相位層析顯微鏡

1、相位層析顯微鏡摘要：本文介紹了在多個角度使用相移激光干涉顯微術得到定量的活細胞或組織折射率的三維分布的技術。我們展示細胞和多細胞組織的層析成像，和基于時間變化的細胞的結構。我們的結果可以定量分析樣品帶來的在高分辨率顯微鏡下的像差，而且，在組織散射中也有很多的應用。關鍵詞：激光干涉顯微術；折射率；三維分布。引言高分辨率光學顯微鏡不僅受到光的衍射性質(zhì)的局限，并且由于樣品的光學不均勻性，其分辨率也受很大的影響。如果能夠精確的測量由折射率變化造成的像差，自適應光學1和反褶積技術2可以很好的用來糾正樣品所引起的像差。但是，所有的修正手段或技術都需要樣品折射率的三維定量分布場。折射率展示了其在分析細胞結構

2、的一個獨特視角，在分析細胞或組織的光散射效應，單分子光鑷，流式細胞儀，全內(nèi)反射顯微鏡，光與細胞或組織相互作用等的各個研究領域中，樣品的折射率分布均有重要的應用。傳統(tǒng)的細胞折射率測量技術只能得到單細胞的平均折射率，而且忽略了亞細胞結構帶來的空間變化。此外，測量樣品需要浸泡在不同折射率的折射率液中，并且需要使用相襯顯微鏡3進行觀察。這一過程極其繁瑣，而且受到一些限制：由于測量細胞需要浸泡在折射率液中，必須選擇合適的折射率液從而不使細胞的形貌產(chǎn)生改變。最近，已經(jīng)報道了使用顯微鏡原理精確測量樣品平均折射率的技術4,5，其能夠定量精確測量由于樣品帶來的相移。但是三維空間的折射率分布測量還沒有實現(xiàn)。一個測

3、量三維折射率的技術是基于測量不同投影方向的折射率，其類似于X射線斷層掃描，測量各個投影方向的吸收系數(shù)?？臻g折射率的投影測量已經(jīng)通過幾種可以定量測得相位的顯微鏡技術4,6,7實現(xiàn)。還有更早的兩項研究使用光束旋轉8或是樣品旋轉9的方式得到了樣品的斷層掃描圖像。但是在使用光束旋轉的實驗中，折射率的定量測量資料沒有給出8而在需要樣品旋轉的實驗中，則必須將樣品浸泡在丙三醇中并且需要將樣品放進微管進行旋轉測量9。研究內(nèi)容我們提出了一種高分辨率定量測量樣品三維折射率的技術，這項技術可以測量懸浮的或者是在基底上的細胞，亦可以測量多細胞樣品，且不需擾動樣品或是將樣品浸在特殊的媒介物中。裝置（圖1）是基于馬赫-曾

4、德外差干涉儀10，可以使參考光產(chǎn)生頻移，從而使馬赫-曾德外差干涉儀產(chǎn)生基于時間變化的定量相位圖像。氦氖激光器的光束（波長為633納米）被分束鏡分成了兩束：一束為物光，另一束為參考光。在油浸聚光透鏡與物鏡之間放置的是一個傾斜的掃描全反鏡，其是用來調(diào)節(jié)入射光進入樣品的角度。在參考光路中，激光光束經(jīng)過兩個聲光調(diào)制器（AMO），使激光的頻率移動1250赫茲。第二個分束鏡的作用是將物光與參考光移動到同一光路中，使之在像平面上形成干涉條紋。對于每個入射角度，互補金屬氧化物半導體攝像頭（CMOS）（Photron 1024PCI）拍攝4張圖片，速度為5000幀圖像/秒。兩連續(xù)幀之間，物光相位與參考光相位的差

