核醫(yī)學第4章放射性核素標記化合物

1、1第四章第四章 放射性核素標記化合物放射性核素標記化合物 Radionuclide Labeled CompoundsRadionuclide Labeled Compounds核醫(yī)學教研室核醫(yī)學教研室2014-2-282示蹤技術(shù) 觀察野生動物大熊貓的生活習性觀察野生動物大熊貓的生活習性無線電發(fā)射器無線電發(fā)射器 示蹤物示蹤物 放射性核素放射性核素酶酶熒光素熒光素 319231923年年, G.Hevesy, G.Hevesy首次通過測定放射性鉛的射線來首次通過測定放射性鉛的射線來觀察其在動、植物體內(nèi)的分布；觀察其在動、植物體內(nèi)的分布；19521952年年 Hershey Hershey 323

2、2P P、3535S S DNADNA是遺傳物質(zhì)；是遺傳物質(zhì)；19591959年年 BersonBerson、Yalow RIAYalow RIA；19581958年年 MeselsonMeselson、Stahl DNAStahl DNA半保留復制；半保留復制；1977 1977 年，年，F(xiàn)rederick Sanger Frederick Sanger 等采用放射性標記技術(shù)等采用放射性標記技術(shù)和和ARGARG，成功地進行了，成功地進行了DNA DNA 序列測定序列測定。示蹤實驗之父示蹤實驗之父3232P P、131131I I、1414C C、3 3H H先后被用于醫(yī)學實驗研究先后被用于醫(yī)

3、學實驗研究RNA-DNARNA-DNA逆轉(zhuǎn)錄、遺傳的三聯(lián)密碼、細胞周期、微量物逆轉(zhuǎn)錄、遺傳的三聯(lián)密碼、細胞周期、微量物質(zhì)測量等均離不開示蹤技術(shù)。質(zhì)測量等均離不開示蹤技術(shù)。4如何用噬菌體感染實驗如何用噬菌體感染實驗證明證明DNA DNA 是遺傳信息的載體是遺傳信息的載體Introduction5如何用噬菌體感染實驗證明如何用噬菌體感染實驗證明DNA DNA 是遺傳信息的載體是遺傳信息的載體6如何用噬菌體感染實驗證明如何用噬菌體感染實驗證明DNA DNA 是遺傳信息的載體是遺傳信息的載體35S32P35S32P子代子代分離蛋白質(zhì)外分離蛋白質(zhì)外殼及殼及DNADNA內(nèi)核，內(nèi)核，并測量放射性并測量放射性

4、蛋白質(zhì)外殼無蛋白質(zhì)外殼無放射性，放射性，DNADNA上有放射性！上有放射性！DNADNA是遺傳物質(zhì)！是遺傳物質(zhì)！7為什么要用放射性核素作為示蹤劑？為什么要用放射性核素作為示蹤劑？ 一般一般非放射性物質(zhì)非放射性物質(zhì)進入機體后無法區(qū)別哪些是外來的？哪進入機體后無法區(qū)別哪些是外來的？哪些是原有的物質(zhì)？些是原有的物質(zhì)？ 有些物質(zhì)進入機體后發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化、分解，無法再找到它有些物質(zhì)進入機體后發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化、分解，無法再找到它的蹤跡。的蹤跡。 Tracer8核醫(yī)學應用核醫(yī)學應用 9PET and SPECT: Advanced Imaging SystemsPositron Emission Tomograp

5、hySingle-Photon Emission Computed TomographyA PET scan can be an effective tool to diagnose Parkinsons diseaseRadiopharmaceutical Radiotherapy Principle11放射性核素標記化合物：放射性核素標記化合物：它是指在化合物分它是指在化合物分子中引入可起示蹤作用的放射性核素，并保持原有化合物的子中引入可起示蹤作用的放射性核素，并保持原有化合物的理化和生物學性質(zhì)不變的一類化合物。理化和生物學性質(zhì)不變的一類化合物。 本章內(nèi)容13第一節(jié)第一節(jié) 基本概念基本概念

6、14一、幾個重要參數(shù)一、幾個重要參數(shù)1. 1.放射性濃度：放射性濃度：它是指單位體積的溶液中含有的放射它是指單位體積的溶液中含有的放射 性活度。以性活度。以Bq/LBq/L或或Bq/mlBq/ml等表示。等表示。2. 2.放射化學純度：放射化學純度：指所指定的放射性標記化合物的放指所指定的放射性標記化合物的放 射性活度占該樣品的總放射性活度的百分比。射性活度占該樣品的總放射性活度的百分比。要求要求 放化純度要達到放化純度要達到95%95%以上以上 放化純度放化純度(%)=(%)=(標記物的放射性活度標記物的放射性活度)/ )/(樣品總的放射性活度樣品總的放射性活度) ) 100%100%n放射

