擬南芥的室內(nèi)培養(yǎng)技術(shù)進展_百度文庫

1、第 25卷 第 4期 Vol. 25No. 4新鄉(xiāng)學(xué)院學(xué)報 (自然科學(xué)版 Journal of Xinxiang Univer sity(Natural Science Edit ion2008年 12月 Dec. 2008擬南芥的室內(nèi)培養(yǎng)技術(shù)進展 *高英杰 , 張 瑋 , 趙軍鋒 , 劉玉良 , 趙立群 *(河北師范大學(xué) 生命科學(xué) 學(xué)院 , 石家莊 050016摘 要 :綜述了擬南芥培養(yǎng)過程中常見的問題及 解決方法 , 并介紹了一些實踐經(jīng)驗 。關(guān)鍵詞 :擬南芥 ; 種植 ; 室內(nèi)培養(yǎng)中圖分類號 :S852. 613文獻標(biāo)志碼 :A 文章編號 :167423326(2008 042004520

2、4Indoor Culture Techniques of Arabidopsis ThalianaGAO Ying 2jie, ZHANG Wei, ZHAO Jun 2feng, LIU Yu 2liang, ZHAO Li 2qun *(School of Life Sciences, Hebei Nor mal University, Shijiazhuang 050016, ChinaAbstr act:It is expected that this paper might be an available reference for the resear ches on Arabi

3、dopsis thaliana. Key words:Ar abidopsis thaliana; plant; indoor culture0引言擬南芥 (Ar abidopsis thaliana 雖然沒有經(jīng)濟價 值 , 但是作為高等植物中具有最少基因組的物種 , 在 科學(xué)研究中的地位是極為重要的。 1目前 , 作為植物 分子生物學(xué)研究必不可少的模式植物 , 在實驗室中 被廣泛地種植。 2室內(nèi)培養(yǎng)不僅可以得到試驗所需的材料 , 也可 以打破自然條件的限制對擬南芥進行各種誘導(dǎo) , 為 擬南芥新品種的培養(yǎng)和種性的改良提供便利條件 , 掌握擬南芥室內(nèi)培養(yǎng)技術(shù)對順利開展植物發(fā)育生物 學(xué)的研究具有重

4、要的意義。擬南芥屬于較難培養(yǎng)的植物 , 許多因素制約著 它的正常生長和發(fā)育。從嘗試進行擬南芥室內(nèi)培養(yǎng) 到現(xiàn)在已有 20多年的歷史 , 擬南芥室內(nèi)培養(yǎng)方法已 經(jīng)得到長足發(fā)展 , 各種技術(shù)也已日臻成熟。1擬南芥室內(nèi)培養(yǎng)方法研究擬南芥室內(nèi)培養(yǎng)一般從種子春化開始 , 經(jīng)歷消 毒、 育苗、 移栽、 后期管理、 種子收集及保存等階段。 通常采用水培和土培兩種方法。1. 1水培法直播水培法是實驗室中常用的一種方法 , 它適 合于高通量的擬南芥突變體的篩選。做法是自制一 套水培裝置 , 取大小不同的兩個一次性塑料杯 , 大杯 容積 500ml, 小杯容積 300ml 。先將小杯口上縫一 層尼龍篩網(wǎng) , 篩網(wǎng)上

5、放一張剪有 15個均勻分布著小 孔的濾紙 , 并剪去杯底 , 將其置于大杯中 ; 種子點播 在 15個小孔內(nèi) ; 將營養(yǎng)液倒入大杯中 , 液面與小杯 內(nèi)的濾紙齊平 ; 在大杯的外面粘一層深色避光紙 , 可 有效防止綠藻的產(chǎn)生。播種后的第一周要及時添加 營養(yǎng)液以保持種子濕潤 ; 種子發(fā)芽后 , 移去濾紙 , 每 周更換一次營養(yǎng)液 , 營養(yǎng)液液面離篩網(wǎng) 0. 5cm 為 宜 , 這樣可防止霉菌生長。無菌直播水培法作為直播水培法的改進也較為 常用 , 即采用一種耐高溫材料作培養(yǎng)盒 , 用 80目的 篩網(wǎng)做成盒子 , 放入培養(yǎng)盒 中 , 底 部與培養(yǎng) 盒中的 1/4MS 無機鹽營養(yǎng)液 3面緊貼。種植方

