食品專業(yè)生化四個(gè)實(shí)驗(yàn)

1、實(shí)驗(yàn)一 凱氏(MicroKjeldahl)定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)凱氏定氮法的原理和操作技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理常用凱氏定氮法測(cè)定天然有機(jī)物(如蛋白質(zhì)、核酸及氨基酸等)的含氮量。含氮的有機(jī)物與濃硫酸共熱時(shí)，其中的碳、氫2元素被氧化成二氧化碳和水，而有機(jī)氮?jiǎng)t轉(zhuǎn)變成氨，并進(jìn)一步與硫酸作用生成硫酸銨。此過(guò)程通常稱為“消化”。但是，這個(gè)反應(yīng)進(jìn)行得比較緩慢，通常需要加入硫酸鉀或硫酸鈉以提高反應(yīng)液的沸點(diǎn)，加快有機(jī)物分解，并加入硫酸銅作為催化劑，以促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行，還具有作為消化終點(diǎn)和下一步蒸餾時(shí)堿性反應(yīng)的指示劑。甘氨酸的消化過(guò)程可表示如下：消化：CH2NH2C00H + 3H2S02 2C02+ 3S

2、02+ 4H20 + NH32NH3+H2S04 一 (NH4)2SO4蒸餾：(NH4)2SO4 + 2NaOH- 2H2O +NaSO4 + 2NH3吸收：2NH3 + 4H3BO3 - (NH4)2B4O7 + 5H20滴定：(NH4)2B4O7 + 2HCl + 5H20- 2 NH4Cl + 4H3BO3濃堿可使消化液中的硫酸銨分解，游離出氨，借水蒸汽將產(chǎn)生的氨蒸餾到一定量、一定濃度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中的氫離子濃度降低，然后用標(biāo)準(zhǔn)無(wú)機(jī)酸滴定，直至恢復(fù)溶液中原來(lái)的氫離子濃度為止，最后根據(jù)所用標(biāo)準(zhǔn)酸的摩爾數(shù)(相當(dāng)于待測(cè)物中氨的摩爾數(shù))計(jì)算出待測(cè)物中的總氮量。三、器材150 m

3、L消化管或100 2凱氏定氮蒸餾裝置或改mL凱氏燒瓶 進(jìn)型凱氏定氮儀350 mL容量瓶 43 mL微量滴定管5分析天甲 6烘箱7電爐 81 000 mL蒸餾燒瓶9小玻璃珠 10遠(yuǎn)紅外消煮爐四、試劑1消化液(過(guò)氧化氫：濃硫酸：水=3：2：1) 200mL2粉末硫酸鉀一硫酸銅混合物 16gK2SO4與CuS04.5H20以3：1配比研磨混合。330氫氧化鈉溶液 1000mL42硼酸溶液 500mL5標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液(約001 molL) 600mL6混合指示劑(田氏指示劑) 50mL由50mL 0.1甲烯藍(lán)乙醇溶液與200mL 01甲基紅乙醇溶液混合配成，貯于棕色瓶中備用。這種指示劑酸性時(shí)為紫紅色，堿

4、性時(shí)為綠色。變色范圍很窄且靈敏。7市售標(biāo)準(zhǔn)面粉和富強(qiáng)粉各2g五、操作方法1凱氏定氮儀的構(gòu)造和安裝 凱氏定氮儀由蒸汽發(fā)生器、反應(yīng)管及冷凝器3部分組成。蒸汽發(fā)生器包括電爐及一個(gè)1-2L（升）容積的燒瓶。蒸汽發(fā)生器借橡皮管與反應(yīng)管相連，反應(yīng)管上端有一個(gè)玻璃杯，其上端通過(guò)反應(yīng)室外層與蒸汽發(fā)生器相連，下端靠近反應(yīng)室的底部。反應(yīng)室外層下端有一開(kāi)口，上有一皮管夾，由此可放出冷凝水及反應(yīng)廢液。反應(yīng)產(chǎn)生的氨可通過(guò)反應(yīng)室上端細(xì)管及冷凝器通到吸收瓶中，反應(yīng)管及冷凝器之間借磨口連接起來(lái)，防止漏氣。安裝儀器時(shí)，先將冷凝器垂直地固定在鐵支臺(tái)上，冷凝器下端不要距離實(shí)驗(yàn)臺(tái)太近，以免放不下吸收瓶。然后將反應(yīng)管通過(guò)磨口連接與冷凝

5、器相連，根據(jù)儀器本身的角度將反應(yīng)管固定在另一鐵支臺(tái)上。這一點(diǎn)務(wù)須注意，否則容易引起氨的散失及反應(yīng)室上端彎管折斷。然后將蒸汽發(fā)生器放在電爐上，并用橡皮管把蒸汽發(fā)生器與反應(yīng)管連接起來(lái)。安裝完畢后，不得輕易移動(dòng)，以免儀器損壞。2樣品處理某一固體樣品中的含氮量是用lOOg該物質(zhì)(于重)中所含氮的g數(shù)來(lái)表示()。因此在定氮前，應(yīng)先將固體樣品中的水分除掉。一般樣品烘干的溫度都采用105，因?yàn)榉怯坞x的水都不能在100以下烘干。在稱量瓶中稱入一定量磨細(xì)的樣品，然后置于105的烘箱內(nèi)干燥4小時(shí)。用坩堝鉗將稱量瓶放入干燥器內(nèi)，待降至室溫后稱重，按上述操作繼續(xù)烘干樣品。每干燥1小時(shí)后，稱重一次，直到兩次稱量數(shù)值不變