7、性示蹤實驗是以測量放射性的蹤跡來顯示該物質(zhì)的行蹤的，放射性示蹤實驗是以測量放射性的蹤跡來顯示該物質(zhì)的行蹤的，如果示蹤劑中含有放射數(shù)雜質(zhì)，就會使實驗結(jié)果紊亂，甚至失如果示蹤劑中含有放射數(shù)雜質(zhì)，就會使實驗結(jié)果紊亂，甚至失敗。敗。n放射性雜質(zhì)不僅可以從原料及制備過程中引入，而且也會隨著放射性雜質(zhì)不僅可以從原料及制備過程中引入，而且也會隨著標記物貯存時間的延長而逐漸產(chǎn)生。因此不僅制備標記化合物標記物貯存時間的延長而逐漸產(chǎn)生。因此不僅制備標記化合物時得要進行純化分離，而且在貯存過程中仍要密切監(jiān)測它的放時得要進行純化分離，而且在貯存過程中仍要密切監(jiān)測它的放射化學純度，特別是高比活度的氚標記化合物。射化學純

8、度，特別是高比活度的氚標記化合物。 3. 3. 放射性比活度放射性比活度 對比活度的要求因使用目的而異對比活度的要求因使用目的而異：一般用于競爭結(jié)合分析法測定微量物質(zhì)時要求比活度高，以提高分析方法的靈敏度。作為示蹤劑用于觀察某些物質(zhì)的體內(nèi)過程時，則要求盡量接近生理狀態(tài)下的用量而同時具有可測量的放射性活度。 過高或過低均不好：過高或過低均不好： 放射線比活度越高，示蹤的靈敏度也越高，但制備和使用高比活度標記物，有如下因素的限制：一是受原料比活度和制備方法的限制；二是比活度愈高，制備操作難度愈大；三是比活度高時，特別是氚標記物，易引起輻射自分解，還會對被示蹤的機體產(chǎn)生毒性(如研究對象的細胞損傷和蛋

9、白變性) ，影響實驗結(jié)果。 過低的比活度因其靈敏度過低而達不到預期的實驗目的。15單位質(zhì)量（摩爾、容積）物質(zhì)所含放射性的多少，單位質(zhì)量（摩爾、容積）物質(zhì)所含放射性的多少，后者常稱為放射性濃度。后者常稱為放射性濃度。 單位：單位：MBq/mg、GBq/mg、TBq/g或或MBq/mmol、GBq/mmol、MBq/ml。 3. 3. 放射性比活度放射性比活度 放射線核素的理論比活度:當該種核素的豐度是100%時其放射性活度。它的大小只取決于核素的半衰期。 A理論=N阿伏加德羅常數(shù)=0.693/T1/26.021023 標記化合物的放射性比活度: 該化合物上的放射線核素活度(Bq) 化合物質(zhì)量(g

10、)或摩爾數(shù)(mol)16A=174. 4.化學純度化學純度: :指某一化學形式存在的物質(zhì)量在該樣品的總重量中所占的百分比。5. 5.放射性核素純度：放射性核素純度：是指特定的放射性核素的放射性活度占總放射性活度的百分數(shù)，表示為：放射性核素純度(%) = (特定的放射性核素的活度)/(樣品的總放射性活度)100% 一般要求放射性核素純度要達到一般要求放射性核素純度要達到99%99%以上。以上。186. 6. 標記位置及命名標記位置及命名: :標記化合物命名，通常先指出標記部位再指出標記核素，最后列出化合物名稱，三部分中以二短橫線相聯(lián)，如：1-14C-醋酸。19二、同位素標記與非同位素標記二、同位

11、素標記與非同位素標記同位素標記：同位素標記：指化合物中的某一穩(wěn)定核素被其放射性同位素置換的方法。如用3H取代化合物分子中的1H。非同位素標記：非同位素標記：采用并非原化合物所含元素的放射性核素(一般選用性質(zhì)比較接近的放射性核素)進行標記的方法。如蛋白質(zhì)用131I或125I標記，所得標記物與原來化合物不完全相同。2021三、定位標記與非定位標記三、定位標記與非定位標記定位標記：定位標記：指標記原子標記在化合物的指定位置上，以符號“S”表示。例如1(S)-14C-醋酸、2(S)-14C-醋酸，前者表示14C標記在醋酸羧基碳上，即CH3-14COOH，后者則標記在甲基碳上，即14CH3-COOH，兩

12、者所能示蹤的基團不同，制備二者的合成路線也完全不同。22三、定位標記與非定位標記三、定位標記與非定位標記非定位標記：非定位標記：標記原子的結(jié)合部位無法確定。分為均勻標記分為均勻標記和全標記和全標記。均勻標記：均勻標記：指放射性原子均勻地分布于分子中，以“U”表示。如用14CO2通過植物光合作用制得的14C-葡萄糖其中分子六個碳原子從統(tǒng)計學上看被均勻標記上14C，故可寫成14C-葡萄糖(U)或u-14C-葡萄糖。全標記：全標記：是指放射性核素的原子隨機地無嚴格定位地分布于被標記化合物分子結(jié)構(gòu)上，以“G”表示。如G-3H-膽固醇，標記分子中的所有氫原子都可被取代，但機率各不相同。非定位標記化合物不

13、能用于觀察分子上特定基團或原子的去向，而只是代表整個非定位標記化合物不能用于觀察分子上特定基團或原子的去向，而只是代表整個分子的代謝、分布等狀況。非定位標記可以得到較高的比活度因為在一個分子分子的代謝、分布等狀況。非定位標記可以得到較高的比活度因為在一個分子中，可能存在幾個標記原子，且制備方法的選用面也較寬中，可能存在幾個標記原子，且制備方法的選用面也較寬準定位標記2324四、雙標記與多標記四、雙標記與多標記雙標記：雙標記：在化合物分子的不同部位，引入兩種不同的放射性核素原子(如3H和14C)或引入一種元素的兩種同位素原子。雙標使得人們可以在同一機體或離體組織中同時觀察兩個指標。它們在示蹤應用

