艾滋病、梅毒、乙肝實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)

1、艾滋病、梅毒、乙肝實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)白志永2015.12.30艾滋病抗體檢測(cè)及 樣品處理實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理生物安全質(zhì)量控制梅毒乙肝 檢測(cè)要點(diǎn)艾滋病抗體檢測(cè)及樣品處理艾滋病抗體檢測(cè)及樣品處理一、一、HIV抗體檢測(cè)篩查方法抗體檢測(cè)篩查方法 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） 化學(xué)發(fā)光或免疫熒光試驗(yàn) 快速檢測(cè)（RT） （建議配備合格的快速檢測(cè)試劑，灰區(qū)。）二、二、 篩查程序篩查程序 初篩和復(fù)檢流程 （圖1）三、篩查試驗(yàn)結(jié)果的報(bào)三、篩查試驗(yàn)結(jié)果的報(bào)告告 （建議用修改后附表3）（例） HIV抗體篩查試驗(yàn)用附表1進(jìn)行報(bào)告，陰性反應(yīng)報(bào)告為“HIV抗體陰性（-）”；陽(yáng)性反應(yīng)報(bào)告為“HIV抗體待復(fù)檢”。四、四、 HIV感染

2、產(chǎn)婦所生兒童感染產(chǎn)婦所生兒童HIV抗體檢測(cè)策略及流程抗體檢測(cè)策略及流程 1 1、適用范圍、適用范圍 HIV感染產(chǎn)婦所生嬰幼兒；已滿18個(gè)月的嬰幼兒，其母親HIV感染狀態(tài)不詳，兒童出現(xiàn)HIV相關(guān)臨床表現(xiàn)，臨床懷疑HIV感染的兒童。2 2、檢測(cè)程序、檢測(cè)程序五、樣品的處理五、樣品的處理 1 1樣品的保存樣品的保存 用于抗體和抗原檢測(cè)的血清或血漿樣品，短期（1周）內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)的可存放于28， 一周以上應(yīng)存放于-20以下。 2.2.樣品的運(yùn)送樣品的運(yùn)送（例）（例） （1）應(yīng)符合生物安全要求； (2)應(yīng)采用三層容器對(duì)樣品進(jìn)行包裝。 第一層容器第一層容器：直接裝樣品，應(yīng)防滲漏。樣品應(yīng)置于帶蓋的試管內(nèi)。在試管

3、的周?chē)鷳?yīng)墊有緩沖吸水材料，以免碰碎。 第二層容器：容納并保護(hù)第一層容器，可以裝若干個(gè)第一層容器。要求不易破碎、帶蓋、防滲漏、容器的材料要易于消毒處理。 第三層容器第三層容器：容納并保護(hù)第二層容器的運(yùn)輸用外層包裝箱。外面要貼上醒目的標(biāo)簽、聯(lián)系方式，還應(yīng)易于消毒。 (3) 用于抗體檢測(cè)的血清和血漿樣品應(yīng)在凍存凍存條件下運(yùn)送。質(zhì)量控制質(zhì)量控制一、一、 艾滋病抗體檢測(cè)的統(tǒng)計(jì)艾滋病抗體檢測(cè)的統(tǒng)計(jì)學(xué)室內(nèi)質(zhì)量控制學(xué)室內(nèi)質(zhì)量控制 1 1、試劑盒內(nèi)部對(duì)照、試劑盒內(nèi)部對(duì)照 即試劑盒提供的陽(yáng)性和陰性對(duì)照血清。用于判斷實(shí)驗(yàn)的有效性，不能作為室內(nèi)質(zhì)控品使用，內(nèi)部對(duì)照結(jié)果無(wú)效，必須重新試驗(yàn)。 2 2、室內(nèi)質(zhì)控品、室內(nèi)質(zhì)控