6、，即達(dá)恒重。若樣品為液體(如血清等)，可取一定體積樣品直接消化測(cè)定。精確稱取O 1 g左右的干燥面粉作為本實(shí)驗(yàn)的樣品。3消化 取4個(gè)100mL凱氏燒瓶或50mL消化管并標(biāo)號(hào)。各加1顆玻璃珠，在l及2號(hào)瓶中各加樣品，催化劑(K2S04一CuS04·5HO)200 mg，消化液5 mL。注意加樣品時(shí)應(yīng)直接送人瓶底，而不要沾在瓶口和瓶頸上。在3及4號(hào)瓶中各加0.1 mL蒸餾水和與1及2號(hào)瓶相同量的催化劑和濃硫酸，作為對(duì)照，用以測(cè)定試劑中可能含有的微量含氮物質(zhì)。每個(gè)瓶口放一漏斗，在通風(fēng)櫥內(nèi)的電爐上消化。在消化開(kāi)始時(shí)應(yīng)控制火力，不要使液體沖到瓶頸。待瓶?jī)?nèi)水汽蒸完，硫酸開(kāi)始分解并放出,S02白煙

7、后，適當(dāng)加強(qiáng)火力，繼續(xù)消化，直至消化液呈透明淡綠色為止。消化完畢，等燒瓶中溶物冷卻后，加蒸餾水10 mL(注意慢加，隨加隨搖)。冷卻后將瓶中溶物傾入50 mL的容量瓶中，并以蒸餾水洗燒瓶數(shù)次，將洗液并人量瓶。用水稀釋到刻度，混勻備用。4蒸餾(1)蒸餾器的洗滌 蒸汽發(fā)生器中盛有用幾滴硫酸酸化的蒸餾水。關(guān)閉皮管夾，將蒸汽發(fā)生器中的水燒開(kāi)，讓蒸汽通過(guò)整個(gè)儀器。約15分鐘后，在冷凝器下端放一個(gè)盛有5mL2硼酸溶液和12滴指示劑混合液的錐形瓶。位置傾斜如圖所示，冷凝器下端應(yīng)完全浸沒(méi)在液體中，繼續(xù)蒸汽洗滌12分鐘，觀察錐形瓶?jī)?nèi)的溶液是否變色，如不變色則證明蒸餾裝置內(nèi)部已洗滌干凈。向下移動(dòng)錐形瓶，使硼酸液面

8、離開(kāi)冷凝管口約1 cm，繼續(xù)通蒸汽1分鐘。用水沖洗冷凝管口后用手捏緊橡皮管。此時(shí)由于反應(yīng)室外層蒸汽冷縮，壓力減低，反應(yīng)室內(nèi)凝結(jié)的水可自動(dòng)吸出進(jìn)入反應(yīng)室外層。最后打開(kāi)皮管夾，將廢水排出。(2)蒸餾取50mL錐形瓶數(shù)個(gè)，各加5mL硼酸和12滴指示劑，溶液呈紫色，用表面皿覆蓋備用。用吸管取10 mL消化液，細(xì)心地由蒸餾器小玻杯注入反應(yīng)室，塞緊棒狀玻塞。將一個(gè)含有硼酸和指示劑的錐形瓶放在冷凝器下，使冷凝器F端浸沒(méi)在液體內(nèi)。用量筒取30的氫氧化鈉溶液10 mL放人小玻璃杯，輕提棒狀玻璃塞使之流人反應(yīng)室(為了防止冷凝管倒吸，液體流入反應(yīng)室必須緩慢)。尚未完全流入時(shí)，將玻璃塞蓋緊，向玻璃杯中加入蒸餾水約5

9、mL。再輕提玻璃塞，使一半蒸餾水慢慢流人反應(yīng)室，一半留在玻璃杯中作水封。加熱水蒸汽發(fā)生器，沸騰后夾緊皮管夾，開(kāi)始蒸餾。此時(shí)錐形瓶中的酸溶液由紫色變成綠色。自變色時(shí)起記時(shí)，蒸餾35分鐘。移動(dòng)錐形瓶，使硼酸液面離開(kāi)冷凝管約1 cm，并用少量蒸餾水洗滌冷凝管口外面。繼續(xù)蒸餾1分鐘，移開(kāi)錐形瓶，用表面皿覆蓋錐形瓶。蒸餾完畢后，須將反應(yīng)室洗滌干凈。在小玻璃杯中倒人蒸餾水，待蒸汽很足、反應(yīng)室外層溫度很高時(shí)，一手輕提棒狀玻璃塞使冷水流人反應(yīng)室，同時(shí)立即用另一只手捏緊橡皮管。則反應(yīng)室外層內(nèi)蒸汽冷縮，可將反應(yīng)室中殘液自動(dòng)吸出，再用蒸餾水自玻璃杯倒入反應(yīng)室，重復(fù)上述操作。如此沖洗兒次后，將皮管夾打開(kāi)，將反應(yīng)室外層