14、時，可在同一機體或離體組織中同時觀察兩個指標，不僅減少工作量，還可排除和減少由于個體差異所引起的實驗誤差在研究化合物的不同代謝物在代謝中的相互關(guān)系、動力學過程以及生物反應機制等問題中，雙(多）標記示蹤劑能解決一般示蹤實驗不易解決的問題。 放射性核素標記化合物，除了與相應的非標記化合物具有同樣的化學、生物學特性外，更由于分子中引入了放射性原子，增加了不穩(wěn)定因素：1）放射性衰變引起的不穩(wěn)定性；2）由放射線引起的輻射自分解；3）由于標記位置不牢固或外界因素的影響，引起放射性原子脫落或定位標記物中放射性原子發(fā)生位移等造成不穩(wěn)定性。 一般來說，放射性原子應標記在分子中牢固的、不易脫落的位置，對于14C、

15、35S13N、32P等放射性核素，標記物位置都比較穩(wěn)固，而3H在分子中往往不穩(wěn)定，即使與碳原子相連的氚，由于鄰近基團等影響，與水的交換率可以很明顯，如苯環(huán)上與羧基處于鄰位或?qū)ξ坏碾霸蛹疤蓟忌系碾霸佣疾环€(wěn)定。五、標記化合物的不穩(wěn)定性五、標記化合物的不穩(wěn)定性26第二節(jié)第二節(jié) 放射性核素標記化合物的制備放射性核素標記化合物的制備27一、放射性核素的選擇一、放射性核素的選擇不改變原有化合物的理化和生物學性質(zhì)；不改變原有化合物的理化和生物學性質(zhì)；結(jié)合牢固、穩(wěn)定性好；結(jié)合牢固、穩(wěn)定性好；有合適的半衰期；有合適的半衰期；射線容易測量；射線容易測量；其它：是否容易標記、價格是否可以接受、射線是否其它：是

16、否容易標記、價格是否可以接受、射線是否容易防護。容易防護。28二、放射性核素的來源二、放射性核素的來源在發(fā)現(xiàn)人工核反應前，放射性核素都是從天然放射性鈾釷礦物中在發(fā)現(xiàn)人工核反應前，放射性核素都是從天然放射性鈾釷礦物中分離提取，由于品種不多，且特性不適于醫(yī)用，故應用有限。自分離提取，由于品種不多，且特性不適于醫(yī)用，故應用有限。自從發(fā)現(xiàn)人工核反應及加速器和反應堆問世以后，人們才有可能生從發(fā)現(xiàn)人工核反應及加速器和反應堆問世以后，人們才有可能生產(chǎn)許多品種的放射性核素。產(chǎn)許多品種的放射性核素。目前，醫(yī)用放射性核素主要通過人工核反應，從目前，醫(yī)用放射性核素主要通過人工核反應，從反應堆和加速反應堆和加速器器中

17、生產(chǎn)。據(jù)統(tǒng)計，全世界所生產(chǎn)的放射性核素中，約有中生產(chǎn)。據(jù)統(tǒng)計，全世界所生產(chǎn)的放射性核素中，約有8080一一9090用于醫(yī)學用于醫(yī)學。不論用反應堆還是加速器所生產(chǎn)的放射性核素，都必須經(jīng)過必要不論用反應堆還是加速器所生產(chǎn)的放射性核素，都必須經(jīng)過必要的分離、純化等放射化學處理，經(jīng)鑒定放射核純度合格，并測定的分離、純化等放射化學處理，經(jīng)鑒定放射核純度合格，并測定比活度后，才能供使用。比活度后，才能供使用。29二、放射性核素的來源二、放射性核素的來源(一一)反應堆生產(chǎn)放射性核素反應堆生產(chǎn)放射性核素1.利用中子引起的核反應：用中子轟擊穩(wěn)定性核素是獲取人工放射性核素的來源之一。能量較低的中子，核反應后，俘獲

18、中子而放出光子，如(n、)反應；能量較高的中子，核反應后，釋放帶電粒子如質(zhì)子或粒子等。 23Na+10n(低)24Na+ 或 23Na(n.) 24Na 6Li+10n(高)3H+4He 或 6Li(n、) 3H2.核裂變產(chǎn)物燃料廢料中分離提?。汉朔磻阎兴煤巳剂?35U或239po，在其裂變過程中可產(chǎn)生許多放射性核素，供醫(yī)用的有：99Mo、131I、132I、133Xe和137Cs等。30二、放射性核素的來源二、放射性核素的來源(二二)加速器生產(chǎn)加速器生產(chǎn) 利用加速器將質(zhì)子或氘核等粒子加速后，用其轟擊穩(wěn)定性核素而得到放射性核素。這類放射性核素的衰變方式多為正電子發(fā)射或電子俘獲。生產(chǎn)醫(yī)用放射