4、品 為非試劑盒組份的外部質(zhì)控品，是為了監(jiān)控檢測(cè)的重復(fù)性而設(shè)置的，包括強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性和陰性質(zhì)控血清。也可以只設(shè)置一個(gè)弱陽(yáng)性質(zhì)控，以該試劑盒臨界值（Cut-off）的23倍為宜。作用：判斷該批臨床樣品檢測(cè)的有效性，每次實(shí)驗(yàn)必須包含室內(nèi)質(zhì)每次實(shí)驗(yàn)必須包含室內(nèi)質(zhì)控品，控品，其結(jié)果無(wú)效，必須重新試驗(yàn)。二、二、 統(tǒng)計(jì)室內(nèi)質(zhì)控的主要表統(tǒng)計(jì)室內(nèi)質(zhì)控的主要表示方法示方法建立質(zhì)控圖建立質(zhì)控圖 最常用的質(zhì)控圖是Levey-Jennings質(zhì)控圖，下面以ELISA方法檢測(cè)HIV抗體為例，描述建立質(zhì)控圖步驟： 2 2、繪制質(zhì)控圖、繪制質(zhì)控圖 （a）在常規(guī)條件下，對(duì)同一批血清連續(xù)測(cè)定20次（天）或以上，獲得一組S/CO值

5、，求均數(shù)（ ）和標(biāo)準(zhǔn)差（s）, 超出2s或3s的數(shù)據(jù)不應(yīng)刪除。 （b）將均值（ ）和標(biāo)準(zhǔn)差（s）分別在質(zhì)控框架圖中標(biāo)示出來(lái)。以S/CO值作縱座標(biāo)（Y軸），每一批次試驗(yàn)作橫座標(biāo)（x軸），繪制質(zhì)控圖。（c）從第21次起，將每次質(zhì)控血清的檢測(cè)結(jié)果依次點(diǎn)入該質(zhì)控框架圖中，檢驗(yàn)進(jìn)入質(zhì)控狀態(tài)。 3 3、質(zhì)控規(guī)則及其使用、質(zhì)控規(guī)則及其使用 質(zhì)控規(guī)則的使用應(yīng)檢出隨機(jī)誤差和系統(tǒng)誤差，目前有許多質(zhì)控規(guī)則，常用的是12S和13S規(guī)則。 （a）告警（12S）：當(dāng)外部質(zhì)控品的S/CO值超出 +2s范圍時(shí)，系統(tǒng)處于告警狀態(tài)，應(yīng)予注意，是否可以繼續(xù)檢測(cè)需要進(jìn)一步觀察。若將12S做失控標(biāo)準(zhǔn)，有較高的假失控概率，所以一般不采用

6、。（b）失控（13S）：當(dāng)外部質(zhì)控品的S/CO值超出 +3s范圍時(shí)，系統(tǒng)處于失控狀態(tài)，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能被接受，可能是系統(tǒng)誤差、隨機(jī)誤差或外部質(zhì)控品 穩(wěn)定性下降所致。（c）漂移：連續(xù)幾次（35次）外部質(zhì)控品的S/CO值都落在均值的一側(cè)則稱(chēng)為漂移，提示實(shí)驗(yàn)條件發(fā)生了較大的變化。（d）趨勢(shì)：連續(xù)幾次（57次）外部質(zhì)控品的S/CO值幾乎按一個(gè)方向分布時(shí)稱(chēng)為趨勢(shì)，通常由參數(shù)的緩慢改變引起。艾滋病實(shí)驗(yàn)室生物安全艾滋病實(shí)驗(yàn)室生物安全一、一、HIV的生物危害的生物危害 第一類(lèi)、第二類(lèi)病原微生物統(tǒng)稱(chēng)為高致病性病原微生物。人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV）屬第二類(lèi)病原微生物，是高致病性病原微生物。二、二、HIV相關(guān)檢測(cè)的

7、生物安全相關(guān)檢測(cè)的生物安全級(jí)別級(jí)別 HIV抗體檢測(cè)應(yīng)在符合級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室（BSL-2）要求的艾滋病檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。三、生物安全保證措施三、生物安全保證措施 1 1、建立安全制度、建立安全制度 艾滋病檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立下列安全制度 (1) 實(shí)驗(yàn)室的安全工作制度或安全標(biāo)準(zhǔn)操作程序（S-SOP）。 (2) 意外事故處理預(yù)案，主要是生物安全意外事故。 (3) 信息安全及保密制度：信息安全及保密制度：（例）（例） 2 2、培訓(xùn)和管理、培訓(xùn)和管理 3 3、個(gè)人保健和防護(hù)、個(gè)人保健和防護(hù) 4 4、安全操作、安全操作 5 5、實(shí)驗(yàn)室的清潔和消毒、實(shí)驗(yàn)室的清潔和消毒 工作完畢應(yīng)對(duì)工作臺(tái)面消毒，推薦用0.10.

