研究進(jìn)程計劃表-殷曉霞

1、江 南 大 學(xué)研究生論文工作進(jìn)程計劃表學(xué)科或?qū)I(yè) 發(fā)酵工程 研究方向 發(fā)酵工學(xué) 研究生姓名 殷曉霞 學(xué)位級別 碩士 導(dǎo)師姓名 陳堅 填表日期 2011 年 6 月 19 日注：此表為研究生在導(dǎo)師或指導(dǎo)小組的指導(dǎo)下，由研究生本人填寫，經(jīng)導(dǎo)師、中心主任、研究生所在專業(yè)的責(zé)任教授審閱后，報研究生部備案，非經(jīng)同意不得改動。論文題目代謝工程改造解脂亞洛酵母產(chǎn)a-酮戊二酸本人已查閱過哪些科研資料及調(diào)研情況：a-酮戊二酸(a-ketoglutarate，a-KG)，又稱a-膠酮酸，2-氧代戊二酸或a-羰基戊二酸。a-酮戊二酸在微生物細(xì)胞的代謝中起著重要的作用，是三羧酸循環(huán)(TCA)的重要中間產(chǎn)物之一，在生物

2、體內(nèi)參與氨基酸、蛋白質(zhì)、維生素的合成以及能量代謝。a-酮戊二酸在食品、醫(yī)藥、有機合成、化妝品和飼料等工業(yè)中都有著廣泛應(yīng)用。目前工業(yè)上生產(chǎn)a-KG主要采用化學(xué)合成的方法，但是低產(chǎn)量和大量使用有毒有害的化學(xué)試劑限制了它的發(fā)展空間。而微生物發(fā)酵法正以其獨特的優(yōu)勢：高產(chǎn)量、低能耗、可持續(xù)發(fā)展等受到越來越多的關(guān)注。附下面一些重要的文獻(xiàn)。1.Zhou JW, Zhou HY, Du GC, Liu LM, Chen JA. Screening of a thiamine-auxotrophic yeast for a-ketoglutaric acid overproduction. Lett. Appl

3、. Microbiol., 2010. 51(3): 264-271.2.Barth G, Gaillardin C. Physiology and genetics of the dimorphic fungus Yarrowia lipolytica. FEMS Microbiol. Rev., 1997. 19(4): 219-237.3.Lockwood LB, Stodola FH. Preliminary studies on the production of -ketoglutaric acid by Pseudomonas fluorescens. J. Biol. Chem

4、., 1946. 164(1): 81-83.4.Finogenova Tv, Losinov Ab, Belikov Vm, Ermakova It, Muntjan Ln, En S. Keto-acid production by paraffin-oxidizing yeasts. Mikrobiologiya, 1968.5.Chernyavskaya OG, Shishkanova NV, Finogenova TV. Biosynthesis of a-ketoglutaric acid from ethanol by yeasts. Appl. Biochem. Microbi

5、ol., 1997. 33(3): 261-265.6.Tsugawa R, Okumura S. Fermentation of N-paraffins by yeast. 2. Alpha-ketoglutarate productivity of Candida lipolytica in various culture media. Agri. Biol. Chem., 1969. 33(5): 676-&.7.Chernyavskaya OG, Shishkanova NV, Ilchenko AP, Finogenova TV. Synthesis of a-ketoglutari

6、c acid by Yarrowia lipolytica yeast grown on ethanol. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2000. 53(2): 152-158.8.Liu LM, Li Y, Zhu Y, Du GC, Chen J. Redistribution of carbon flux in Torulopsis glabrata by altering vitamin and calcium level. Metab. Eng., 2007. 9(1): 21-29.9.Zhang DD, Liang N, Shi ZP, Liu L

7、M, Chen J, Du GC. Enhancement of -ketoglutarate production in Torulopsis glabrata: Redistribution of carbon flux from pyruvate to -ketoglutarate. Biotechnol. Bioproc. Eng., 2009. 14(2): 134-139.10.Madzak C, Gaillardin C, Beckerich JM. Heterologous protein expression and secretion in the non-conventi

8、onal yeast Yarrowia lipolytica: a review. J. Biotechnol., 2004. 109(1-2): 63-81.11.Roth R, Moodley V, Van Zyl P. Heterologous expression and optimized production of an Aspergillus aculeatus endo-1,4-beta-mannanase in Yarrowia lipolytica. Mol. Biotechnol., 2009. 43(2): 112-120.12.Neuveglise C, Nicaud