19、性核素的加速器主要是回旋加速器。生產(chǎn)的11C、15O和13N等放射性核素的T1/2相當短，用處極大。31三、制備放射性標記化合物要考慮的因素三、制備放射性標記化合物要考慮的因素放射性核素的獲取及其價格放射性核素的獲取及其價格：起始原料通常是由反應堆生起始原料通常是由反應堆生產(chǎn)的無機物產(chǎn)的無機物標記物的穩(wěn)定性標記物的穩(wěn)定性：做示蹤劑的化合物穩(wěn)定；標記原子所在的做示蹤劑的化合物穩(wěn)定；標記原子所在的位置也要牢固位置也要牢固微量操作技術(shù)微量操作技術(shù)：一般在毫克或微克級水平一般在毫克或微克級水平進行冷試驗進行冷試驗：即用非放射線原料代替放射性原料的模擬實驗即用非放射線原料代替放射性原料的模擬實驗 由人工

20、核反應所制得的放射性核素，一般均為簡單比合物，如3H2、Ba14C03、Na125I等。為了得到合適的分析試劑或示綜劑，還需進一步以簡單放射性化合物為原料，制備所需的放射性標記化合物。 制備標記化合物的基本方法有同位素交換法、化學合成法、生物合成法及絡合物/螯合物生成法等方法。32四、放射性標記化合物制備的基本方法四、放射性標記化合物制備的基本方法33四、放射性標記化合物制備的基本方法四、放射性標記化合物制備的基本方法1 1、同位素交換法、同位素交換法放射性核素與要標記的化合物中同一元素的穩(wěn)定同位素相互交放射性核素與要標記的化合物中同一元素的穩(wěn)定同位素相互交換來制備放射性標記化合物的方法。換來

21、制備放射性標記化合物的方法。優(yōu)點：方法簡便，易于操作。適宜于稀有、結(jié)構(gòu)復雜的有機化優(yōu)點：方法簡便，易于操作。適宜于稀有、結(jié)構(gòu)復雜的有機化合物的標記。合物的標記。缺點：無進行定位標記，且有機化合物主鏈上的原子無法標記，缺點：無進行定位標記，且有機化合物主鏈上的原子無法標記，標記物的比放射性低標記物的比放射性低。34四、放射性標記化合物制備的基本方法四、放射性標記化合物制備的基本方法1 1、同位素交換法、同位素交換法放射性核素與要標記的化合物中同一元素的穩(wěn)定同位素相互交換來制備放射性標記化合物的方法。如：制備G-3H-河魚屯毒素可逆反應，反應速度的快慢與反應條件有關(guān)，常以交換半值期作為選擇最適反應

22、條件的指標。一般反應3-5個半值期即可。交換半值期的物理意義：產(chǎn)物的濃度等于交換反應達到平衡時產(chǎn)物濃度的1/2所需時間。影響交換反應速率的因素：溫度、酸度、壓力，所用溶劑性質(zhì)，反應的濃度及選用合適的催化劑等。 同位素交換法的優(yōu)缺點同位素交換法的優(yōu)缺點優(yōu)點：方法簡便，易于操作：不需制備前體，無復雜的合成步驟，待標記的化合物用量少(一般為mg級)，更適用淤標記稀有昂貴的復雜有機化合物，如反應條件選擇適當，也可獲得較高放射性活度與比活度，放射性核素利用率也可以很高。缺點：a.化合物的中心原子（如有機化合物主鏈上的原子）不易用交換法標記，所以用交換法制備標記化合物，最常用的放射性核素是氚和放射性碘，而

23、14C標記化合物由于反應條件要求高，就不易用此法制備。b.如果在通常條件下，即不加溫、不用特別的pH或不用催化劑等，就能交換的系統(tǒng)，亦不能用于制備標記化合物，因為這樣的標記物，在一般生理條件下，標記原子亦易交換下來c.如一個分子中有幾個位置可以交換時，則標記位置不易有專一性同樣， d.原料如含有雜質(zhì)，且也含可交換位置，就會形成放射性雜質(zhì)，故應特別注意同位素交換反應中待標記物的純度 36四、放射性標記化合物制備的基本方法四、放射性標記化合物制備的基本方法2 2、化學合成法、化學合成法通過各種化學反應，將放射性核素引入到待標記化合物特定位通過各種化學反應，將放射性核素引入到待標記化合物特定位置上的

24、標記方法。置上的標記方法。優(yōu)點：可以選擇標記的核素、標記的位置（優(yōu)點：可以選擇標記的核素、標記的位置（定位標記定位標記）、比放）、比放射性可以嚴格控制（射性可以嚴格控制（比活度高比活度高），分離提純?nèi)菀祝ǎ?，分離提純?nèi)菀祝兌雀呒兌雀撸?。）。缺點：步驟多、流程長、費時費力。缺點：步驟多、流程長、費時費力。 化學合成法化學合成法化學合成制備標記化合物最主要的方法，此法基于化學合成反應的原理，利用簡單的放射性化合物作原料來制備所需的標記化合物原則上凡能用化學合成法合成的化合物，均可用化學合成法制備標記化合物，其機理和方法與一般化合物合成沒有本質(zhì)區(qū)別。然而，畢竟制備的是放射性核素標記物，且在標記位置