5、是Pi/2。隨后使用相移干涉術對相位圖像進行計算處理（補充方法已經(jīng)放在網(wǎng)絡上）。圖1 相位顯微斷層掃描術。BS1和BS2分別代表分束鏡1和分束鏡2；GM代表掃描全反鏡；L1代表焦距為250毫米的透鏡；BF代表聚光透鏡的后向焦平面；L1代表焦距為200毫米的透鏡。通過樣品的激光束（物光）使用激光的原有頻率，在圖中用紅色表示，經(jīng)過頻移的激光用作參考光，在圖中用藍色表示。圖中呈現(xiàn)了一個使用宮頸癌細胞作為樣品測量的典型干涉花樣。對于近場光波入射折射率差異較小的薄樣品時，入射場的相位等于折射率與光在樣品內(nèi)的傳播距離乘積的線積分，其是一個相當好的近似。因此，相位圖像可以簡單的認為描述了投影方向的折射率。類

6、似于X射線層析的各個投影方向的吸收率。（參見網(wǎng)絡上本文的補充說明圖1，為一幅相位幾何投影圖。）為了從投影相位圖片重建三維斷層折射率，我們應用基于選擇性后向投影法的程序11。我們對光束入射的方向的每一個元胞采用了離散反隨機變換，其中x指坐標中的傾斜方向，指物光方向與物鏡光軸之間的夾角。為了彌補的成像和入射的方向，我們首先讓x除以cos。入射角度通過聚光器和物鏡的數(shù)值孔徑限制于|<60度。為了減小投影衰減效應，我們應用迭代約束法。(補充方法和補充軟件在網(wǎng)絡上）為了驗證我們儀器的測量準確程度，我們首先測量了浸在稍低折射率油溶液里的顆粒直徑為10微米的聚苯乙烯顆粒折射率斷層圖片。（Polysci

7、ences，在波長為633納米時折射率為1.588；Cargille，在波長為633納米時折射率為1.559）斷層圖片顯示：顆粒內(nèi)部的折射率和周圍包裹的液體（油溶液）的折射率的差為delta n=0.0285 ± 0.0005，符合顆粒與油溶液兩者折射率差為0.029的條件。我們還使用了折射率從1.55到1.59各種不同的油溶液進行相似的實驗，結果都很好的符合了條件。通過測量與顆粒和油溶液界面都垂直的延長線上的折射率分布，我們估計我們設計的層析技術的橫向（x-y方向）空間分辨率約為0.5毫米；縱向（z方向）空間分辨率約為0.75毫米。下一步，我們使用在培養(yǎng)基中的宮頸癌細胞作為樣品成像

8、。我們從培養(yǎng)基中分離出細胞，將分離出的部分細胞放在蓋玻片基板上。對單細胞的三維折射率斷層分析（參見圖2a，b和補充視頻1，均已在網(wǎng)絡上）和XY方向基底上，在高度z分別為12，9.5，8.5，7.5，6.5和5.5微米的同一水平面的斷層分析（參見圖2c到2h）表明：折射率分布相當不均勻，從1.36到1.40不等。同時可以發(fā)現(xiàn)在斷層圖像（圖2e，2f）和相應的明視野圖像（圖2i，2j）之間，有很明顯的相似。其描繪了細胞邊界，細胞核邊界，同時也描繪了核仁的大小和形狀。圖2 宮頸癌細胞的斷層折射率分布圖。（圖a） 宮頸癌細胞的三維渲染圖像。上半球的最外層的細胞被省略為了顯示出其內(nèi)部結構。核仁用綠色標出

9、。部分折射率高于1.36的細胞漿用紅色標出。圖中立方體邊框的邊長為20微米。（圖b）圖a的頂視圖。（圖c-圖h）樣品切片在不同高度的斷層圖像。圖c中的比例尺為10微米。色條表示在波長為633納米時的折射率大小。（圖i，圖j）分別是對應圖e和圖f的明視野圖像。我們注意到遠離核仁的原子核的折射率（折射率在1.355到1.365之間）小于一部分細胞漿的折射率（折射率在1.36到1.39之間）.而核仁的折射率，其范圍處于1.375到1.385之間，要普遍大于其他原子核的折射率。這個結論與經(jīng)常被應用的結論“原子核的折射率都大于細胞其他部分的折射率”恰恰相反12。我們使用傳統(tǒng)的HEK 239細胞，B35神