6、法是用毛 筆將處理后的種子輕輕均勻地涂抹在篩網(wǎng)上 , 然后 放入培養(yǎng)箱中。種子在播種后 2d 即可萌發(fā) , 5d 后 根長約 1cm 。這種方 法的優(yōu)點是所用材料全部可 以滅菌 , 在超凈工作臺中進行播種能有效地防止雜# 45 #*收稿日期 :2008210218基金項目 :人事部及河北省留學(xué)回國人 員擇優(yōu)科研啟動經(jīng)費資助項目 (項目編號 :200712作者簡介 :高英杰 (1978- , 男 , 河北饒陽人 , 河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實驗師 , 碩士 , 研究方向 :植物組織培養(yǎng)。 通訊作者 :趙立群 (1970- , 博士 , 河北師范大學(xué)生命科學(xué) 學(xué)院副教授 , 碩士 生導(dǎo)師 , 研究

7、方向 :植物細 胞信號轉(zhuǎn) 導(dǎo)。 E 2 mail:zhaolq70yahoo. cn.菌污染 , 保證后續(xù)實驗順利進行。除此之外 , 采用尼龍篩網(wǎng)和海綿縫在一起作為 種子生長界面培養(yǎng)擬南芥的方法也較常見。劉峰等 則采用離心管培養(yǎng)擬南芥幼苗 , 即先將 1. 5ml 離心 管去掉底部 , 將配置好的 MS 培養(yǎng)基 (瓊脂 5. 5g/L, pH 5. 7 放入離心管內(nèi) , 離心管固定在營養(yǎng)液上 , 種 子均勻播于培養(yǎng)基表面 , 每個離心管內(nèi)少于 5粒種 子 , 移入光照培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng) , 約 5天幼苗的根可 穿過離心管 , 并根據(jù)情況適當(dāng)間苗。 41. 2土培法土培法可分為移栽法和直播法。直播

8、法即直接 將種子播種在培養(yǎng)介質(zhì)上 ; 移栽法則是將培養(yǎng)基上 生長一段時間的幼苗移栽到培養(yǎng)介質(zhì)上進行再次培 養(yǎng)的方法。其中移栽法種子萌發(fā)率高 , 幼苗生長狀 態(tài)更加均一 , 較傳統(tǒng)的直播法更有優(yōu)勢。根據(jù)擬南 芥生長培養(yǎng)介質(zhì)的不同可分為多種土培法 :蛭石培 養(yǎng)法、 沙培法、 混合土培養(yǎng)法等 , 現(xiàn)在比較通用的是 混合土培養(yǎng)法。我們實驗室經(jīng)過 10余年的逐漸摸 索 , 找到了自己的有效種植方式 :培養(yǎng)介質(zhì)為營養(yǎng) 土 B 蛭石 =4B 6的混合土 , 種子春化處理后直接均 勻撒在用自來水澆透的營養(yǎng)介質(zhì)表面 , 不需蓋土 , 擬 南芥種子 3d 可以發(fā)芽。專門為種植擬南芥設(shè)計的 培養(yǎng)盤由蓋子、 種植穴盤

9、、 底等三部分組成 , 尺寸為 寬 0. 5m 0. 25m 。其中種植穴盤的規(guī)格有 8、 32、 50穴等 , 可根據(jù)實際需要選用。我們改變了以往由 上向下的傳統(tǒng)澆水方法 , 澆水時 , 把水倒入培養(yǎng)盤即 可 , 水可由穴盤的小孔直接倒吸入種植穴盤的培養(yǎng) 基質(zhì)中 , 這樣就不會因為澆水而傷害到弱小的擬南 芥幼苗。移栽法是這一方法的改進 , 培養(yǎng)基質(zhì)仍為 營養(yǎng)土與蛭石的混合物。具體做法是 :首先對種子 消毒 , 擬南芥種子經(jīng)表面 (75%乙醇 , 30s; 無菌水洗 3次 和深層 (2. 5%次氯酸鈉 , 8min, 無菌水洗 6次 消毒。然后 , 播種在固體 MS 培養(yǎng)基上 (1%蔗糖、 0

10、. 8%瓊脂粉、 1Murashige and Skoog 鹽和維生素 , pH 5. 8 , 4e 暗中春化 72h 。第三步 , 培養(yǎng)箱中培 養(yǎng) :用封口膜將播種了擬南芥種子的平皿密封好 , 轉(zhuǎn) 到光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng) , 溫度為 22e , 光周期為 16h 光照 (7000lx /8h 黑暗。 10d 后將擬南芥幼苗移 栽到溫室營養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng) (溫室條件 :溫度 22e , 濕度 60%80%, 光周期為 16h 光照 /8h 黑暗 , 光 照強度 60008000lx, 用自來水 35d 澆灌一次。 采用此法 , 我 室得到了很好 的實驗材 料 , 如表 1所 示。2影響擬南芥幼苗生長