25、、活度、放化純度等方面有特殊要求，因而與普通化學合成又有許多不同處：首先，在選用原料方面，制備標記化合物的起始原料大多只能用簡單的無機物 ；其次，在選擇合成路線時，要根據(jù)所需要的標記位置專門設計，力求使標記原子在分子中較穩(wěn)定的位置或特定的位置上，并需考慮如何使放射性得率最高 ；另外，制備高比活度的標記化合物，需采用微量合成及分離純化技術(shù)，一般需設計專門的微量合成裝置，盡量采用低溫、真空技術(shù)和避免高溫、高壓等劇烈反應，以減少放射性沾污 。 化學合成法化學合成法 化學合成法一般都應用非標記物進行充分的預試驗(常稱冷試驗)，以選定最合適的制備路線及反應條件。本法能獲得高比活度、高純度而又是定位標記的

26、標記化合物，這是其他制備方法所不能同時達到的，因此它是制備標記化合物的最主要方法 。39四、放射性標記化合物制備的基本方法四、放射性標記化合物制備的基本方法3 3、生物合成法、生物合成法是利用生物(動植物或微生物)的生理代謝或酶的生物活性，將簡單的放射性物質(zhì)在體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)化成所需的放射性標記物。如 1414COCO2 2加入藻類細胞中加入藻類細胞中產(chǎn)生的蛋白，含有產(chǎn)生的蛋白，含有1616種標記的氨基酸種標記的氨基酸。生物合成法又可分為“全生物合成”和“酶促合成”二類。前者常使用完整生物或某一器官的生理代謝進行生物合成標記，后者則利用生物組織中某種特定的酶，促進合成反應。以上二者，都是對某些放射

27、性標記物，特別是一些構(gòu)造復雜、化學合成難以制備或目前尚不可能制備的有機化合物進行標記的有用手段403 3、生物合成法、生物合成法優(yōu)點：可完全保留標記物原有的生物活性和旋光性可完全保留標記物原有的生物活性和旋光性，特別適合作生物示蹤應用，可制備一些構(gòu)造復雜、化學合成難以完成或目前尚不可能制備的有機物，如某些蛋白質(zhì)、多糖、核酸、激素、生物堿及苷類等。缺點：1）生成物復雜，后續(xù)分離純化步驟比較繁雜后續(xù)分離純化步驟比較繁雜，放射性原料的利用率往往較低；2）除非所用原料的結(jié)構(gòu)已接近生成物，否則很難標記很難標記在某一特定位置上在某一特定位置上；3）標記率比較低酶促合成是近年來很受注意的一種標記技術(shù)，對制備

28、一些生物活性物質(zhì)的定位標記物有一定發(fā)展前途，產(chǎn)品比活度也可較高，前提是必須有特異性高的酶制劑和高比活度的底物。 41四、放射性標記化合物制備的基本方法四、放射性標記化合物制備的基本方法4 4、絡合物、絡合物/ /螯合物生成法螯合物生成法將放射性金屬離子與特定的化合物進行絡合和螯合反應，標記將放射性金屬離子與特定的化合物進行絡合和螯合反應，標記到化合物分子上的方法。到化合物分子上的方法。優(yōu)點：快速、定量、操作簡易。臨床上最常用的方法。優(yōu)點：快速、定量、操作簡易。臨床上最常用的方法。缺點：對標記化合物的活性影響較大。缺點：對標記化合物的活性影響較大。 42第三節(jié)第三節(jié) 幾種常用放射性標記化合物的制

29、備幾種常用放射性標記化合物的制備常用放射性標記化合物的制備常用放射性標記化合物的制備14C標記化合物的制備氚標記化合物的制備放射性碘標記物的制備32P、33P和35S標記化合物的制備核酸和反義核苷酸的標記 44同位素交換法、化學合成法、生物合成法同位素交換法、化學合成法、生物合成法(2) 制備：制備：核素核素半衰期半衰期射線射線生產(chǎn)核反應生產(chǎn)核反應天然豐度天然豐度1010C19.51 秒秒+ +1010B(p,n)1010C1111C20.34 分分+ +1111B(p,n)1111C1212C98.89%1313C1.108%1414C5730 年年- -1414N(n,p)1414C151

30、5C2.40 秒秒- -1414C(d,p)1515C(1) 核素特點：核素特點：一、一、14C 標記化合物的制備標記化合物的制備C處于化合物結(jié)構(gòu)的骨架地位1414C C標記化合物的化學合成標記化合物的化學合成 常以Ba14CO3或14CO2為起始原料，由這些原料經(jīng)一步或兩步反應制備簡單的14C標記化合物，這些中間體經(jīng)常使用，有商品供應。45如以Ba14CO3為原料制備14C-丙氨酸：全生物合成最常采用的生物是細菌、綠藻、酵母等，這些低等生物代謝活潑，繁殖迅速，容易迅速低將簡單的放射線原料(例如14CO2)摻入到細胞內(nèi)。如利用蛋白質(zhì)含量較高的小球藻在14CO2的環(huán)境中進行光合作用，使14CO2

