和突變檢測） 定性分析（主要指對基因表達的研究）。 基因功能研究 基因表達及調(diào)控的研究 基因突變和多態(tài)性的檢測 DNA序列的測定 基因組及基因研究基因表達及調(diào)控的研究 基因芯片應(yīng)用最廣泛的領(lǐng)域 從整體上分析細胞基因表達狀況，為了解與某些生命現(xiàn)象相關(guān)的基因表達提供有力的證據(jù)，對于基因調(diào)控以及基因相互作用機理的探討有重要的意義基因突變和多態(tài)性的檢測 利用基因芯片技術(shù)對一些突變點的定位、確認及分類是診斷基因疾病的基礎(chǔ)。 寡核苷酸芯片能夠檢出變異位點，被代替的核苷酸以及變異的特性。 例如：HIV病毒RT與PRO的突變

19、檢測。DNA序列測定 原理：任何線性DNA或RNA單鏈都可以被分解為一系列堿基數(shù)固定，錯落重疊的寡核苷酸片段，或稱為亞序列，只要測出莫伊核苷酸的全部亞序列，就可以還原原序列。 優(yōu)點 快速、成本低、易于自動化 缺點 雜交條件不統(tǒng)一、易出現(xiàn)假性結(jié)果、重復(fù)序列無法測定。 優(yōu)勢 測定已知序列、研究突變與SNP檢測?；蚪M及基因研究 研究酵母基因組的復(fù)制活動：發(fā)現(xiàn)其復(fù)制起點、復(fù)制叉在基因組的移動與S期復(fù)制和轉(zhuǎn)錄活動的關(guān)系 優(yōu)勢： 用量少、自動化、便于大量篩選新基因 基因芯片應(yīng)用于疾病診斷的優(yōu)勢 靈敏、準確、快速、簡單、高通量（同時檢測多種疾?。?yīng)用： 感染性疾病診斷 出生缺陷檢測 遺傳性疾病的診斷 HL

20、A配型檢測 腫瘤診斷及分型 神經(jīng)系統(tǒng)疾病檢測 耐藥性檢測疾病診斷感染性疾病診斷 流程 將待測病原體的特征基因片段或寡核苷酸探針固定于玻片上制成芯片，從患者的血清中提取的病原DNA或RNA經(jīng)擴增標記熒光后與芯片進行雜交，掃描雜交信號，計算機分析，得出定性或定量的結(jié)果。 由于病原微生物的不同亞型，不同的突變株會導致患者的發(fā)病程度，患者對藥物的敏感程度等的差異，故對病原微生物的分型，可以幫助醫(yī)生了解患者的病情，確定最佳治療方案。 如HPV亞型123種，其中20種高危，提前診斷HPV感染，有利于防止宮頸癌變，降低死亡率?；蛐酒贤瑫r對21種不同類型的HPV診斷，3.5小時完成。感染性疾病診斷遺傳性疾

21、病的診斷 現(xiàn)行診斷遺傳學疾病方法（PCR，測序、RFLP）的共同缺點通量低。 遺傳性疾病中可能是由眾多位點中的一個或多個位點突變引起的，因此對多位點檢測尤為重要。 如beta-地中海貧血，突變100種以上。 應(yīng)用于血友病，杜氏肌營養(yǎng)不良癥、苯丙酮尿癥，血紅蛋白異常病。腫瘤診斷及分型 獲取腫瘤細胞生長各期與腫瘤生長相關(guān)基因的表達模式 篩選出哪些分子起關(guān)鍵性的調(diào)控作用的基因 腫瘤分型（乳腺癌） 應(yīng)用如p53基因突變檢測耐藥性檢測 病原微生物的表達譜檢測 突變分析 多態(tài)性分析 目的指導抑制靶分子的新藥合成、臨床用藥基因芯片在藥物研究中的應(yīng)用 可直接在基因水平上尋找藥物靶標，解釋作用機理，檢測藥物的毒