11、的因素表 1我室培養(yǎng)擬南芥的生長發(fā)育情況統(tǒng)計培養(yǎng)方法 成活率/%始花時間/周開花時株高/cm蓮座直徑/cm果莢長度/cm每莢種子數(shù)生活周期 /周移栽法 99. 94510155811. 5355079水培法只適用于短期的擬南芥幼苗培養(yǎng) , 土培 法在實際操作中更為實用 , 實驗室一般都采用這種 方法。擬南芥幼苗在介質(zhì)中生長的后期管理不僅可 以影響到當(dāng)代的表型觀察 , 而且會影響種子的質(zhì)量 , 對后續(xù)工作極為重要。這一階段要注意觀察 , 精心 維護 , 保持充足的水分、 適宜的光照、 溫度和濕度 , 對 病蟲害更要做到早防早治 , 只有這樣才能培養(yǎng)出適 合作為研究材料的擬南芥植株。 5-72.

12、1土壤 pH 值擬南芥植株 相對較小 , 對于酸堿度 比較敏感 , pH 值是擬南芥生長 的影響因素之一 , 擬南 芥在偏 酸的環(huán)境下生長較好。在育苗期間 , MS 培養(yǎng)基的 pH 值應(yīng)調(diào)整在 5. 55. 8之間 , 過高或過低會降低 種子的發(fā)芽率。直播法播種時或者移栽法將幼苗移 栽入室內(nèi)時 , 選擇的培養(yǎng)介質(zhì)也以偏酸為宜 , 可以在 種植前測量一下培養(yǎng)介質(zhì)的酸堿度 , 以免造成植株 不能成活的結(jié)果。后期管理追加營養(yǎng)液時 , pH 值 也要調(diào)整在 5. 55. 8之間。培養(yǎng)介質(zhì)為酸性時 , 直 接澆自來水?dāng)M南芥即可正常生長。 82. 2溫度擬南芥對溫度的要求比較寬松 , 在自然條件下 (溫度

13、為 830e , 日平均溫度小于 22e 擬南芥植 株可以正常生長。但是自然條件制約的生長周期和 生長時間的不確定性 , 不能保證科研工作的正常開 展。溫度可影響擬南芥生長速度 , 2022e 培養(yǎng) , 擬南芥生長速度較慢 , 生長期長 ; 2528e 培養(yǎng) , 擬 南芥生長較快 , 生長期短。短時間的溫度過高不會 造成太大影響 , 若時間過長 , 植株的開花和結(jié)果都會 受到影響 , 甚至?xí)绊懟ㄆ鞴傩纬?, 花苞易干枯 ; 有 的花雖能形成果實 , 但多內(nèi)空或種子小 , 不飽滿。所 以為了避免受到自然條件的限制 , 我們建議室內(nèi)種 植培養(yǎng)溫度一般設(shè)定為 2225e 。2. 3光照光對擬南芥幼

14、苗的影響可分為光照強度和光周 期兩方面。室內(nèi)培養(yǎng)中光照強度是一個容易忽視的 問題 , 光照強度弱會使擬南芥葉子顏色發(fā)黃發(fā)灰 , 植# 46 #株較 弱。 培養(yǎng) 箱 和 培養(yǎng) 室 中的 光 照 強度 應(yīng) 該 在 60008000lx 之間。光周期一般設(shè)為 16h 光照 / 8h 黑暗 , 培養(yǎng) 45周后開花。作為長日照植物 , 擬南芥在強光和長日照下則提前開花。例如 , 24h 的光照條件使培養(yǎng)的擬南芥幼苗提前至 3周左右開 花 , 植株略顯瘦 弱 , 未 見其他生 長異常。在 8h 光 照 /16h 黑暗的光照條件下 , 擬南芥生長期延長 , 開 花約需 8周。 62. 4水份含量擬南芥是喜濕