31、摻入到細胞內(nèi)，生成含有14C的蛋白質(zhì)、核酸及多糖461414C C標記化合物的生物合成標記化合物的生物合成2. 酶促合成利用某些特定的酶通過一步或幾步反應，將標記前身物轉(zhuǎn)化為所需要的標記產(chǎn)物。例如：47關(guān)鍵：有相應的前體和合適的酶1414C C標記化合物的生物合成標記化合物的生物合成優(yōu)點：優(yōu)點：來源豐富，可在反應堆大量生產(chǎn)；弱 - ,射程短(4.56mm),無需外輻射防護；放射自顯影分辨率高，可觀察亞細胞形態(tài)標記簡單，得率高、比活度高；T1/2長（12.33年）、易運輸、貯存和安排實驗。不足：不足：C-H 不如 C-C 牢固 ，易脫落；高比活度的氚標記物容易發(fā)生輻射自分解；1.同位素效應，注意

32、標記位置遠離反應部位。48二、氚二、氚(3H) 標記化合物的制備標記化合物的制備(1) (1) 核素特點：核素特點：49二、氚二、氚(3H) 標記化合物的制備標記化合物的制備(2) (2) 制備：制備：同位素交換法、化學合成法、生物合成法同位素交換法、化學合成法、生物合成法氚氣暴射交換溶液中的催化交換催化加氚法催化鹵素置換法氚化金屬還原法3H同位素交換法：直接將3H氣體引入待標記分子中進行同位素交換反應。503 3H H同位素交換法同位素交換法氚氣暴射交換溶液中的催化交換故不常用！故不常用?。汉唵?、方便。：易標記在不穩(wěn)定位置上、化學鍵易斷、反應時間較長、比活度低、純化困難。 化學合成法是目前制

33、備高比活度的氚定位標記的最成熟、最重要的方法。 需要：1）合適前體：常用烯烴、炔烴、有機鹵化物、腈及羧基化合物等；2）還原劑：氚氣以及氚化金屬，如NaBT4、LiBT4、KBT4、LiAlT4等。51化學合成法化學合成法催化加氚法催化鹵素置換法氚化金屬還原法52化學合成法化學合成法之之催化加氚法催化加氚法將含有不飽和鍵的前體（烯烴、炔烴、有機鹵化物、腈及羧基化合物）溶解后在催化劑作用下和氚氣反應數(shù)小時53化學合成法化學合成法之之催化鹵素置換法催化鹵素置換法在催化條件下，氚很容易與溴、碘原子發(fā)生置換反應（常加入少量有機胺類，中和反應產(chǎn)物鹵化氚，有利于反應進行）54化學合成法化學合成法之之催化鹵素

34、置換法催化鹵素置換法用氚化金屬還原劑，如NaBT4、LiBT4、KBT4、LiAlT4等，它們可以選擇性地將羧酸、酯、酮、醛和腈類化合物還原成相應的醇類或胺類而實現(xiàn)定位標記 主要根據(jù)“酶促反應”的原理，以氚的標記物為底物，利用專一性很強的酶作為催化劑，將該標記物轉(zhuǎn)化成所需的另一種標記物55生物合成法生物合成法能定位標記，而且保留生物活性能定位標記，而且保留生物活性56三、放射性碘標記化合物的制備三、放射性碘標記化合物的制備57125I T1/260d標記物儲存應用一段時間、商品化標記物儲存應用一段時間、商品化低能低能 射線射線 ，無，無 粒子粒子輻射分解少，標記物穩(wěn)定性好輻射分解少，標記物穩(wěn)定

35、性好三、放射性碘標記化合物的制備三、放射性碘標記化合物的制備58CONHCH2COOHICONHCH2COOH131I+Na131IKIOKIO3 3H+131I鄰碘馬尿酸鄰碘馬尿酸(一一)同位素交換法同位素交換法HOIHO131I Na131I150 1h131I6 膽固醇膽固醇59( (二二) ) 蛋白質(zhì)、多肽的碘標記技術(shù)蛋白質(zhì)、多肽的碘標記技術(shù)前提：前提：1 1）待標記物要有易被碘原子結(jié)合或取代的基團，對蛋白）待標記物要有易被碘原子結(jié)合或取代的基團，對蛋白質(zhì)和多肽而言，最主要是酪氨酸，它易被碘化的部位是質(zhì)和多肽而言，最主要是酪氨酸，它易被碘化的部位是苯環(huán)上羥基的兩個鄰位。組氨酸和色氨酸殘

36、基也有一定苯環(huán)上羥基的兩個鄰位。組氨酸和色氨酸殘基也有一定活性。（箭頭）活性。（箭頭）2 2）必須先把）必須先把125125I I- -氧化成氧化成125125I I2 260Na125IHOCH2CHCOOHCH2CHCOOHHO125I+125I2NH2NH2125I碘代酪氨酸碘代酪氨酸氧化劑氧化劑 Ch-T，H2O2標記原理：標記原理：( (二二) ) 蛋白質(zhì)、多肽的碘標記技術(shù)蛋白質(zhì)、多肽的碘標記技術(shù)61蛋白質(zhì)、多肽的碘標記常用方法蛋白質(zhì)、多肽的碘標記常用方法1、直接標記法 氯胺-T法 乳過氧化物酶法 固相氧化法2、間接標記法62631. 氯胺氯胺T 法法SO2NCH3NaCl+2Na1