10、中廢液排出。再繼續(xù)下一個(gè)蒸餾操作。待樣品和空白消化液均蒸餾完畢后，同時(shí)進(jìn)行滴定。(3)滴定 全部蒸餾完畢后，用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液滴定各錐形瓶中收集的氨量，硼酸指示劑溶液由綠變淡紫色為滴定終點(diǎn)。六、計(jì)算 式中：C 為標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液摩爾濃度；V1 滴定樣品用去的鹽酸溶液平均mL數(shù)；V2 滴定空白消化液用去的鹽酸溶液平均mL數(shù)；W 為樣品重量(g)。14 為氮的相對(duì)量子質(zhì)量。若測(cè)定的樣品含氮部分只是蛋白質(zhì)，則，樣品中蛋白質(zhì)含量()=總氮量×6.25若樣品中除有蛋白質(zhì)外，尚有其他含氮物質(zhì)，則需向樣品中加入三氯乙酸，然后測(cè)定未加三氯乙酸的樣品及加入三氯乙酸后樣品上清液中的含氮量，得出非蛋白氮及總氮量，

11、從而計(jì)算出蛋白氮，再進(jìn)一步算出蛋白質(zhì)含量。蛋白氮：總氮一非蛋白氮蛋白質(zhì)含量(g)=蛋白氮×6.25七、思考題1.何為消化？如何判斷消化終點(diǎn)？2.在實(shí)驗(yàn)中加入H2SO4 、 K2SO4 、CuSO4各有什么作用？3.蒸餾時(shí)冷凝管下端為什么要浸沒(méi)在液體中？4.如何證明蒸餾器洗滌干凈？5.固體樣品為什么要烘干？實(shí)驗(yàn)二 酪蛋白的制備一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)從牛乳中制備酪蛋白的原理和方法。二、實(shí)驗(yàn)原理牛乳中主要的蛋白質(zhì)是酪蛋白，含量約為35 gL。酪蛋白是一些含磷蛋白質(zhì)的混合物，等電點(diǎn)為4.7。利用等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低的原理，將牛乳的pH凋至4.7 時(shí)，酪蛋白就沉淀出來(lái)。用乙醇洗滌沉淀物，除去脂類雜質(zhì)后

12、便可得到純的酪蛋白。三、器材1. 離心機(jī) 2. 抽濾裝置3. 精密pH試紙或酸度計(jì) 4. 電爐5. 燒杯 6. 溫度計(jì)四、試劑與材料1. 牛奶 2500 mL2. 95乙醇 1200mL3. 無(wú)水乙醚 1200 mL4. 0.2 molL pH 4.7 醋酸一醋酸鈉緩沖液 3000 mL先配制A液與B液。A液：0.2 molL 醋酸鈉溶液 稱NaAc.3H20 54.44 g，定容至2 000mL。B液：0.2 molL 醋酸溶液 稱優(yōu)級(jí)純醋酸(含量大于99.8) 12.0 g 定容至1000 mL。取A液1770 mL，B液1230 mL混合即得 pH4.7 的醋酸一醋酸鈉緩沖液 3000

13、mL。5. 乙醇一乙醚混合液 2 000mL乙醇：乙醚=1：l (VV)五、操作方法1. 將100 mL牛奶加熱至40。在攪拌下慢慢加入預(yù)熱至40、pH 47的醋酸緩沖液100 mL。用精密pH試紙或酸度計(jì)調(diào)pH至4.7。將上述懸浮液冷卻至室溫。離心15分鐘(3 000 rmin)。棄去清液，得酪蛋白粗制品。2. 用水洗沉淀2次，離心10分鐘(3 000rmin)，棄去上清液。3. 在沉淀中加入30 mL乙醇，攪拌片刻，將全部懸濁液轉(zhuǎn)移至布氏漏斗中抽濾。用乙醇一乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。4. 將沉淀攤開(kāi)在表面皿上，風(fēng)干；得酪蛋白純品。5. 準(zhǔn)確稱重，計(jì)算含量和得率。含量

14、：酪蛋白g100 mL牛乳(g) 得率： ×100 式中：理論含量為35 g100mL牛乳。六、思考題1.用乙醇、乙醚洗滌沉淀的目的是什么？2.總結(jié)本次實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟。 實(shí)驗(yàn)三 酵母RNA的分離及組分鑒定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解核酸的組分，并掌握鑒定核酸組分的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理酵母核酸中RNA含量較多。由于R N A的來(lái)源和種類很多，因而提取制備方法也各異。一般有苯酚法、去污劑法和鹽酸胍法。其中苯酚法又是實(shí)驗(yàn)室最常用的，即將組織勻漿用苯酚處理并離心后，R NA 即溶于上層被酚飽和的水相中，DNA和蛋白質(zhì)則留在酚層中，向水層加入乙醇后，RNA即以白色絮狀沉淀析出，此法能較好地除去DNA和蛋白

15、質(zhì)。上述方法提取的RNA具有生物活性。工業(yè)上常用稀堿法和濃鹽法提取RNA，用這2種方法所提取的核酸均為變性的RNA,，主要用作制備核苷酸的原料，其工藝比較簡(jiǎn)單。濃鹽法是用l 0左右氯化鈉溶液，90提取34 h，迅速冷卻，提取液經(jīng)離心后，上清液用乙醇沉淀R N A。RNA可溶于堿性溶液，在堿提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。核糖核酸含有核糖、嘌呤堿、嘧啶堿和磷酸各組分。加硫酸煮沸可使其水解，從水解液中可以測(cè)出上述組分的存在。三、器材1. 乳缽 2. 150mL錐形瓶3. 水浴 4. 量筒5. 布氏漏斗及抽濾瓶 6. 吸管7. 滴管 8. 試管及試管架9.