15、潤的植物 , 水對擬南芥的影響可 分為培養(yǎng)介質(zhì)中的水分和空氣中的水分兩方面的影 響。在播種期、 生長期及成熟期對水分都有嚴格的 要求。在移栽法中 , 在玻璃平皿中育苗時 , 小苗在 MS 培養(yǎng)基上密封生長 , 對培養(yǎng)箱的濕度要求較低 , 擬南芥生長良好。移栽時 , 一定先將培養(yǎng)基質(zhì)澆透 , 現(xiàn)在較通用的方法是在育苗盤底部加水 , 讓培養(yǎng)介 質(zhì)充分吸水 ; 移栽后也用這種方法澆水。為保持直 播法種子萌發(fā)時需要的較高空氣濕度 , 可用塑料保 鮮膜覆蓋培養(yǎng)盆 , 膜上可扎幾個通氣孔 , 出苗后 5天 將膜揭開。要遵循不干不澆、 澆透干透的原則。注 意嚴格控制澆水次數(shù) , 澆水的次數(shù)應(yīng)根據(jù)實際情況 而

16、定 , 澆水過多不利于壯根 , 介質(zhì)表面易生菌類、 藻 類及苔蘚 , 也容易招來蠅類等昆蟲 , 危害植株。澆水 過少 , 則會影響植株的正常生長發(fā)育 , 嚴重時造成植 株干枯或死亡。培養(yǎng)室的相對濕度值不低于 70%才能保證幼苗的正常生長發(fā)育。根據(jù)我們的經(jīng)驗 , 擬南芥在培養(yǎng)室中生長一段時間后可形成自己的小 氣候 , 那時對空氣相對濕度的要求可相對降低 , 但是 也應(yīng)不低于 50%。2. 5營養(yǎng)植物生長需要充足的養(yǎng)分 , 擬南芥也不例外 , 任 何一種必需的營養(yǎng)物質(zhì)的缺少或缺失都會影響其正 常生長。 MS 培養(yǎng)基包含的營養(yǎng)物質(zhì)較為合理 , 適 合于擬南芥幼苗的生長 , 但在直接播種或移栽后擬 南

17、芥生長的介質(zhì)沒有不變的成分組成 , 培養(yǎng)基質(zhì)要 求含有豐富的營養(yǎng) , 更為重要的是要具有較好的松 散性和通氣性。國內(nèi)一些實驗室利用自己現(xiàn)有的條 件進行摸索種植 , 容易忽視營養(yǎng)物質(zhì)的比例 , 從而影 響擬南芥植株的生長。素沙及蛭石均不能提供充足 的營養(yǎng)物質(zhì) , 只起到固定和保持水分的作用 ; 有機土 營養(yǎng)豐富 , 但是通氣性不好。所以現(xiàn)在室內(nèi)培養(yǎng)介 質(zhì)多為兩者按一定比例混合的物質(zhì) , 它已經(jīng)被廣泛 使用而成為擬南芥幼苗生長的主要能源。另外 , 在 擬南芥的開花及結(jié)果期對養(yǎng)分的需求加大 , 可適當(dāng) 追加營養(yǎng)液以補充營養(yǎng)。 2. 6病蟲害室內(nèi)擬南芥常見的病蟲害很多 , 包括菌類如菌 核病菌和白粉病

18、菌以及害蟲如蠅、 蚜蟲、 小菜蛾、 菜 青蟲等。預(yù)防病蟲害要以防為主 , 防治結(jié)合。防治 菌害的方法有 :用 70%酒精涂擦室內(nèi)培養(yǎng)架等 , 用 10%漂白粉溶液擦洗地面 ; 也可在種植擬南芥之前 用 45%百菌清煙劑薰治 ; 用西安克勝新依達農(nóng)藥有 限公司生產(chǎn)的 /傾止 0(稀釋 40006000倍 噴霧 , 嚴重時噴 23次 , 效果甚好。蚜蟲發(fā)生時可用上海 宏邦化工有限公 司生產(chǎn)的 /大救星 0(20g 兌水 30 L 噴霧 , 也可用北京中農(nóng)大生物技術(shù)股份有限公司 生產(chǎn)的蚜力克 (25%乳油 , 2000倍 稀釋 。另外平 時可用北京林茂商貿(mào)有限責(zé)任公司生產(chǎn)的環(huán)保捕蟲 板誘蚜捕殺。 防

