現(xiàn)代基因檢測技術(shù)

1、馬明星馬明星 分子生物學(xué)博士分子生物學(xué)博士昆明醫(yī)學(xué)會委員昆明醫(yī)學(xué)會委員云南省海外留學(xué)人員學(xué)會理事云南省海外留學(xué)人員學(xué)會理事現(xiàn)代基因檢測技術(shù)婦幼臨床診斷領(lǐng)域應(yīng)用A.A.醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)臨床醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)臨床醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)表觀表觀- -望聞問切望聞問切深度觀察深度觀察-CT-CT、磁共振、磁共振、B B超超常規(guī)實驗室檢驗常規(guī)實驗室檢驗- -化學(xué)、生物（培養(yǎng)等）化學(xué)、生物（培養(yǎng)等）分子生物學(xué)檢驗分子生物學(xué)檢驗- -免疫學(xué)、核酸（基因免疫學(xué)、核酸（基因/DNA/RNA/DNA/RNA）一個充滿著機遇，即將蓬勃發(fā)展的領(lǐng)域一個充滿著機遇，即將蓬勃發(fā)展的領(lǐng)域分子生物學(xué)診斷技術(shù)分子生物學(xué)診斷技術(shù) 以核酸、

2、蛋白質(zhì)、多糖等生物分子作為檢測靶標；以核酸、蛋白質(zhì)、多糖等生物分子作為檢測靶標； 特點特點： 檢檢測生物的基本特征和屬性，避免其它干擾物的影響；測生物的基本特征和屬性，避免其它干擾物的影響； 檢測技術(shù)發(fā)展快，配套設(shè)施設(shè)備自動化程度高；檢測技術(shù)發(fā)展快，配套設(shè)施設(shè)備自動化程度高； 方法穩(wěn)定可靠，靈敏度和特異性高方法穩(wěn)定可靠，靈敏度和特異性高。 代表方法：代表方法：ElisaElisa、PCRPCR、Q-PCRQ-PCR、免疫熒光、免疫熒光 分子生物學(xué)檢測手段將會逐步取代部分原有醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)分子生物學(xué)檢測手段將會逐步取代部分原有醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)免疫學(xué)診斷技術(shù)免疫學(xué)診斷技術(shù) 原理：抗原與抗體的相互識別 領(lǐng)

3、域： 感染性疾病、遺傳性疾病檢測；細胞因子、腫瘤蛋白等； 優(yōu)勢： 速度快（1-3h），操作簡單（試紙），價格低廉； 缺陷： 通量低（1項/次） 假陽性（特異性差，背景高）， 假陰性（靈敏度差），無內(nèi)對照（過程控制）。免疫學(xué)診斷技術(shù)免疫學(xué)診斷技術(shù)基因檢測技術(shù)基因檢測技術(shù) 原理：基于核酸擴增技術(shù)或序列分析技術(shù) 核酸=基因=DNA或RNA 領(lǐng)域： 感染性疾病、遺傳性疾病檢測；親緣關(guān)系鑒定等；腫瘤等； 優(yōu)勢： 極高的靈敏度（50拷貝），極高的特異性（95%）， 速度快（3-5h）； 缺陷： 通量低（1-2項/次） 假陽性（污染），無內(nèi)對照（過程控制）基因檢測技術(shù)基因檢測技術(shù)基因檢測技術(shù)基因檢測技術(shù)PC

4、R：聚合酶鏈式反應(yīng)FQ-PCR：熒光定量PCRSanger測序：800bp以內(nèi)的基因測序分析優(yōu)勢： 極高的靈敏度（50拷貝），極高的特異性（95%）， 速度快（3-5h）；缺陷： 通量低（1-2項/次） 假陽性（污染），無內(nèi)對照（過程控制）核型分析：基于染色體形態(tài)的分析方法RFLP：限制性內(nèi)切酶多態(tài)性分析FISH:染色體熒光原位雜交基因檢測技術(shù)基因檢測技術(shù)PCR的原理基因檢測技術(shù)基因檢測技術(shù)PCR的原理基因檢測技術(shù)基因檢測技術(shù)實時熒光定量PCR基因檢測技術(shù)基因檢測技術(shù)Sanger測序原理B.B.現(xiàn)代基因檢測技術(shù)現(xiàn)代基因檢測技術(shù)現(xiàn)代基因檢測技術(shù)現(xiàn)代基因檢測技術(shù) 高通量：一次能完成多個指標的測定；