16、 燒杯 10. 離心機(jī)11. 漏斗四、試劑和材料1.0.04 molL氫氧化鈉溶液 1000 mL2. 酸性乙醇溶液 500mL將0.3 mL濃鹽酸加入30 mL乙醇中。3. 95乙醇 1000mL4. 乙醚 500 mL5. 1.5 molL硫酸溶液 200 mL6. 濃氨水 50 mL7. 0.1 molL硝酸銀溶液 50 mL8. 三氯化鐵濃鹽酸溶液 80 mL將2 mL 10三氯化鐵溶液(用FeCl3·6H20配制)加入到400 mL濃鹽酸中。9. 苔黑酚乙醇溶液 10mL溶解6 g苔黑酚于100mL 95乙醇中(可在冰箱中保存1個(gè)月)。10. 定磷試劑 50mL(1)17硫

17、酸溶液： 將17 mL濃硫酸(比重1.84)緩緩加入到83mL水中。(2)2.5鉬酸銨溶液： 將2.5 g鉬酸銨溶于100 mL水中。(3)10抗壞血酸溶液： 10 g抗壞血酸溶于100 mL水中，貯棕色瓶保存。溶液呈淡黃色時(shí)可用，如呈深黃或棕色則失效，需純化抗壞血酸。臨用時(shí)將上述3種溶液與水按如下比例混合。17硫酸溶液：2.5鉬酸銨溶液：10抗壞血酸溶液：水=1：1：1：2(VV)。11. 酵母粉 200 g五、操作方法將15 g酵母懸浮于90 mL 0.04molL氫氧化鈉溶液中，并在乳缽中研磨均勻。將懸浮液轉(zhuǎn)移至200毫升燒杯中。在沸水浴上加熱30分鐘后，冷卻。離心(3 000 rmin

18、)15分鐘，將上清液緩緩傾人30 mL酸性乙醇溶液中。注意要一邊攪拌一邊緩緩傾人。待核糖核酸沉淀完全后，離心(3000 rmin)3分鐘。棄去清液。用95乙醇洗滌沉淀兩次，乙醚洗滌沉淀一次后，再用乙醚將沉淀轉(zhuǎn)移至布氏漏斗中抽濾。沉淀可在空氣中干燥。取200 mg提取的核酸，加入1.5moIL硫酸溶液10 mL在沸水浴中加熱10分鐘制成水解液并進(jìn)行組分的鑒定。1. 嘌呤堿 取水解液1 mL加入2 mL濃氨水，然后加入約1 mL 0.1 molL硝酸銀溶液，觀察有無(wú)嘌呤堿的銀化合物沉淀。2. 核糖 取1支試管加入水解液1 mL、三氯化鐵濃鹽酸溶液2 mL和苔黑酚乙醇溶液0.2 mL。放沸水浴中10

19、分鐘。注意溶液是否變成綠色，說(shuō)明核糖的存在。3. 磷酸 取1支試管，加入水解液l mL和定磷試劑1 mL。在水浴中加熱，觀察溶液是否變成藍(lán)色，說(shuō)明磷酸是否存在。六、思考題1. 比較RNA提取的不同方法的原理及區(qū)別。2. 本實(shí)驗(yàn)RNA組分是什么？怎樣驗(yàn)證的？ 實(shí)驗(yàn)四聚丙烯酰胺凝膠電泳分離過(guò)氧化物同工酶一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.學(xué)習(xí)聚丙烯酰胺凝膠電泳原理。2.掌握聚丙烯酰胺凝膠垂直板（及盤狀）電泳的操作技術(shù)。3.掌握同工酶定義、理化性質(zhì)的差異，了解過(guò)氧化物酶的染色原理。4.掌握過(guò)氧化物酶的活性的測(cè)定。二、實(shí)驗(yàn)原理 聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺（Acr）和交聯(lián)劑（即共聚體的N,N甲叉雙丙烯酰胺Bis）在加速

20、劑（N,N,N,N四甲基乙二胺簡(jiǎn)稱TEMED）和催化劑（過(guò)硫酸胺 (NH4)2S2O8 簡(jiǎn)稱AP）的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。（一）聚丙烯酰胺凝膠聚合原理及相關(guān)特性1.聚合反應(yīng)聚丙烯酰胺是由Acr和Bis在催化劑（AP）或核黃素（C17H20O6N4）和加速劑（TEMED）的作用下聚合而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。催化劑和加速劑的種類很多，目前常用的有兩種催化體系：AP-TEMED 屬化學(xué)聚合作用核黃素TEMED 屬光聚合作用2.凝膠孔徑的可調(diào)性及其相關(guān)性質(zhì)凝膠性能與總濃度及交聯(lián)度的關(guān)系凝膠的孔徑、機(jī)械性能、彈性、透明度、粘度和聚合程度取決于凝膠總濃度和Acr與Bis之比：設(shè)T(Acr和Bis