19、治小菜蛾和菜青蟲可用濟南綠霸化 學(xué)品有限責(zé)任公 司生產(chǎn)的 /毒死蜱 0(稀釋 1500 2000倍 、 海南正業(yè)農(nóng)業(yè)化工有限公司生產(chǎn)的 /吊死 它 0(30004000倍稀釋 或湖北康欣農(nóng)用藥業(yè)有 限公司生產(chǎn)的 /生綠 Bt 可濕性粉劑 0(10001500倍稀釋 混合使用。將溫室升溫至 55e , 24h 處理 后 , 也可較為徹底地殺滅害蟲。在此過程中 , 要注意 控制處理的時間和藥物的濃度 , 以防對幼苗產(chǎn)生傷 害。2. 7種植密度種植密度也可以影響擬南芥的正常生長 , 不論 是哪種培養(yǎng)方法 , 密度過大 , 擬南芥生長空間就會受 到限制 , 每棵植株所獲得的營養(yǎng)成分不均或不足 , 會

20、造成植株細弱 , 蓮座小。根據(jù)經(jīng)驗 , 每個培養(yǎng)皿 (直 徑為 9cm 播種不多于 150棵 , 每個 0105m 0. 05 m 培養(yǎng)穴種植 46棵。2. 8其他問題盡管擬南芥室內(nèi)培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)取得很大進步 , 但還存在一些問題 , 如生長周期不均一、 培養(yǎng)物質(zhì)營 養(yǎng)不均衡、 存在交叉污染現(xiàn)象等 , 這些都影響其培養(yǎng) 效果。生長周期不均一是個綜合性的問題 , 主要是培 養(yǎng)條件的差異造成的。要根據(jù)實際情況進行適當(dāng)調(diào) 整 , 擬南芥培養(yǎng)室的溫度、 光照、 濕度等條件不應(yīng)隨 季節(jié)、 晝夜等環(huán)境條件的變化而有較大的波動。培 養(yǎng)物質(zhì)是擬南芥生長最直接、 最根本的影響因素 , 要 盡量選取同一產(chǎn)品 , 并

21、盡量多地從一個廠家購買同 一批次的培養(yǎng)介質(zhì) , 因為每個廠家、 每個批次生產(chǎn)的 培養(yǎng)介質(zhì)成分可能不一致 , 如果更換了培養(yǎng)介質(zhì) , 就 需要種植一至 兩代才能摸索出培養(yǎng)介 質(zhì)的混合比 例 , 所以擬南芥培養(yǎng)過程中不宜經(jīng)常更換培養(yǎng)介質(zhì)。 擬南芥花期的交叉?zhèn)鞣垡彩且粋€常見的問題 , 因擬 # 47 #南芥是自花授粉植物 , 在花期將不同基因型的植株 分開 , 人工隔離就可防止交叉?zhèn)鞣?。還要特別注意 種子混雜現(xiàn)象的出現(xiàn) , 一是要做好記錄 ; 二是注意培 養(yǎng)架上幼苗的擺放位置 , 將大苗放在下層 , 小苗放在 上層 , 避免成熟的種子散落到其它盆中 ; 三是可以將 小苗用塑料透明罩罩住 , 防止造成

22、污染。3擬南芥種子的收獲及保存擬南芥種子的收獲可根據(jù)實際的要求 , 有的需 要單株采收 , 有的需要整盆大量采收。有的是種子 邊成熟邊采收 , 有 的是等種子全部 成熟后再采收。 收種子是一個細心的工作 , 因為種子太小 , 稍一疏忽 容易混種 , 造成污染。收種子時 , 一是動作要輕柔 , 二是不同株系的種子一定要分開。我們可以對單收 的植株進行特別處理 , 當(dāng)擬南芥結(jié)種后用透明的塑 料薄片卷成桶狀將擬南芥每一株單獨分開。國外有 專門收種子的裝置 , 但在國內(nèi)還沒有生產(chǎn)廠家。根 據(jù)我們多年的實踐經(jīng)驗 , 可以將種子直接收集在 A4打印紙上 , 前提是種莢要較為干燥。將整株擬南芥 用剪刀剪下 , 用剪刀和鑷子把所有種莢移到紙上 , 然 后用手指輕搓種莢 , 動作要輕緩 , 待種子完全收集后 將空種莢及枝葉拿走 , 最后將種子倒入 1. 5ml 離心 管中 , 根據(jù)種子的多少放入幾粒干燥劑 , 作好標(biāo)記保 存。如果短期保存 , 可以放在通風(fēng)干燥的地方 ; 若長 期保存可放到 -20e 冰箱里 , 兩年之內(nèi)可保證發(fā)芽 率。4小結(jié)擬南芥屬于難培養(yǎng)的植物 , 許多因素影響了擬 南芥的室內(nèi)培養(yǎng) , 對擬南芥室內(nèi)培養(yǎng)制約因素的研 究具有重要意義。 20世紀 70年代 以來 , 人們