SrDNA鑒定菌株的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

1、16SrDNA鑒定菌株的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程1. 適用范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了通過特定引物對(duì)細(xì)菌的16SrDNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行序列分析比對(duì)，快速獲得細(xì)菌種屬信息的操作規(guī)程。本標(biāo)準(zhǔn)適用于未知細(xì)菌的快速種屬分析，以及為細(xì)菌的生化鑒定提供指導(dǎo)信息。2. 方法和原理16SrDNA鑒定是指用利用細(xì)菌16SrDNA序列測(cè)序的方法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行種屬鑒定。包括細(xì)菌基因組DNA提取、16SrDNA特異引物PCR擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物純化、DNA測(cè)序、序列比對(duì)等步驟。是一種快速獲得細(xì)菌種屬信息的方法。細(xì)菌rRNA（核糖體RNA）按沉降系數(shù)分為3種，分別為5S、16S和23S rRNA。16S rDNA是細(xì)菌染色體上編

2、碼16S rRNA相對(duì)應(yīng)的DNA序列。16S rDNA由于大小適中，約1.5Kb左右，既能體現(xiàn)不同菌屬之間的差異，又能利用測(cè)序技術(shù)較容易地得到其序列，故被細(xì)菌學(xué)家和分類學(xué)家接受。在 16S rRNA 分子中，可變區(qū)序列因細(xì)菌不同而異，恒定區(qū)序列基本保守，所以可利用恒定區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，將16S rDNA片段擴(kuò)增出來，利用可變區(qū)序列的差異來對(duì)不同菌屬、菌種的細(xì)菌進(jìn)行分類鑒定。16SrDNA序列的前500bp序列變化較大，包含有豐富的細(xì)菌種屬的特異性信息，所以對(duì)于絕大多數(shù)菌株來說，只需要第一對(duì)引物測(cè)前500bp序列即可鑒別出細(xì)菌的菌屬。針對(duì)科學(xué)論文發(fā)表或是前500bp無法鑒別的情

3、況，需要進(jìn)行16SrDNA的全序列擴(kuò)增和測(cè)序，得到較為全面的16SrDNA的序列信息。由于測(cè)序儀一次反應(yīng)最多只能測(cè)出700bp的有效序列，為了結(jié)果的可靠性，通常將16SrDNA全長(zhǎng)序列分成3部分進(jìn)行測(cè)序。16SrDNA27F519R357F1115R926F1492R3對(duì)引物正反向測(cè)通后，拼接成1500bp左右的16SrDNA序列。3. 設(shè)備和材料1233.1 器材移液器（1000L、200L 、100L、10L）；渦旋振蕩器；Eppendorf MixMate；離心機(jī)；水浴鍋；電泳儀；制冰機(jī)；低溫冰箱；PCR儀：Veriti 96 Well Thermal Cycler； 凝膠成像儀：Ver

4、saDoc MP 4000；基因分析儀：AB3500、AB31303.2 試劑DNA快速提取試劑：PrepMan Ultra；瓊脂糖；PCR試劑：Taq酶，10×Taq Buffer(Mg2+)，dNTPs，ddH2O等； ExoSAP-IT；測(cè)序試劑：BigDye Terminator，5×Sequencing Buffer；BigDye XTerminator Purification Kit；3.3 耗材移液器吸頭：1000L、200L、10L；離心管：1.5mL、200L；Micro AmpTM Optical 96-Well Reaction Plate；Micr

5、o AmpTM Optical Adhesive Film；3.4 引物16SrDNA名稱序列擴(kuò)增長(zhǎng)度第1部分正向引物27F5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'500 bp左右反向引物519R5'- GWA TTA CCG CGG CKG CTG -3'第2部分正向引物357F5'- CTC CTA CGG GAG GCA GCA G-3'750bp左右反向引物1115R5'-AGG GTT GCG CTC GTT GC-3'第3部分正向引物926F5'- AAA CTY AAA KGA ATT

6、 GAC GG-3'560 bp左右反向引物1492R5'-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3'其中M=C:A, Y=C:T. K=G:T, R=A:G, S=G:C. W=A:T; all 1:1序列比對(duì)測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物純化基因擴(kuò)增核酸提取4. 操作流程5. 實(shí)驗(yàn)方法455.1 核酸提?。禾羧尉洌缓笾糜谘b有100LPrepMan Ultra的離心管中，渦旋震蕩混勻30s左右，然后100水浴10min后，以離心機(jī)最大轉(zhuǎn)速離心3min，取10L上清液與490L ddH2O（即稀釋50倍），混勻作為下步PCR的模板DNA。提取的DNA于-20保