21、總濃度) = · 100()c(交聯(lián)劑百分比) = · 100()式中：a=Acr克數(shù)；b=Bis克數(shù)；m=緩沖溶液體積(mL)。a:b<10 脆硬乳白 a:b>100糊狀易斷凝膠濃度與孔徑的關(guān)系T（Acr和Bis總濃度）增加，孔徑減小，移動(dòng)顆粒穿過(guò)網(wǎng)孔阻力增加；反之T（Acr和Bis總濃度）減小，孔徑增大，移動(dòng)顆粒穿過(guò)網(wǎng)孔阻力減??；凝膠濃度與被分離物分子量的關(guān)系分子量增加，阻力增加，移動(dòng)速度減慢。同時(shí)還與分子形狀及分子電荷有關(guān)系。在操作時(shí)，可以選用凝膠。因?yàn)樯矬w內(nèi)大多數(shù)蛋白質(zhì)在此范圍內(nèi)電泳均可取得滿意的結(jié)果。3.試劑對(duì)凝膠聚合的影響水中金屬離子或其他成分對(duì)凝

22、膠電泳的電泳速度、分離效果等有影響。（二）聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）原理根據(jù)有無(wú)濃縮效應(yīng)可分為：連續(xù)系統(tǒng)：電泳體系中由于緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場(chǎng)中主要靠電荷及分子篩效應(yīng)。不連續(xù)系統(tǒng)：電泳體系中由于緩沖液離子成分、pH、凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)不僅有電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)，還有濃縮效應(yīng)。因而其分離帶清晰度及分辨率高。垂直板電泳：凝膠是在兩塊間距幾毫米的平行玻璃板中聚合。圓盤電泳：凝膠是在玻璃管中聚合，樣品分離區(qū)帶染色后呈圓盤狀。（三）過(guò)氧化物酶染色原理過(guò)氧化物酶催化過(guò)氧化氫釋放活性氧，進(jìn)一步氧化聯(lián)苯胺使之由藍(lán)色變?yōu)楹稚?。屬于活性染色，若酶失活，則不能

23、變色。（四）過(guò)氧化物酶活性的測(cè)定原理過(guò)氧化物酶廣泛分布于植物的各個(gè)組織器官中。在有過(guò)氧化氫存在下過(guò)氧化物酶能使愈創(chuàng)木酚氧化生成褐色物質(zhì)，可用分光光度計(jì)測(cè)量生成物的含量，以每分鐘吸光度變化值表示酶活性大小，即以A470/min.mg蛋白質(zhì)（或鮮重g）表示三、實(shí)驗(yàn)器材1. 電泳儀（600V），盤狀電泳槽，垂直板電泳槽2. 電泳玻璃管（用堿性較低的玻璃管），內(nèi)徑57mm，長(zhǎng)80100mm3. 玻璃架4. 微量注射器或微量吸管5. 帶長(zhǎng)針頭的注射器6. 日光燈7. 帶有玻璃珠或玻璃棒的一小段乳膠管四、試劑和材料1. 貯液和工作溶液的配制貯液及工作溶液的配制 貯液 100 mL溶液中的含量 pH 工作溶

24、液混合比1 lmolL鹽酸 48.0 mL小孔凝膠(分離膠) 1Tris 36.6g 8. 9l份1號(hào)貯液TEMED 0.23 mL2份2號(hào)貯液 2Acr 28.0 gl份水Bis 0.753 g4份3號(hào)貯液 3過(guò)硫酸銨 0.14 gpH8. 9，凝膠濃度7l molL鹽酸 約48 mL大孔凝膠Tris 5. 98 g 6.7(濃縮膠、樣品膠)TEMED 0.46 mL1份4號(hào)貯液 5 Acr 10.0 g2份5號(hào)貯液 Bis 2. 5 gl份6號(hào)貯液 6核黃素 4.0 mL4份7號(hào)貯液 7蔗糖 40.0 gpH6.7凝膠濃度2. 5續(xù)表貯液 100 mL溶液中的含量 pH 工作溶液混合比 電

25、極緩沖液 Tris 6.0g 甘氨酸 28. 8 g 加水到 l 000mL 8.3 用時(shí)稀釋10倍貯液放冰箱中一般可保存1-2月，3號(hào)貯液只能保存一周。如有不溶物要過(guò)濾。表中試劑：Acr一丙烯酰胺；Bis-甲叉雙丙烯酰胺;TEMED一 四甲基乙二胺；Tris 一三羥甲基氨基甲烷。2. 染色液的配制A液：稱取0.4g聯(lián)苯胺，加入mL冰醋酸，溶解后加入17mL蒸餾水隨用隨配B液：4 NH4ClC液：5EDTA(pH6.0)D液：0.3 H2O2按A：B：C：D：H2O1：1：1：1：比例配制3. 測(cè)酶活力所需試劑20mmol/L KH2PO4 ，30 H2O2 ， 愈創(chuàng)木酚，100mmol/Ll