37、25I+2H2OSO2NHCH3+125I2+NaCl2NaOH溫和氧化劑溫和氧化劑64反應液組成：反應液組成： Na125I 74MBqMBq（10L10L） 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 5gg（10L10L） 緩緩 沖液（沖液（pH7.4） 30LL 氯胺氯胺 T 100gg（10L10L） 室溫室溫13min 加加Na2S2O5 200gg（0.2mL)0.2mL)中止反應中止反應用用SephadexG50柱層析柱層析分離純化分離純化 125I-蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)6566氯胺-T是較強的氧化劑，對一些生物活性不穩(wěn)定的物質(zhì)，例如一些補體成分、某些激素、酶和受體都有一定的損傷672. 乳過氧化物酶法乳過氧化物酶

38、法乳過氧化物酶乳過氧化物酶 + H2O2 O2（新生氧）（新生氧）標記原理：標記原理：Na125I125I268反應液：反應液： Na125I 37MBq （10L10L） 緩緩 沖液（沖液（pH5.6） 30LL蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 5gg（10L10L）乳過氧化物酶乳過氧化物酶 25ngng（10L10L）H2O2 200ngng （10L10L）室溫室溫7min 巰基乙醇（巰基乙醇（10mmol/L10mmol/L）0.5mL(mL(中止反應中止反應) ) H2O2 200ngng （10L10L）室溫室溫7min H2O2 200ngng （10L10L）室溫室溫7min 加入加入NaI載體溶

39、液載體溶液, 用用SephadexG50柱層析柱層析分離純分離純化化 125I-蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)69注意事項：注意事項：1. 乳過氧化物酶使用前新鮮配制乳過氧化物酶使用前新鮮配制2. H2O2保持低濃度：保持低濃度： 0.1mmol/L3. 酶的濃度酶的濃度，標記率，標記率酶的用量酶的用量 95%)(95%)，在示蹤過程中要穩(wěn)定，在示蹤過程中要穩(wěn)定81標記率：標記率：指放射性核素被標記到待標記化合物上的量占指放射性核素被標記到待標記化合物上的量占放射性總的投入量的百分比。放射性總的投入量的百分比。標記率標記率(%)=(%)=標記物的放射性標記物的放射性/ /投入的總放射性投入的總放射性 100%1

40、00%測定方法：測定方法：最常用最常用紙層析紙層析或或薄層層析法薄層層析法，對于生物制劑，對于生物制劑有時也用柱層析或蛋白沉淀法。有時也用柱層析或蛋白沉淀法。二、標記率的測定二、標記率的測定1 1、紙層析法：、紙層析法：混合樣品中各組混合樣品中各組分的性質(zhì)不同，在固定相上的吸分的性質(zhì)不同，在固定相上的吸附能力和在流動相中的溶解度不附能力和在流動相中的溶解度不同，因此它們各自的移動速度不同，因此它們各自的移動速度不同，可在特殊紙片上分離開。同，可在特殊紙片上分離開。 常用比移值常用比移值RfRf表示各組分的移動表示各組分的移動速度快慢。速度快慢。意義：某標記物的意義：某標記物的RfRf值在相同條

41、件下穩(wěn)定不變。值在相同條件下穩(wěn)定不變。Rf = 待測組分到原點的距離待測組分到原點的距離I I 流動相前沿到原點距離流動相前沿到原點距離L L83標記率測定之分段測量法84標記率測定之放射線掃描法 層析紙長度，一般20cm左右，越長分離越好； 展開劑要精心設計，選2-3種進行驗證。要求：能把混合物很好的分開，用時還要組成簡單，粘度小，展開快，展開后易揮發(fā)，價格低，易購買。 點樣斑大小適當。 點樣斑不能碰到展開劑的液體。1. 層析缸要有蓋，減少干擾。86分段測量，段的大小要一致；起跑點所在段也要測量；高比活度樣品點要加載體，減少吸附；避免反復點樣，層析紙要自然晾干；最好能用標準樣品做對照；各段劑

42、量值必須減本底。2 2、薄層層析法：、薄層層析法： 硅膠或氧化鋁（固定相）：根據(jù)混合物各組分的吸附力和分配系數(shù)不同而分開。 離子交換樹脂（固定相）：根據(jù)各組分離子電荷的性質(zhì)和數(shù)量不同而分開。 聚酰胺：以各組分氫鍵吸附能力不同而分開。88常用方法：常用方法：1. 1. 層析法層析法（1 1）紙層析）紙層析（2 2）薄板層析）薄板層析（3 3）柱層析（如凝膠過濾層析、離子交換層析和親和層析）柱層析（如凝膠過濾層析、離子交換層析和親和層析）2. 2. 透析法透析法3. 3. 電泳法電泳法三、標記物的分離純化三、標記物的分離純化1. 層析法（1 1，2 2） 紙層析法和薄板層析法：紙層析法和薄板層析法