5、 高可靠性：對照/質(zhì)控體系完善，平行實驗； 高準確性：高度的靈敏度和特異性； 自動化：盡量由儀器設(shè)備完成； 高效率：縮短檢測時間，為治療爭取更大的機會 采樣便捷：檢測什么 采集什么 基因芯片技術(shù)：固態(tài)芯片 液態(tài)芯片(流式熒光) NGS：下一代測序基因芯片技術(shù)基因芯片技術(shù)固態(tài)芯片固態(tài)芯片液態(tài)芯片液態(tài)芯片基因芯片技術(shù)原理基因芯片技術(shù)原理 準確性：基于核酸的檢測準確性：基于核酸的檢測 靈敏度：基因擴增（靈敏度：基因擴增（PCR）、熒光標記）、熒光標記 特異性：基因擴增（特異性：基因擴增（PCR）、分子雜交）、分子雜交 可靠性：內(nèi)對照體系、自動化檢測可靠性：內(nèi)對照體系、自動化檢測現(xiàn)代基因檢測技術(shù)現(xiàn)代基

6、因檢測技術(shù)基因芯片基因芯片=DNA=DNA微陣列（微陣列（DNA Micro-ArrayDNA Micro-Array）基因芯片技術(shù)基因芯片技術(shù) 高通量一次檢測中即可對完成通常技術(shù)多次試驗才能得到的結(jié)果； 自動化大量操作和數(shù)據(jù)分析由計算機完成，降低使用者工作量，減少人為因素對結(jié)果的影響； 可靠性高通過芯片探針的合理設(shè)計，能夠在芯片上設(shè)置多種對照探針和多次重復(fù)試驗，對整個操作過程起到監(jiān)控作用，檢測結(jié)果來自多個平行重復(fù)，結(jié)果更加可靠。 高效率短時間內(nèi)可以完成大量生物信息的檢測；下一代測序下一代測序NGS 高通量：一次對多個DNA簇進行測序； 高效率：短時間完成GB級或TB級的測序總讀長； 更靈敏：

7、可以測定痕量的DNA標本(無創(chuàng)產(chǎn)前篩查)； 高精度：精確度可達99.9%以上； 成本低：極低的單堿基測序成本（相對于焦磷酸測序）； illumina Roche ABI 華大？下一代測序下一代測序NGSC.C.現(xiàn)代基因檢測技術(shù)與婦幼臨床診斷現(xiàn)代基因檢測技術(shù)與婦幼臨床診斷現(xiàn)代基因檢測技術(shù)能為臨床做什么現(xiàn)代基因檢測技術(shù)能為臨床做什么復(fù)雜感染的快速系統(tǒng)化診斷（有沒有，是什么）復(fù)雜感染的快速系統(tǒng)化診斷（有沒有，是什么）遺傳性疾病診斷（人基因組遺傳性疾病診斷（人基因組SNPSNP）病原體耐藥檢測（病原體病原體耐藥檢測（病原體SNPSNP）個體化用藥指導(dǎo)（人基因組個體化用藥指導(dǎo)（人基因組SNPSNP）現(xiàn)代

8、基因檢測技術(shù)能為臨床做什么現(xiàn)代基因檢測技術(shù)能為臨床做什么SNP：單核苷酸多態(tài)性基因檢測與感染基因檢測與感染I . 感染性疾病檢測HPV高通量分型檢測TORCH優(yōu)生5項檢測泌尿生殖系統(tǒng)感染檢測呼吸系統(tǒng)感染檢測消化系統(tǒng)感染檢測外界病原體（細菌、真菌、病毒、支原體、衣原體）侵入人體組織器官引起的疾病Infections感染性疾病往往癥狀相似，為臨床判斷帶來不便針對單種病原體的檢測容易產(chǎn)生漏檢或誤檢多病原體多重感染在臨床中十分常見HPV=HPV=人人 乳頭瘤乳頭瘤 病毒病毒宮頸癌是唯一病因明確、可以預(yù)防、可以早期治療的癌癥宮頸癌是唯一病因明確、可以預(yù)防、可以早期治療的癌癥能夠感染人體生殖道的能夠感染人