26、磷酸緩沖液（pH=6.0）反應(yīng)混合液：100mmol/L磷酸緩沖液（pH=6.0）50mL于燒杯中，加入愈創(chuàng)木酚28L于磁力攪拌器上加熱攪拌，直至愈創(chuàng)木酚溶解。冷卻后加入30H2O2 19L混合均勻保存于冰箱中。4. 酶液的制備（）材料：萌發(fā)天的高粱玉米小麥種子（）步驟：稱取不同植物材料幼苗莖部2g加入20mmol/LKH2PO4 20mL于研缽中研磨成勻漿，以4000r/min 離心15min。傾出上清液，測(cè)出總體積,置于冷處。五操作方法1. 過(guò)氧化物酶活力的測(cè)定取只光徑1cm的比色皿，只中加入反應(yīng)混合液mL、KH2PO41mL 作為校零對(duì)照，另一只加入反應(yīng)混合液mL、酶提取液mL，立即開(kāi)啟

27、，秒表記時(shí)，于分光光度計(jì)上測(cè)量吸光值（= 470nm）。每隔一分鐘計(jì)數(shù)一次，連續(xù)測(cè)定3min。（吸光值控制在0.1 0.7范圍內(nèi)）三分鐘內(nèi)吸光值的變化：（A470= ）酶活力（A470/min. 鮮重g） = 式中：A470- 三分鐘內(nèi)吸光值的變化 V酶- 酶提取液用量 mL V總- 酶提取液總體積 mL m - 植物材料鮮重 g N - 酶提取液稀釋倍數(shù)2. 凝膠的制備（）分離膠的制備：（小孔徑凝膠）pH8.9凝膠濃度7將貯液按號(hào)：號(hào)：水：號(hào)5mL：10mL：5mL：20mL比例混勻。用尖頭的吸管快速加入玻璃管中（或兩層玻璃板之間），高度約3/4。沿壁加入35mm蒸餾水用于隔絕空氣，使膠面平

28、整。靜置3060min完成聚合，用濾紙吸去水分。（）濃縮膠制備：（大孔徑凝膠）pH6.7凝膠濃度2.5將貯液按4號(hào)：5號(hào)：6號(hào)：7號(hào)mL：6mL：3mL：12mL比例混勻，按上述方法加到分離膠上方距離管上緣0.5cm處（或兩層玻璃板之間，距離短玻璃板上緣0.2cm處,放上樣品槽模板）。仔細(xì)加入水層，在距管口10cm處用日光燈照射進(jìn)行光聚合。照射67min凝膠由淡黃變?yōu)槿榘住?0min完全聚合，在室溫下放置3060min。取出樣品槽模板，用濾紙吸去多余液體。在電泳槽上下槽中加入稀釋10倍的pH8.3電板緩沖液并沒(méi)過(guò)玻璃管頂端（或沒(méi)過(guò)短玻璃板）。（）加樣酶提取液：40蔗糖：，加2滴1溴藍(lán)指示劑，混

29、勻。用微量加樣器取0（或15）樣品混合液，通過(guò)緩沖液，小心加到玻璃管中（或樣品凹槽底部）。（）電泳接通電源，調(diào)節(jié)電壓，開(kāi)始為150V，待樣品進(jìn)入分離膠調(diào)整至300V。當(dāng)指示劑遷移至距下緣cm時(shí)，停止電泳，關(guān)閉電源。（）染色取出膠條（膠板），于染色液中染色20min，酶帶顯藍(lán)色，漂洗后顯褐色。六、思考題1. 簡(jiǎn)述聚丙烯酰胺凝膠聚合的原理，如何調(diào)節(jié)凝膠的孔徑？2. 為什么樣品會(huì)在濃縮膠中壓縮成層？3. 為什么要在樣中加入少許溴酚藍(lán)和蔗糖？各有什么作用？4. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程的體會(huì)總結(jié)如何做好聚丙烯酰胺凝膠電泳，哪些是關(guān)鍵步驟？ 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)是根據(jù)被分離物質(zhì)所帶的電荷

30、多少及其分子大小、形狀的不同，在電場(chǎng)的作用下，產(chǎn)生不同的移動(dòng)速度而分離的方法。它具有電泳和分子篩的雙重作用。1聚丙烯酰胺的聚合丙烯酰胺單體和交聯(lián)劑N1N一亞甲基雙丙烯酰胺在催化劑的作用下聚合成含有酰胺基側(cè)鏈的脂肪族長(zhǎng)鏈。相鄰的兩個(gè)鏈通過(guò)亞甲基橋交聯(lián)起來(lái)就形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的聚丙烯酰胺凝膠。丙烯酰胺(簡(jiǎn)稱為Acr)： N,N一亞甲基雙丙烯酰胺(簡(jiǎn)稱為Bis)：常用的催化劑(包括催化劑和加速劑)有以下兩種：(1)過(guò)硫酸銨TEMED(四甲基乙二胺)系統(tǒng) 在Act和Bis的溶液中放人這個(gè)催化系統(tǒng)后，過(guò)硫酸銨(NH4)2S208產(chǎn)生出游離氧原子使單體成為具有游離基的狀態(tài)，從而發(fā)生聚合作用。聚合的初速度和過(guò)