9、 JM, Ross-Macdonald P, Gaillardin C. A shuttle mutagenesis system for tagging genes in the yeast Yarrowia lipolytica. Gene, 1998. 213(1-2): 37-46.13.Fickers P, Le Dall MT, Gaillardin C, Thonart P, Nicaud JM. New disruption cassettes for rapid gene disruption and marker rescue in the yeast Yarrowia l

10、ipolytica. J. Microbiol. Meth., 2003. 55(3): 727-737.14.Forster A, Aurich A, Mauersberger S, Barth G. Citric acid production from sucrose using a recombinant strain of the yeast Yarrowia lipolytica. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2007. 75(6): 1409-1417.15.Poza M, Sestelo ABF, Ageitos JM, Vallejo JA,

11、Veiga-Crespo P, Villa TG. Cloning and expression of the XPR2 gene from Yarrowia lipolytica in Pichia pastoris. J. Agric. Food Chem., 2007. 55(10): 3944-3948.16.Holz M, Forster A, Mauersberger S, Barth G. Aconitase overexpression changes the product ratio of citric acid production by Yarrowia lipolyt

12、ica. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2009. 81(6): 1087-1096.17.Zelle RM, De Hulster E, Van Winden WA, De Waard P, Dijkema C, Winkler AA, Geertman JMA, Van Dijken JP, Pronk JT, Van Maris AJA. Malic acid production by Saccharomyces cerevisiae: Engineering of pyruvate carboxylation, oxaloacetate reductio

13、n, and malate export. Appl. Environ. Microbiol., 2008. 74(9): 2766-2777.18.Vemuri GN, Eiteman MA, Mcewen JE, Olsson L, Nielsen J. Increasing NADH oxidation reduces overflow metabolism in Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2007. 104(7): 2402-2407.19.Medina VG, Almering MJH, Va

14、n Maris AJA, Pronk JT. Elimination of glycerol production in anaerobic cultures of a Saccharomyces cerevisiae strain engineered to use acetic acid as an electron acceptor. Appl. Environ. Microbiol., 2010. 76(1): 190-195.20.Rico J, Pardo E, Orejas M. Enhanced production of a plant monoterpene by over

15、expression of the 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase catalytic domain in Saccharomyces cerevisiae. Appl. Environ. Microbiol., 2010. 76(19): 6449-6454.課題的意義及我國在這方面已進(jìn)行的工作情況：a-酮戊二酸是一種重要的有機酸，在食品、醫(yī)藥、化工和化妝品等行業(yè)都有廣泛應(yīng)用。中晚期腎病患者或肝功能不全患者在日常膳食中補充a-酮戊二酸可以減少腎臟負(fù)擔(dān)，改善生活質(zhì)量，有效延長壽命。健康人群在高強度體力勞動后補充a-酮戊二酸可以幫助

16、迅速恢復(fù)體力，避免過度疲勞產(chǎn)生的安全事故和慢性疲勞綜合癥。這兩大應(yīng)用導(dǎo)致目前國際市場對a-酮戊二酸的需求不斷增加。此外，a-酮戊二酸還廣泛用于生物化工的中間體，如作為酶法合成頭孢類抗生素的前體等。由于化學(xué)法合成a-酮戊二酸過程中存在嚴(yán)重的安全問題，無法直接用于食品和化妝品中。因此，基于發(fā)酵法生產(chǎn)a-酮戊二酸在食品和保健品行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，國內(nèi)研究主要集中于利用光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)來合成a-酮戊二酸。劉立明等人利用T. glabrata發(fā)酵產(chǎn)丙酮酸時，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中會同時積累一定量的a-酮戊二酸。進(jìn)一步研究表明，作為pH緩沖劑的CaCO3，能夠增強丙酮