9、體生殖道的HPVHPV大約有大約有4040種種高危性高危性HPVHPV長期反復(fù)感染（長期反復(fù)感染（5-105-10年）導(dǎo)致宮頸癌年）導(dǎo)致宮頸癌 無癥狀感染無癥狀感染低危型低危型HPVHPV感染導(dǎo)致感染導(dǎo)致“尖銳濕疣尖銳濕疣”分型較少的產(chǎn)品對于未涉及的分型較少的產(chǎn)品對于未涉及的HPVHPV亞型檢測結(jié)果為陰性亞型檢測結(jié)果為陰性正常條件下每年做一次正常條件下每年做一次HPVHPV核酸檢測即可保證不患宮頸癌核酸檢測即可保證不患宮頸癌HPVHPV分型核酸檢測比分型核酸檢測比HC2/TCTHC2/TCT檢測具有跟高的敏感性和客觀性檢測具有跟高的敏感性和客觀性男性同樣應(yīng)該檢測男性同樣應(yīng)該檢測HPV HPV

10、不宜自愈不宜自愈 男性生殖系統(tǒng)腫瘤男性生殖系統(tǒng)腫瘤“高發(fā)高發(fā)”和和“低發(fā)低發(fā)”現(xiàn)狀已經(jīng)改變現(xiàn)狀已經(jīng)改變基因檢測與感染基因檢測與感染-HPVCT UU NG HHVI/II MG MH TPCT UU NG HHVI/II MG MH TP常見的常見的“性病類性病類”感染病原體感染病原體 臨床有癥狀感染臨床有癥狀感染90%90%以上以上病原體多病原體多 多重感染常見多重感染常見 驗證式檢測無法完成驗證式檢測無法完成免疫法靈明度低免疫法靈明度低 培養(yǎng)法周期長易污染（培養(yǎng)法周期長易污染（UUUU） 藥敏有點藥敏有點基因檢測與感染基因檢測與感染-性傳播疾病性傳播疾病弓形蟲弓形蟲 風(fēng)疹病毒風(fēng)疹病毒 巨細

11、胞病毒巨細胞病毒 單純皰疹病毒單純皰疹病毒I/III/II型型優(yōu)生優(yōu)生5 5項項 致畸性病原體檢測的意義重大致畸性病原體檢測的意義重大常規(guī)常規(guī)TORCHTORCH檢測一般在懷孕后進行檢測一般在懷孕后進行常規(guī)免疫學(xué)方法窗口期長常規(guī)免疫學(xué)方法窗口期長 靈敏度較低靈敏度較低核酸檢測能夠在感染早期檢測核酸檢測能夠在感染早期檢測 結(jié)果可靠結(jié)果可靠TORCH-Plus & HPVTORCH-Plus & HPV分型分型 & & 泌尿生殖系統(tǒng)感染聯(lián)檢泌尿生殖系統(tǒng)感染聯(lián)檢基因檢測與感染基因檢測與感染-優(yōu)生優(yōu)生肺炎支肺炎支原體原體/ /衣原體衣原體 軍團菌軍團菌 腦膜炎球菌腦膜炎

12、球菌 肺炎鏈球菌肺炎鏈球菌 流感流感嗜血嗜血桿桿菌菌 腺病毒腺病毒 鮑曼不鮑曼不動動桿菌桿菌 非典病毒非典病毒 甲流甲流/ /乙型乙型 合胞體病毒合胞體病毒 副副流流感感病毒病毒 鼻病毒鼻病毒 偏偏肺病肺病毒毒 EBEB病毒病毒病原體多病原體多 感染情況復(fù)雜感染情況復(fù)雜 臨床無有效篩查手段臨床無有效篩查手段少部分熒光少部分熒光PCRPCR可檢可檢 極少可培養(yǎng)但周期長易污染極少可培養(yǎng)但周期長易污染有效指導(dǎo)抗生素使用有效指導(dǎo)抗生素使用 避免濫用帶來的危害避免濫用帶來的危害( (耐藥、二次、費用耐藥、二次、費用) )針對特殊人群快捷高效針對特殊人群快捷高效 為治療爭取時間為治療爭取時間( (老人小孩