31、硫酸銨濃度的平方根成正比。這種催化系統(tǒng)需要在堿性條件下進(jìn)行。例如，在pH 88條件下7的丙烯酰胺溶液30分鐘就能聚合完畢；在pH 43時(shí)聚合很慢，要90分鐘才能完成。溫度與聚合的快慢成正比。通常在室溫下就很快聚合，溫度升高聚合更快。如將混合后的凝膠溶液放在近0的地方，就能延緩聚合。一般來(lái)講，溫度過(guò)低，有氧分子或不純物質(zhì)存在時(shí)都能延緩凝膠的聚合。為了防止溶液中氣泡含有氧分子而妨礙聚合，在聚合前須將溶液分別抽氣，然后再混合。(2)核黃素一TEMED系統(tǒng) 這是一個(gè)光激發(fā)的催化反應(yīng)。核黃素在光照下分解，黃素被還原成無(wú)色型，但在有氧條件下，無(wú)色型又被氧化成有游離基的黃素環(huán)，使聚合作用開(kāi)始。核黃素催化系統(tǒng)

32、的優(yōu)點(diǎn)是：用量極少(1 mg100 mL)，對(duì)所分析的樣品沒(méi)有任何影響；聚合作用所用的時(shí)間可以自由控制，變化光照時(shí)間、強(qiáng)度，可使聚合延緩或加速。而過(guò)硫酸銨一TEMED系統(tǒng)的聚合作用所需的時(shí)間除了取決于溫度、pH及有氧分子或不純物質(zhì)的存在外，還取決于它們的濃度。為了使分析的結(jié)果重復(fù)性高，核黃素催化系統(tǒng)的光照時(shí)間和強(qiáng)度最好標(biāo)準(zhǔn)化。凝膠的機(jī)械強(qiáng)度和彈性是很重要的。凝膠的軟硬、透明度、粘著度都會(huì)直接影響分離的效果。凝膠的機(jī)械性能、彈性、透明度和粘著度都取決于凝膠總濃度和Acr與Bis兩者之比。設(shè)T(Acr和Bis總濃度) = · 100()c(交聯(lián)劑百分比) = · 100()式中

33、：a=Acr克數(shù)；b=Bis克數(shù)；m=緩沖溶液體積(mL)。其中a ：b(ww)是很關(guān)鍵的。當(dāng)a ：b<10時(shí)，凝膠變脆、變硬、呈乳白色；a ：b>100時(shí)，5的凝膠呈糊狀，也易斷裂。欲制備完全透明而又有彈性的凝膠，應(yīng)控制a ：b=30左右。不同濃度的單體對(duì)凝膠性質(zhì)也有影響，發(fā)現(xiàn)Acr低于2，Bis在0.5以下就不能聚合了。當(dāng)增加Acr濃度時(shí)要適當(dāng)降低Bis的濃度。通常T為25時(shí)，a ：b=20左右；T為510，a ：b = 40左右；T為1520時(shí)，a ：b=125200。用于研究大分子核酸的凝膠多為T=2 4的大孔徑凝膠，因?yàn)樘洸灰撞僮?，最好加?5瓊脂糖。有的在3凝膠中加入

34、20蔗糖也可增加其機(jī)械強(qiáng)度而不影響其孔徑大小。至于粘著度，一般說(shuō)來(lái)只要容器內(nèi)壁干凈，單體濃度適中，凝膠與器壁粘著情況令人滿意，不會(huì)出現(xiàn)樣品滲漏。新制備的凝膠與器壁附著力較大，隨存放時(shí)間的延長(zhǎng)附著力降低有時(shí)在電泳結(jié)束時(shí)一部分膠柱就可能從管壁上滑脫出來(lái)。2聚丙烯酰胺凝膠的孔徑 聚丙烯酰胺凝膠在電泳中不僅有防止對(duì)流，減低擴(kuò)散的能力，而且還具有分子篩的作用，這是因?yàn)榫郾０纺z是一個(gè)三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。某一個(gè)分子通過(guò)這種網(wǎng)孔的能力顯然取決于凝膠孔徑的大小和形狀，也取決于被分離物質(zhì)的大小和形狀。因此，當(dāng)所分離的物質(zhì)不變時(shí)，凝膠越濃，孔徑越小，所受阻力也就越大。推算凝膠孔徑的幾種方法：(1) 式中：為孔徑

35、的平均直徑；c為多聚體濃度；d為多聚體分子直徑，若不是卷曲的分子應(yīng)為0.5 nm；K為常數(shù)，取決于凝膠的幾何構(gòu)型。假若多聚體的鏈?zhǔn)且越苯墙宦?lián)的，則約為1.5以5凝膠為例可計(jì)算出其孔徑平均直徑為3.8 nm。這樣的計(jì)算是粗略的，與實(shí)際情況尚有一定的距離。(2)有人計(jì)算7.5凝膠孔徑的平均直徑為5nm30的為2 nn左右。(3)有人利用顆粒狀聚丙烯酰胺凝膠做色層分析，測(cè)定了總濃度(T)為6.520的丙烯酰胺凝膠液在6種不同比例的雙丙烯酰胺存在時(shí)聚合后的孔徑大小。結(jié)果見(jiàn)圖44。從圖上可以看出，孔徑的大小在很大程度上取決于兩者的總濃度(T)。T值增大，孔徑相應(yīng)變小，機(jī)械強(qiáng)度增強(qiáng)。值得注意的是當(dāng)T值不