10、經(jīng)母細胞瘤細胞，大鼠海馬神經(jīng)細胞作為樣品，也得到了類似的結論。所用的樣品細胞都包含有很多細小的細胞漿顆粒，其折射率都較大。它們可能是脂質(zhì)，溶酶體，液泡或其他細胞器。下一步，我們使用折射率斷層掃描的方法檢測活細胞的生理變化。局部應用醋酸可能會導致子宮頸地區(qū)變白，這被廣泛用于確定癌前病變的可疑地點?？梢哉f明，細胞核蛋白的凝固可能增大細胞核和細胞漿之間的折射率對比度13。為了探討低濃度醋酸對細胞結構的影響，并解釋醋酸使組織漂白的機制，我們將宮頸癌細胞的培養(yǎng)環(huán)境從自然培養(yǎng)環(huán)境改變?yōu)槭古囵B(yǎng)基中含有0.38乙酸的環(huán)境，并使用我們的斷層顯微鏡記錄細胞折射率斷層圖片（圖3a，3b）。光學層析圖片可以在不足10

11、秒之內(nèi)得到，從而能夠測量由外部擾動造成的相對迅速的細胞變化。我們觀察到細胞核核仁的折射率從1.36上升到1.39，而細胞內(nèi)其它非均質(zhì)性的折射率也急劇增加。這說明了同時增加散射與酸漂白會導致細胞核仁與細胞其它組織的折射率差異增大，同時使細胞的折射率分布變得不均勻。三分鐘后將含醋酸的培養(yǎng)基更換為正常培養(yǎng)基，細胞的折射率空間分布差異變小了一些，但是與基準值仍有較大差距（圖3c）。圖3 醋酸對宮頸癌細胞的影響和線蟲的影像（圖3a-圖3c）。 （a）宮頸癌細胞在培養(yǎng)皿中x-y方向的層析圖像。（b）在含有濃度為0.38醋酸的培養(yǎng)皿中三分鐘后的層析圖片。（c）將培養(yǎng)皿換成正常的中性培養(yǎng)皿，三分鐘后的層析圖片

12、。圖像中的比例尺為10微米。（d）x-y方向線蟲的層析圖像。線蟲的前端在右方。圖像中的比例尺為50微米。色條代表在波長為633納米條件下的折射率。為了對多細胞有機體進行層析成像，我們選擇了線蟲類中的新桿狀線蟲進行實驗。我們將線蟲和10毫米長的疊氮化鈉平行放置在一個線蟲類的培養(yǎng)基緩沖區(qū)中并使用相同的方法對樣品進行層析成像。我們采用了重疊斷層圖片的數(shù)據(jù)重構方式并將實驗所得到的數(shù)據(jù)生成圖片（圖3d和在網(wǎng)絡上的補充圖2）。圖中，幾個內(nèi)部結構均清晰可見，其中包括很明顯的咽部和消化道結構。最后，我們使用了在光學黏稠劑中懸浮的聚苯乙烯顆粒來討論對厚樣品物體拍攝斷層圖片獲取其折射率的方法。對于這些樣品，投影近

13、似不再有效。其表現(xiàn)在得到的層析重建圖像中的聚苯乙烯顆粒有嚴重的扭曲及離焦效應（已經(jīng)在網(wǎng)絡上的補充圖3）。但是，通過改變聚焦于樣品上的焦點，理論上可能獲得任何樣本深度的準確層析圖（已經(jīng)在網(wǎng)絡上的補充圖3和圖4）。一個厚樣品的三維層析圖可以通過對樣品不同深度層析后重建圖像得到（參見補充方法）。總結最后是我們的總結，我們設計了一種定量測量活細胞和組織折射率的層析技術。由層析顯微放大技術重建三維樣品的圖像的方法可以補充其它圖像顯示技術，如蘇木精技術和曙紅染色技術。折射率數(shù)據(jù)可以用來研究細胞和組織的光散射特性，也可以用來研究在顯微放大中樣品帶來的像差。表征和改正這些像差對現(xiàn)代超分辨技術如STED14，結

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