7、存。5.2 基因擴(kuò)增5.2.1 PCR反應(yīng)體系試劑使用量（25L體系）模板DNA2L（10ng100ng）Taq酶(5U/L)0.2L10×Taq Buffer(Mg2+)2.5LdNTPs(各2.5mM)2L引物F(1M)5L引物R(1M)5LddH2O8.3L備注：DNA模板量通常在100 ng以下，必要時(shí)可進(jìn)行梯度稀釋，確定最佳的DNA模板使用量。PCR反應(yīng)體系應(yīng)在冰中配置，然后置于冰箱中冷卻35min，最后放于PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，這種冷啟動(dòng)法可增強(qiáng)PCR擴(kuò)增的特異性。5.2.2 PCR反應(yīng)條件94：10min94：30s30Cyc58：30s72：45s72：5min 4：5

8、.2.3 電泳稱取1g瓊脂糖置于100mL TAE電泳緩沖液中，加熱融化，待溫度降至60左右時(shí)，均勻鋪板，制成1%的瓊脂糖凝膠。PCR反應(yīng)結(jié)束后，加樣，以100V電壓進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)束后，染色，用凝膠成像儀觀察，拍照，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。5.3 產(chǎn)物純化5.3.1 每5LPCR產(chǎn)物加入2L ExoSAP-IT試劑，混勻。5.3.2 放入PCR儀中，37溫育15min, 80溫育15min。5.3.3 純化后的PCR產(chǎn)物做為下一步測(cè)序反應(yīng)的模板。5.4 測(cè)序反應(yīng)5.4.1 測(cè)序反應(yīng)體系試劑使用量（10L體系）模板DNA1L引物 (1M)1.6LBigDye Terminator1L5

9、5;Sequencing Buffer1LddH2O5.4L5.4.2 測(cè)序反應(yīng)條件96：2min96：30s30Cyc55：15s60：4min 4：5.4.3 測(cè)序反應(yīng)純化(BigDye XTerminator Purification Kit)5.4.3.1每管加入27L SAM Solution和6L BigDye XTerminator Solution。5.4.3.2放在Eppendorf MixMate 上2000rpm震蕩30min。5.4.3.3在離心機(jī)上以1000×g離心2min。5.4.3.4每管吸取10L上清液于96孔板中，放入測(cè)序儀中測(cè)序。5.5 序列比對(duì)基

10、因測(cè)序儀得到的測(cè)序結(jié)果，在MicroSEQ微生物鑒定系統(tǒng)中進(jìn)行比對(duì)，得到菌種的種屬信息。6. 關(guān)鍵說明1234566.1 提取細(xì)菌基因組DNA時(shí)，對(duì)于細(xì)胞壁比較薄的革蘭氏陰性細(xì)菌，可挑取一菌環(huán)菌株，置于100L ddH2O 中，混勻，沸水熱變性10min后，離心3min分離，稀釋50倍后做為PCR模板。必要時(shí)做梯度PCR確認(rèn)最佳的模板量。6.2 PCR及測(cè)序反應(yīng)時(shí)，為了保證酶的活性，整個(gè)體系應(yīng)在冰中配置；然后置于低溫冰箱中冷卻35min，最后放于PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，這種冷啟動(dòng)法可增強(qiáng)PCR擴(kuò)增的特異性。6.3 16SrDNA序列的前500bp序列變化較大，包含有豐富的細(xì)菌種屬的特異性信息，所以

11、對(duì)于絕大多數(shù)菌株來說，只需要第一對(duì)引物測(cè)前500bp序列即可鑒別出細(xì)菌的菌屬。針對(duì)科學(xué)論文發(fā)表或是前500bp無法鑒別的情況，需要進(jìn)行16SrDNA的全序列擴(kuò)增和測(cè)序，得到較為全面的16SrDNA的序列信息。具體參照附錄。PCR出現(xiàn)非特異性條帶的原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、 或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶 則不出現(xiàn)，酶量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引 物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次 數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度

12、或采用二溫度點(diǎn)法(93變性，65左右退火與延伸)。 PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量 差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對(duì)策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。 用RT陰性對(duì)照檢測(cè)是否被基因組DNA污染。模板濃度過高10ul體系100ngDNA附錄（資料性附錄）1. 細(xì)菌16SrDNA 三部分的PCR結(jié)果電泳圖321M2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM：DL2000；1：引物27F和519R的PCR產(chǎn)物（第1部分500bp）2：引物357F和1115R的PCR產(chǎn)物（第2部分750bp）3：引物926F和1492R的PCR產(chǎn)物（第3部分560bp）2. 細(xì)菌16SrDNA鑒定結(jié)