36、變時(shí)，Bis濃度在5時(shí)孔徑最小，高于或低于5孔徑卻相應(yīng)變大。因此就可能有這樣的現(xiàn)象出現(xiàn)：當(dāng)Bis濃度在5以上或以下時(shí)，盡管T值很大，但卻比T值小而B(niǎo)is為5時(shí)的孔徑要大。分離蛋白質(zhì)的實(shí)踐證明，膠的孔徑大約是蛋白質(zhì)分子平均大小的一半時(shí)分析結(jié)果較好。例如，肌紅蛋白和細(xì)胞色素分子的半徑為2 nm，那么可選擇平均膠孔半徑為1 nm的凝膠濃度(可參考圖44)。因此，在實(shí)用中常按樣品的相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)大小來(lái)選擇適宜的凝膠孔徑，如表42。表42不同相對(duì)分子質(zhì)量(M，)范圍所選用的凝膠濃度百分率 物質(zhì) 相對(duì)分子質(zhì)量(M，)范圍 適用的凝膠濃度 蛋 白 質(zhì) <104 l4×104 4

37、5;1041×105 15×105 >5 ×105 20-30 1520 1015 5-10 25 核 酸 (RNA) <104 104 105 105×106 15-20 510 22.6常用的所謂標(biāo)準(zhǔn)膠是指濃度為7.5的凝膠，大多數(shù)生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)在此膠中電泳都能得到滿意的結(jié)果。當(dāng)分析一個(gè)未知樣品時(shí)，常常先用7.5的標(biāo)準(zhǔn)凝膠或用410的凝膠梯度來(lái)試測(cè)，選出適宜的凝膠濃度。3緩沖系統(tǒng)的選擇 在選擇緩沖系統(tǒng)時(shí)主要從以下兩方面來(lái)考慮：(1)pH范圍、離子種類和離子強(qiáng)度 對(duì)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，選擇的pH值應(yīng)能使樣品中各種蛋白質(zhì)分子泳動(dòng)率的差別最大。酸性蛋

38、白質(zhì)在高pH條件下，堿性蛋白質(zhì)在低pH條件下常得到較好的分離效果。如果蛋白質(zhì)樣品經(jīng)電泳分離后，還希望測(cè)定其生物活性，則緩沖系統(tǒng)的pH值不應(yīng)過(guò)大或過(guò)小(大于pH9或小于pH4)，否則會(huì)引起蛋白質(zhì)活性的鈍化。目前常用的分離膠緩沖系統(tǒng)有高pH(pH9左右)、低pH(pH4左右)和中性三大類。此外，通常選用離子強(qiáng)度較低的緩沖溶液(0.010.1 molL)。因?yàn)殡x子強(qiáng)度低，電導(dǎo)就低。電導(dǎo)低的優(yōu)點(diǎn)是能產(chǎn)牛高電壓梯度，電泳分離過(guò)程短，產(chǎn)生的熱量也較小，分離效果好。(2)連續(xù)和不連續(xù)系統(tǒng)所謂連續(xù)系統(tǒng)是指電泳槽中的緩沖系統(tǒng)和pH值與凝膠中的相1司，不連續(xù)系統(tǒng)是槽中與凝膠中的緩沖系統(tǒng)和pH值不同。不連續(xù)系統(tǒng)的分

39、辨率較高。4不連續(xù)盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳 不連續(xù)盤狀電泳往往包含兩種以上的緩沖溶液，pH和凝膠孔徑。多用于分析濃度較稀的樣品。一般是在內(nèi)徑為0.7cm，長(zhǎng)10 cm的小玻璃管內(nèi)，把3種性質(zhì)不完全一樣的聚丙烯酰胺凝膠重疊起來(lái)，如圖45所示。圖中為樣品膠(其中含有樣品)；為濃縮膠(又名成層膠)，這兩種膠的緩沖液，pH和孔徑大小完全一樣；是分離膠(又稱電泳膠)，其孔徑一般比濃縮膠小，pH值也不同。樣品膠和濃縮膠是T=3，c=20的單體溶液在TrisHCI緩沖液中由核黃索催化合成的大孔膠，pH6.7。而分離膠是由T=7，c=2.5的單體溶液在TrisHCl緩沖液(pH8.9)中通過(guò)過(guò)硫酸銨催化聚合成的小孔膠。將含有這3種凝膠的玻璃管放在含有Tris一甘氨酸(pH 8.3)緩沖液的電泳槽內(nèi)進(jìn)行電泳，就是不連續(xù)的盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳。它之所以有很高的分辨率是因?yàn)橛?種效應(yīng)：即濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。濃縮效應(yīng)：樣品通過(guò)濃縮膠被濃縮成高濃度的樣品薄層，甚至有的能濃縮幾百倍。為什么樣品會(huì)在濃縮膠中被壓擠成層呢?這是因?yàn)闃悠纺z和濃縮膠是用pH6.7的TrisHCl緩沖