22、副作用，為藥物開發(fā)與設(shè)計提供理論依據(jù)。作用體現(xiàn)：代替人體的靶組織分析代謝途徑與信號通路確定藥物作用的靶組織引導藥物開發(fā)縮短周期，便捷基因芯片存在的問題探針合成中會插入雜質(zhì)，降低特異性制備標記過程比較復(fù)雜。數(shù)據(jù)缺乏可比性，不利于芯片數(shù)據(jù)的共享 產(chǎn)生原因：蛋白質(zhì)的表達與其上游的mRNA的表達未顯示出直接關(guān)系。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或構(gòu)象的微小變化均能導致其活性與功能的改變定義：是指固定于支持介質(zhì)上的多肽或蛋白質(zhì)構(gòu)成的微陣列第二節(jié)第二節(jié) 蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片第二節(jié)第二節(jié) 蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片第二節(jié)第二節(jié) 蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genet

23、ics第二節(jié)第二節(jié) 蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片 蛋白質(zhì)芯片技術(shù)是一種快捷、高效、并行、高通量、微型化和自動化的蛋白質(zhì)分析技術(shù)。 蛋白質(zhì)芯片適用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA、蛋白質(zhì)-RNA、蛋白質(zhì)-小分子物質(zhì)間相互作用的分析。 是功能基因組、蛋白質(zhì)組研究領(lǐng)域中一種新型的重要工具。蛋白質(zhì)芯片 原理：采用機械點樣或共價結(jié)合等方法將多肽、蛋白質(zhì)、酶、抗原或抗體固定于固相載體上形成分子點陣，并將待測蛋白質(zhì)與該芯片進行孵育反應(yīng)，再將熒光標記的蛋白質(zhì)與芯片蛋白質(zhì)復(fù)合物反應(yīng)。通過掃描系統(tǒng)檢測個點的熒光強度，分析蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，由此達到測定蛋白功能的目的。蛋白質(zhì)芯片的分類蛋白質(zhì)芯片的分類 蛋白質(zhì)功能

24、芯片 天然蛋白質(zhì)點在基片上，用于蛋白活性及分子親和性的高通量平行分析。 蛋白質(zhì)檢測芯片 將高度親和特異性的探針分子（mAb）點在基片上，用以檢測復(fù)雜樣品中目的蛋白。蛋白質(zhì)芯片的分類蛋白質(zhì)芯片的分類1. 支持物表面高度密集排列探針蛋白點陣 微陣列 微孔板 測定時，特異性地捕獲樣品中的靶蛋白，然后通過檢測系統(tǒng)對靶蛋白進行定性及定量分析?？贵w為常用的探針蛋白。2. 三維凝膠塊芯片 實質(zhì)是在基片上點布以10000個微小PAGE膠塊，主要用于篩選抗體抗原，酶動力學反應(yīng)的研究。 優(yōu)點：靈敏、蛋白結(jié)構(gòu)天然蛋白質(zhì)芯片的制備與分析 載體 探針蛋白的制備 探針的固定 檢測載體 要求：穩(wěn)定性，兼容性 種類：化學膜

25、尼龍膜、硝酸纖維素膜、聚苯乙烯膜無需復(fù)雜的表面處理 背景高，靈敏度低PAGE膠 儲水環(huán)境保持探針活性，除反應(yīng)液困難微孔板 性能良好，探針分隔良好交叉污染程度低，液相保持探針活性玻片 為最佳載體 需表面修飾（醛基、BSA、poly-lysine） 高通量 自動化 效率高 探針的制備 種類：抗體、抗原、蛋白質(zhì)、配體、受體、酶、核酸、多肽 要求：親和性強、特異性高。 應(yīng)用最廣泛的探針：抗體，抗原，尤其是mAbZhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics探針蛋白的制備 蛋白質(zhì)芯片上的探針蛋白可選用抗體、抗原、受體、酶等具有生物活性的蛋白質(zhì)。單克隆抗體是比較好的一種探針蛋白。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics探針的固定體外合成的劣勢 多肽長度不易控制、探針活性位置點加法： 手工點樣 接觸式點樣 噴墨點樣法固定后，需用BSA溶液封閉提高特異性Zhejiang Provincial Key L