8、2%的次氯酸溶液消毒；用消毒液清洗后要干燥20min以上；操作過(guò)程中如有樣品、檢測(cè)試劑外濺，應(yīng)及時(shí)消毒。 如有大量高濃度的傳染性液體濺出，在清潔之前應(yīng)先用1%的次氯酸鈉溶液浸泡，然后戴上手套擦凈。離心樣品時(shí)要使用密閉的罐和密封頭，防止離心時(shí)液體溢出或在超/高速離心時(shí)形成氣溶膠。四、污染物處理四、污染物處理 1 1、艾滋病實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)生的所有廢棄物，包括、艾滋病實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)生的所有廢棄物，包括不再需要的樣品、培養(yǎng)物和其它物品，均不再需要的樣品、培養(yǎng)物和其它物品，均應(yīng)視為感染性廢棄物，應(yīng)置于專(zhuān)用的密封應(yīng)視為感染性廢棄物，應(yīng)置于專(zhuān)用的密封防漏容器中，安全運(yùn)至消毒室，經(jīng)高壓消防漏容器中，安全運(yùn)至消毒室，經(jīng)高壓

9、消毒后再進(jìn)行處理或廢棄。毒后再進(jìn)行處理或廢棄。 2 2、艾滋病檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室常用的消毒方法、艾滋病檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室常用的消毒方法 （1 ） 物理消毒方法 a 高壓蒸汽消毒，121，保持1520min; b 干燥空氣烘箱消毒（干烤消毒），140，保持23h。 （2） 化學(xué)消毒方法 含氯消毒劑（次氯酸鈉，含有效氯20005000mg/L）、75%乙醇、2%戊二醛 （3）艾滋病檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室物品常用的消毒方法 a、廢棄物缸：5000mg/L 次氯酸鈉。 b、生物安全柜工作臺(tái)面和儀器表面：75%乙醇。 c、溢出物：5000mg/L次氯酸鈉。 d、污染的臺(tái)面和器具：2000mg/L 次氯酸鈉,也可以用過(guò)氧化氫或過(guò)氧乙

10、酸。器械可用2%戊二醛消毒。艾滋病檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理艾滋病檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理一、范圍一、范圍 艾滋病檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理包括質(zhì)量保證、質(zhì)量控制和質(zhì)量評(píng)價(jià)二、質(zhì)量保證二、質(zhì)量保證 1 1、人員培訓(xùn)、人員培訓(xùn) 檢測(cè)技術(shù)人員需經(jīng)過(guò)上崗培訓(xùn)和在崗持續(xù)培訓(xùn)。篩查實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員至少每2年1次。 2 2、環(huán)境條件、環(huán)境條件 艾滋病抗體篩查實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置及其建筑、設(shè)施、設(shè)備必須符合全國(guó)艾滋病檢測(cè)工全國(guó)艾滋病檢測(cè)工作管理辦法作管理辦法的要求。HCV，HBV及梅毒等血清學(xué)檢測(cè)在滿足實(shí)驗(yàn)室管理要求和保證生物安全的條件下，可以與HIV檢測(cè)共享空間和設(shè)備，應(yīng)避免交叉污染。 3 3、樣品采集、運(yùn)送和處理、樣品采集、運(yùn)送和處理

11、 4 4、檢測(cè)方法和試劑的選擇、檢測(cè)方法和試劑的選擇 5 5、設(shè)備維護(hù)與校準(zhǔn)、設(shè)備維護(hù)與校準(zhǔn) 6 6、實(shí)驗(yàn)耗材、實(shí)驗(yàn)耗材 7 7、文件和文件管理、文件和文件管理 8 8、標(biāo)準(zhǔn)操作程序、標(biāo)準(zhǔn)操作程序 （SOP） 篩查實(shí)驗(yàn)室SOP文件包括：（1）樣品的接收、登記、處理、保存和運(yùn)輸；（2）檢測(cè)方法和步驟；（3）試劑使用和保存；（4）儀器的使用維護(hù)和校準(zhǔn)；（5）質(zhì)量控制要求及程序；（6）結(jié)果解釋與報(bào)告；（7）保密程序；（8）實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)、相關(guān)文件記錄與保存；（9）不確定樣品追蹤和處理；（10）實(shí)驗(yàn)室安全防護(hù)及實(shí)驗(yàn)室的清理和消毒；（11）標(biāo)題和編號(hào)；（12）編寫(xiě)和修訂日期；（13）編寫(xiě)和修訂人員姓名；（1