13、老人小孩) )基因檢測與感染基因檢測與感染-呼吸系統(tǒng)呼吸系統(tǒng)大腸桿菌大腸桿菌EO157/EPEC EO157/EPEC 傷寒傷寒/ /副傷寒副傷寒 空腸空腸彎曲彎曲菌菌 李斯李斯特特菌菌 弗弗氏志氏志賀賀菌菌 小腸小腸結(jié)腸炎耶爾森結(jié)腸炎耶爾森菌菌 柯柯薩奇薩奇病毒病毒1616 腸道病毒腸道病毒71 71 輪輪狀病毒狀病毒RV RV 幽門螺桿菌幽門螺桿菌.病原體多病原體多 感染情況復(fù)雜感染情況復(fù)雜 臨床無有效篩查手段臨床無有效篩查手段幼兒腹瀉幼兒腹瀉 手足口病檢測手足口病檢測病原性食物中毒檢測病原性食物中毒檢測少部分熒光少部分熒光PCRPCR可檢可檢 極少可培養(yǎng)但周期長易污染極少可培養(yǎng)但周期長易

14、污染有效指導(dǎo)抗生素使用有效指導(dǎo)抗生素使用 避免濫用帶來的危害避免濫用帶來的危害( (耐藥、二次、費用耐藥、二次、費用) )針對特殊人群快捷高效針對特殊人群快捷高效 為治療爭取時間為治療爭取時間( (嬰幼兒嬰幼兒) )基因檢測與感染基因檢測與感染-消化系統(tǒng)消化系統(tǒng)甲乙丙丁戊庚感染甲乙丙丁戊庚感染 艾滋病病毒艾滋病病毒 梅毒螺旋體梅毒螺旋體嚴重血液感染嚴重血液感染 傳染危害較大傳染危害較大艾滋病與肝炎等容易并發(fā)感染艾滋病與肝炎等容易并發(fā)感染極大縮短窗口期，提高檢測準確性極大縮短窗口期，提高檢測準確性“血源篩查血源篩查”基因檢測與感染基因檢測與感染-血液感染血液感染解脲支原體解脲支原體UU 、人形支

15、原體、人形支原體MH、HPV11，31，56 混合感染混合感染呼吸系統(tǒng)感染呼吸系統(tǒng)感染基因檢測與感染基因檢測與感染基因檢測與感染基因檢測與感染基因檢測與病原體耐藥基因檢測與病原體耐藥病原體（細菌、真菌、病毒、支原體、衣原體）對藥物敏感或抵抗/耐受Resistant避免耐藥毒株的產(chǎn)生指導(dǎo)臨床用藥降低治療成本和難度R. 病原體耐藥結(jié)核分枝桿菌檢測及耐藥分析HBV檢測及耐藥分析HCV檢測及耐藥分析病原體為什么會耐藥？病原體為什么會耐藥？藥物藥物“壓力壓力”對基因突變的選擇（適者生存）對基因突變的選擇（適者生存）病原體為什么很容易出現(xiàn)耐藥？病原體為什么很容易出現(xiàn)耐藥？群體龐大，傳代周期短群體龐大，傳代

16、周期短如何降低耐藥性病原體的產(chǎn)生？如何降低耐藥性病原體的產(chǎn)生？用藥前就弄清楚它對什么藥敏感用藥前就弄清楚它對什么藥敏感基因檢測與病原體耐藥基因檢測與病原體耐藥根據(jù)自身基因特點（SNP）合理用藥或生活Genomic個體化用藥個體化生活G. 基因多態(tài)性檢測心腦血管疾病用藥指導(dǎo)高血壓用藥指導(dǎo)EGFR、K-ras、B-raf基因多態(tài)性檢測PIK3c、PDGFR-、ERCC1、XRCC1基因多態(tài)性檢測EML4-ALK基因融合檢測華法林用藥指導(dǎo)基因檢測與個體化用藥基因檢測與個體化用藥ALDH2 CYP2C19 ALDH2 CYP2C19 MTHFRMTHFR酒精代謝能力評估（能否飲酒）酒精代謝能力評估（能