17、酸羧化酶(pyruvate carboxylase，PC)的活性，從而增大丙酮酸通過羧化途徑進(jìn)入TCA循環(huán)的代謝通量，最終導(dǎo)致了a-酮戊二酸的大量積累。在此研究基礎(chǔ)上，梁楠等人通過在T. glabrata胞內(nèi)過量表達(dá)釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的乙酰輔酶A 合成酶基因(ACS2)，提高了胞內(nèi)乙酰輔酶A的水平，導(dǎo)致碳代謝流從丙酮酸節(jié)點更多地流向了a-酮戊二酸節(jié)點，有效地提高了a-酮戊二酸的產(chǎn)量。張旦旦等人采取了類似的調(diào)控策略，一方面在T. glabrata中過量表達(dá)丙酮酸脫羧酶(pyruvate decarboxylase，PDC)，另一方面在培養(yǎng)基中添加了PC的

18、輔因子生物素、丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(pyruvate dehydrogenase，PDH)的輔因子硫胺素和a-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體(a-ketoglutarate dehydrogenase，KGDH)的抑制劑過氧化氫。不僅加大了底物的利用速率，促進(jìn)了菌體的生長和代謝，而且有效地抑制了a-酮戊二酸的進(jìn)一步代謝，最終胞外a-酮戊二酸的濃度達(dá)到37.7 g/L，實現(xiàn)了a-酮戊二酸的高產(chǎn)。國外的研究動態(tài)及發(fā)展趨勢：目前，國外研究主要集中于利用解脂亞洛酵母(Yarrowia lipolytica)來生產(chǎn)a-酮戊二酸。研究內(nèi)容主要集中以下三個方面：(1) 揭示 Y. lipolytica產(chǎn)a-酮戊二酸的機

19、理；(2) 優(yōu)化產(chǎn)酸的營養(yǎng)和環(huán)境條件；(3) 闡述Y. lipolytica產(chǎn)a-酮戊二酸時的生理特征。Chernyavskaya等人研究了Y. lipolytica N1在以乙醇為唯一碳源時，硫胺素、pH、氮源濃度以及溶氧對最終產(chǎn)酸的影響。結(jié)果表明，硫胺素和銨離子濃度是影響產(chǎn)酸的關(guān)鍵因素，硫胺素的濃度會影響代謝途徑上的關(guān)鍵酶(KGDH和PDH)的活性，而銨離子的濃度決定了胞內(nèi)的代謝流向生成檸檬酸還是a-酮戊二酸。最終他們得出Y. lipolytica N1積累a-酮戊二酸的必要條件是硫胺素不足和氮源過量。在優(yōu)化的條件下，a-酮戊二酸的產(chǎn)量達(dá)到了49.0g/L，對乙醇的產(chǎn)率為42%。正如上面所

20、述，Y. lipolytica N1在不同的條件下可以積累檸檬酸或者a-酮戊二酸，于是Finogenova等人又對胞內(nèi)中心代謝途徑中的酶進(jìn)行了研究，進(jìn)而從微生物生理學(xué)的角度來揭示菌體產(chǎn)酸時的代謝情況。他們分別在Y. lipolytica N1產(chǎn)檸檬酸和產(chǎn)a-酮戊二酸的條件下，測定了胞內(nèi)TCA循環(huán)和乙醛酸循環(huán)中關(guān)鍵酶的活性，經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)：在產(chǎn)檸檬酸階段，檸檬酸合成酶的活性較高，而TCA循環(huán)中其他酶的活性都相對較低；在產(chǎn)a-酮戊二酸階段，檸檬酸合成酶和KGDH的活性較低，而依賴于NADPH的異檸檬酸脫氫酶(ICD)的活性較高。此外，在這兩種情況下乙醛酸循環(huán)中的關(guān)鍵酶蘋果酸合成酶和異檸檬酸裂解酶的的

21、活性都很低，說明在產(chǎn)酸階段乙醛酸循環(huán)是受到抑制的。在綜合分析了酶活和環(huán)境之間的關(guān)系后，作者認(rèn)為：在硫胺素不足，菌體生長受到限制的條件下，為了消除環(huán)境中過量的銨離子對細(xì)胞的毒害作用，菌體會加快胞內(nèi)的氮代謝。而由谷氨酸脫氫酶催化的a-酮戊二酸生成谷氨酸是氮代謝的關(guān)鍵步驟，這就導(dǎo)致了a-酮戊二酸的大量合成。開題報告1 立題的依據(jù)，選題必須對國民經(jīng)濟(jì)或在學(xué)術(shù)上有一定意義。a-酮戊二酸又稱a-膠酮酸，2-氧代戊二酸或a-羰基戊二酸，為白色或類白色的結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，無色，易溶于水。a-酮戊二酸在微生物細(xì)胞的代謝中起著重要的作用，是三羧酸循環(huán)(TCA)的重要中間產(chǎn)物之一，在生物體內(nèi)參與氨基酸、蛋白質(zhì)、維生