43、： 原理和操作與標記率的測定類似，最后，根據(jù)標準品所顯示的位置，將純化產(chǎn)品剪下（紙）或刮出（板），用適當?shù)娜軇ㄋ蛞掖嫉龋?，將標記物浸泡提取出來，并進行鑒定。 特點：簡便、快速，但僅能適用于少量體積的樣品的純化。89（3 3） 柱層析法：柱層析法： 原理：將固定相裝在一定體積的玻璃柱（或金屬柱）中，層析柱經(jīng)處理之后，將樣品加到固定相之上，然后用洗脫液淋洗，樣品中的各種化合物，或者由于吸附、分配的差異，或者由于離子荷電的差異，或者由于分子量的差異等等，從層析柱上被淋洗出來的速度有所不同，各組分的洗出也有先后，從而達到分離的目的。90（3 3） 柱層析法：柱層析法：根據(jù)被純化物的性質(zhì)，采用不同內(nèi)

44、容的層析柱和選擇合適的淋洗條件：凝膠過濾層析法：本法是利用具有分子篩效應的多孔網(wǎng)狀凝膠來分離不同分子量的化合物。由于小分子物質(zhì)可進入凝膠粒子的網(wǎng)孔內(nèi)部，而較大分子物質(zhì)進不去，因此，在淋洗層析柱時，小分子物質(zhì)推進速度慢，而大分子物質(zhì)卻沿著凝膠粒子間的縫隙最先被洗脫出來，從而達到分離的目的。凝膠主要有三類：sephadex交聯(lián)葡聚糖多孔凝膠；sepharose或biogel-A瓊脂糖珠；a)biogel-P聚丙酰胺91離子交換層析法：依據(jù)的原理是物質(zhì)的酸堿性、極性，也就是所帶陰陽離子的不同。電荷不同的物質(zhì)，對管柱上的離子交換劑有不同的親和力，改變沖洗液的離子強度和pH值，物質(zhì)就能依次從層析柱中分離

45、出來。親和層析法：對于具有較強特異性結(jié)合作用的抗體和抗原，受體和配基等親和性的互補物，可將其中的一種結(jié)合在層析柱的固定相上，例如將某抗原固定在層析柱的介質(zhì)上，的那個含有相應抗體的樣品通過層析柱時，由于抗原-抗體的結(jié)合反應，抗體被滯留在柱上，經(jīng)洗滌將抗體中各種非特異性的雜質(zhì)洗掉，完后改變洗脫液的濃度或pH值，將抗體洗脫出來，這種利用親和層析載體固相化配基與親和互補物之間，通過范德華力、疏水力、靜電力、氫鍵作用等發(fā)生專一性結(jié)合而進行分離的技術(shù)稱之為親和層析法。922. 透析法根據(jù)標記物和放射性雜質(zhì)的分子量大小的不同，選根據(jù)標記物和放射性雜質(zhì)的分子量大小的不同，選擇孔徑合適的透析袋，將樣品置于透析袋

46、中，并將擇孔徑合適的透析袋，將樣品置于透析袋中，并將之懸浮在較大體積的緩沖液中，在攪拌條件下，每之懸浮在較大體積的緩沖液中，在攪拌條件下，每6h6h更換一次透析液，經(jīng)過更換一次透析液，經(jīng)過24h24h的透析作用，較小分的透析作用，較小分子的放射線雜質(zhì)基本上擴散到透析袋之外，而大分子的放射線雜質(zhì)基本上擴散到透析袋之外，而大分子的標記物則存留在透析袋之內(nèi)。子的標記物則存留在透析袋之內(nèi)。本法比較簡易，但較費時。本法比較簡易，但較費時。93941 1、放射化學純度鑒定：、放射化學純度鑒定：包括放射性紙層析法、放射性高效液相層析法、放射性凝膠電泳法等。2 2、放射性濃度測定：、放射性濃度測定：取1ml產(chǎn)

47、品，測其放射性活度，即為放射性濃度，單位為Bq/ml。3 3、放射性比活度測定：、放射性比活度測定：采用直接測定法。四、標記物的鑒定四、標記物的鑒定954. 4.生物活性及免疫活性測定：生物活性及免疫活性測定：標記物制備過程中的各種因素都可能導致生物活性、免疫活性的改變，因此，生物學活性、免疫活性測定是一個重要的質(zhì)量指標。5. 5.其他：其他：物理化學鑒定及化學純度鑒定。四、標記物的鑒定四、標記物的鑒定96第五節(jié)第五節(jié) 放射性標記化合物的輻射自分解放射性標記化合物的輻射自分解97輻射自分解輻射自分解(autoradiolysis)：由于標記化合物所含放由于標記化合物所含放射性核素電離輻射的作用，致使標記化合物本身或臨近的射性核素電離輻射的作用，致使標記化合物本身或臨近的分子的結(jié)構(gòu)被破壞，從而喪失原有特性的現(xiàn)象。會產(chǎn)生放分子的結(jié)構(gòu)被破壞，從而喪失原有特性的現(xiàn)象。會產(chǎn)生放射化學雜質(zhì)或化學雜質(zhì)。如射化學雜質(zhì)或化學雜質(zhì)。如3 3H-H-丙醇，由于輻射自分解，產(chǎn)丙醇，由于輻射自分解，產(chǎn)生甲烷，乙醛，丙醛，異丙醇及丙烯醇等。生甲烷，乙醛，丙醛，異丙醇及丙烯醇等。981.初級內(nèi)分解：初級內(nèi)分解：指標記核素本身的衰變，引起帶有該核素的指標記核素本身的衰變，引起帶有該核素的標記物分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，如標記物分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，如:14C標記的化合物，當標記的化合物