17、否飲酒） 速效救心丸效果評估（是否有效）速效救心丸效果評估（是否有效）評估多種藥物的代謝能力評估多種藥物的代謝能力 減少因藥物過度體內(nèi)停留帶來的危害減少因藥物過度體內(nèi)停留帶來的危害孕期婦女葉酸補充劑量測算孕期婦女葉酸補充劑量測算 降低畸形和唇腭裂發(fā)生率降低畸形和唇腭裂發(fā)生率降低降低“腦卒中腦卒中”發(fā)生率發(fā)生率標本：標本：DNADNA，口腔上皮脫落細胞，口腔上皮脫落細胞基因檢測與個體化用藥基因檢測與個體化用藥-葉酸葉酸利尿劑利尿劑 鈣離子拮抗劑鈣離子拮抗劑 血管緊張素等血管緊張素等指導(dǎo)高血壓患者根據(jù)自己基因特點服藥指導(dǎo)高血壓患者根據(jù)自己基因特點服藥提高藥物有效性提高藥物有效性 降低毒副作用降低毒

18、副作用基因檢測與個體化用藥基因檢測與個體化用藥-高血壓高血壓EGFR K-ras B-rafEGFR K-ras B-raf腫瘤的起因不同腫瘤的起因不同與多種腫瘤發(fā)生相關(guān)與多種腫瘤發(fā)生相關(guān)一個信號通路上的三個原件一個信號通路上的三個原件 聯(lián)合檢測才有意義聯(lián)合檢測才有意義靶向治療藥物作用位點靶向治療藥物作用位點基因檢測與個體化用藥基因檢測與個體化用藥-腫瘤腫瘤由于人體基因組的微小變化（SNP、缺失）引起的可遺傳疾病Heredity一般無法治愈 部分危害嚴重可能隱性攜帶 可傳遞給子代核酸檢測是金標準H. 遺傳性疾病檢測角膜營養(yǎng)不良地中海貧血Y染色體微缺失遺傳性耳聾基因檢測與遺傳性疾病基因檢測與遺傳

19、性疾病導(dǎo)致眼睛干澀導(dǎo)致眼睛干澀 視力下降視力下降使用使用“潤滑性潤滑性”眼藥水進行緩解眼藥水進行緩解進行屈光矯正手術(shù)前須檢測進行屈光矯正手術(shù)前須檢測 否則可導(dǎo)致失明否則可導(dǎo)致失明基因檢測與遺傳性疾病基因檢測與遺傳性疾病-角膜營養(yǎng)不良角膜營養(yǎng)不良或或兩種類型兩種類型分為輕度、中度、重度分為輕度、中度、重度兩廣地區(qū)高發(fā)兩廣地區(qū)高發(fā) 遺傳規(guī)律明確遺傳規(guī)律明確基因檢測與遺傳性疾病基因檢測與遺傳性疾病-地中海貧血地中海貧血遺傳因素的耳聾原因確定遺傳因素的耳聾原因確定避免藥物性耳聾的發(fā)生（糖甙類藥物）避免藥物性耳聾的發(fā)生（糖甙類藥物）嬰幼兒聽力篩查（有效檢測途徑）嬰幼兒聽力篩查（有效檢測途徑）覆蓋位點較全覆蓋位點較全基因檢測與遺傳性疾病基因檢測與遺傳性疾病-耳聾耳聾依據(jù)人體基因組上發(fā)生的微小變化（SNP）分析預(yù)測與該基因功能的相關(guān)健康因素變化Predict相關(guān)性與多種因素共同作用一般不作為醫(yī)學(xué)診斷依據(jù)對生活起居等起到一定指導(dǎo)作用P. 風(fēng)險評估類檢測遺傳性肥胖基因多態(tài)性檢測美容相關(guān)基因多態(tài)性檢測吸煙損傷評估多態(tài)性檢測糖尿病風(fēng)險評估基因檢測與健康預(yù)測基