22、素的合成以及能量代謝，在微生物細(xì)胞的碳氮代謝調(diào)控中起著重要的作用。a-酮戊二酸在食品、醫(yī)藥、有機合成、化妝品和飼料等工業(yè)中都有著廣泛應(yīng)用。目前工業(yè)上生產(chǎn)a-酮戊二酸主要采用化學(xué)合成的方法，但是低產(chǎn)量和大量使用有毒有害的化學(xué)試劑限制了它的發(fā)展空間。而微生物發(fā)酵法正以其獨特的優(yōu)勢：高產(chǎn)量、低能耗、可持續(xù)發(fā)展等受到越來越多的關(guān)注。在a-酮戊二酸代謝過程中存在兩個重要的節(jié)點：一是由丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(Pyruvate dehydrogenase，PDH)催化由丙酮酸生成檸檬酸，這是進(jìn)入TCA循環(huán)的關(guān)鍵節(jié)點，二是由a-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體(a-ketoglutarate dehydrogenase，KG

23、DH)催化的a-酮戊二酸脫氫反應(yīng)，其直接導(dǎo)致了a-酮戊二酸的降解。因此，普遍認(rèn)為高產(chǎn)a-酮戊二酸的關(guān)鍵在于一方面加大碳代謝流進(jìn)入TCA循環(huán)；另一方面減少a-酮戊二酸的進(jìn)一步代謝。研究表明，PDH和KGDH共同的輔因子硫胺素在a-酮戊二酸積累中起到關(guān)鍵作用。在發(fā)酵初期過量的碳源和一定量的硫胺素會促使菌體生長，當(dāng)菌體生長到一定階段而硫胺素被大量消耗時，發(fā)酵進(jìn)入由硫胺素控制的生長限制階段，此時KGDH的活性受到抑制，a-酮戊二酸的進(jìn)一步代謝受到阻礙，因而實現(xiàn)a-酮戊二酸的大量積累。本實驗室早期通過篩選得到了一株高產(chǎn)a-酮戊二酸的菌株，經(jīng)菌種鑒定命名為解脂亞洛酵母(Yarrowia lipolytic

24、a WSH-Z06），現(xiàn)保藏與中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號為CCTCC NO:M207143。該菌能以甘油為唯一碳源，在硫胺素亞適量的條件下，過量積累a-酮戊二酸。在最佳產(chǎn)酸條件下，發(fā)酵144 h后a-酮戊二酸產(chǎn)量可達(dá)39.3 g/L。但是，發(fā)酵過程中會產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物丙酮酸。由于丙酮酸是碳代謝流進(jìn)入TCA循環(huán)的關(guān)鍵節(jié)點，所以與丙酮酸相關(guān)的各條代謝途徑都會影響最終碳代謝流進(jìn)入TCA循環(huán)的通量，進(jìn)而影響a-酮戊二酸的生成。本課題擬通過強化丙酮酸進(jìn)入TCA循環(huán)的通量來提高a-酮戊二酸的產(chǎn)量，一方面過量表達(dá)丙酮酸羧化酶強化TCA回補途徑；另一方面過量表達(dá)乙酰輔酶A合成酶和ATP-檸檬酸

25、裂解酶調(diào)控胞內(nèi)輔因子代謝。2 課題進(jìn)行的途徑，步驟的設(shè)想。(1)揭示解脂亞洛酵母積累a-酮戊二酸的機理。從本實驗室篩選的a-酮戊二酸高產(chǎn)菌株Yarrowia lipolytica WSH-Z06出發(fā)，在其整個發(fā)酵過程中，利用定量PCR技術(shù)對產(chǎn)酸途徑上的關(guān)鍵基因表達(dá)量進(jìn)行定量。與發(fā)酵初始比較，尋找影響產(chǎn)酸的關(guān)鍵基因，進(jìn)一步通過對基因表達(dá)量的分析揭示解脂亞洛酵母積累a-酮戊二酸的機理 (2)代謝工程改造解脂亞洛酵母促進(jìn)a-酮戊二酸的積累。利用已有的解脂亞洛酵母質(zhì)粒，構(gòu)建相關(guān)基因的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化原始菌得到代謝途徑得到修飾的重組菌，考察其在合適條件下的發(fā)酵性能。(3)重組菌的發(fā)酵優(yōu)化。對(2)中得到的