12、4）方法、目的和應(yīng)用范圍；（15）檢測(cè)設(shè)備；（16）試劑及有效期；（17）安全防護(hù)相關(guān)步驟；（18）結(jié)果的解釋和報(bào)告；（19）附錄，包括相關(guān)的附加文件如標(biāo)準(zhǔn)表格、設(shè)備和試劑盒說(shuō)明書(shū)等。 9 9 、實(shí)驗(yàn)原始記錄表、實(shí)驗(yàn)原始記錄表（附表附表4） 1010、 結(jié)果報(bào)告結(jié)果報(bào)告 1111、 樣品登記和保存樣品登記和保存三、質(zhì)量控制三、質(zhì)量控制四、質(zhì)量評(píng)價(jià)四、質(zhì)量評(píng)價(jià) 包括內(nèi)部質(zhì)量評(píng)價(jià)和外部質(zhì)量評(píng)價(jià)。 1 1、內(nèi)部質(zhì)量評(píng)價(jià)、內(nèi)部質(zhì)量評(píng)價(jià) 2 2、外部質(zhì)量評(píng)價(jià)、外部質(zhì)量評(píng)價(jià) 篩查實(shí)驗(yàn)室應(yīng)參加省級(jí)職能工作考核和PT。 3 3、職能工作考核、職能工作考核 現(xiàn)場(chǎng)評(píng)價(jià)內(nèi)容，篩查實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)場(chǎng)評(píng)價(jià)應(yīng)包括： 實(shí)驗(yàn)室人員組

13、成及其職責(zé)分工；實(shí)驗(yàn)室分區(qū)、布局、恒溫設(shè)施；儀器設(shè)備及其使用、校準(zhǔn)記錄；質(zhì)量保證文件、實(shí)驗(yàn)室SOP文件及原始記錄；實(shí)驗(yàn)室的安全防護(hù)措施，安全用品及安全規(guī)程；消毒與污物處理方法及設(shè)施；HIV檢測(cè)資料數(shù)據(jù)庫(kù)的建設(shè)、存檔、備份、安全和保密；樣品保存和安全；開(kāi)展的HIV檢測(cè)項(xiàng)目和檢測(cè)試劑等。梅毒、乙肝檢測(cè)要點(diǎn)梅毒、乙肝檢測(cè)要點(diǎn) 一、梅毒螺旋體感染人體后出現(xiàn)兩種抗體，一、梅毒螺旋體感染人體后出現(xiàn)兩種抗體，特異體抗體和非特異性抗體。特異體抗體和非特異性抗體。 特異性抗體特異性抗體(TPHA)：為lgM，這種抗體一旦產(chǎn)生，終身是陽(yáng)性。靈敏度高、特異性強(qiáng) 非特異性抗體（反應(yīng)素非特異性抗體（反應(yīng)素 RPR）：為lgA與lgM的混合物，隨病情發(fā)展而變化?？膳c正常生物組織中的類(lèi)脂抗原發(fā)生非特異性結(jié)合。二、梅毒特異性抗體檢測(cè)二、梅毒特異性抗體檢測(cè)：用于證實(shí)試驗(yàn)，即使患者已經(jīng)經(jīng)過(guò)充分的治療，IgG抗體仍保持陽(yáng)性 所以不能用以觀察療效、復(fù)發(fā)及再感染。方法有方法有：TP-ELISA酶聯(lián)免疫法、TPPA。梅毒非特異性抗體檢測(cè)梅毒非特異性抗體檢測(cè)：用于梅毒診斷療效觀察和對(duì)復(fù)發(fā)或再感染的監(jiān)測(cè)。方法有方法有：性病實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)（又稱(chēng)VDRL試驗(yàn)）