26、一系列重組菌進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化，進(jìn)一步提高a-酮戊二酸的產(chǎn)量。3 需使用的儀器，一般應(yīng)以選擇本院現(xiàn)有儀器及設(shè)備為主，估計需要經(jīng)費多少？完成本課題需要使用的儀器主要包括:PCR儀 美國BIO-RAD公司GelDoc凝膠成像系統(tǒng) 美國BIO-RAD公司DYY-6C型電泳儀 北京市六一儀器廠DKB-600A型電熱恒溫水槽 上海森信實驗儀器有限公司LRHS-150B恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠臺式高速離心機 德國 eppendorf 公司蛋白電泳儀 美國BIO-RAD公司電轉(zhuǎn)儀 美國BIO-RAD公司漩渦混合器 上海琪特分析儀器有限公司制冰機 三洋公司電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海賀德實驗設(shè)備有限公司

27、立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司722s可見分光光度計 上海棱光技術(shù)有限公司KYC100B培養(yǎng)搖床 上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司HZS-H水浴振蕩器 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠DKY-恒溫調(diào)速回轉(zhuǎn)式搖床 上海杜科自動化設(shè)備有限公司Himac CR 22G冷凍離心機 日立公司 定量PCR儀 羅氏公司整個課題完成約需要經(jīng)費：30,000元4 課題進(jìn)行時可能出現(xiàn)的問題及準(zhǔn)備采取的應(yīng)變措施。由于本實驗室對Yarrowia lipolytica WSH-Z06的生理和代謝研究較少，對其進(jìn)行代謝工程改造面臨以下幾個問題：(1)原始菌缺乏穩(wěn)定的遺傳標(biāo)記，無法直接進(jìn)行外源基因的表達(dá)，所以首先需要通過基

28、因敲除技術(shù)得到尿嘧啶或亮氨酸的營養(yǎng)缺陷型菌株，才能進(jìn)行后續(xù)的代謝改造。(2)原始菌未經(jīng)任何遺傳改造，沒有成熟的轉(zhuǎn)化體系。(3)鑒于微生物代謝和生理上的復(fù)雜性，簡單的代謝改造未必能對產(chǎn)酸起到較大的作用，改造效果不一定明顯。解決措施：(1)敲除URA3基因，構(gòu)建尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株或者將原有質(zhì)粒上的URA3標(biāo)記基因替換成潮霉素B抗性基因，然后利用潮霉素B來篩選重組子。(2)嘗試多種轉(zhuǎn)化方法，包括：醋酸鋰法、電轉(zhuǎn)法和基因槍等，并優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件，以期探索到一個高效的轉(zhuǎn)化方法。(3)表達(dá)不同來源的基因以減少密碼子偏好性等因素對基因表達(dá)的影響，多拷貝整合提高基因的表達(dá)量，強化相關(guān)代謝途徑。課題與教研室及導(dǎo)師

29、的科研工作有無關(guān)系，與已畢業(yè)的研究生課題聯(lián)系：本實驗室早期通過篩選得到了一株高產(chǎn)a-酮戊二酸的菌株，經(jīng)菌種鑒定命名為解脂亞洛酵母(Yarrowia lipolytica WSH-Z06），現(xiàn)保藏與中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號為CCTCC NO:M207143。該菌能以甘油為唯一碳源，在硫胺素亞適量的條件下，過量積累a-酮戊二酸。在最佳產(chǎn)酸條件下，發(fā)酵144 h后a-酮戊二酸產(chǎn)量可達(dá)39.3 g/L。論文工作計劃階段工作內(nèi)容及預(yù)計完成的指標(biāo)：2011年1月-2011年3月 通過定量PCR技術(shù)研究產(chǎn)酸關(guān)鍵途徑上相關(guān)基因的表達(dá)情況，揭示解脂亞洛酵母積累a-酮戊二酸的機理。2011年3月-2011年6月 將p0質(zhì)粒上的URA3標(biāo)記基因替換成hph基因，并構(gòu)建p0(hph)-ACS1