RNA及RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的理論知識(shí)

1、第2章 RNA及RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的理論知識(shí)2.1 RNA的生物知識(shí)2.1.1 RNA基本單位在動(dòng)植物、微生物、一些病毒以及噬菌體內(nèi)都有RNA分子，它是一種以磷酸二酯鍵連接的幾十種核糖核苷酸的形式存在的核酸，核苷酸是構(gòu)成RNA的基本單位。從本質(zhì)上看，多個(gè)單核苷酸聚在一起形成的多聚核苷酸構(gòu)成了核酸。核苷酸由核酸經(jīng)大量水解得到；而核苷和磷酸由對(duì)核苷酸的水解得到；同樣的，對(duì)核苷再進(jìn)行水解就可得到含氮堿基和戍糖；含氮堿基包括嘌呤堿和嘧啶堿，戍糖經(jīng)過(guò)分解形成核糖與脫氧核糖。2.1.2 RNA的化學(xué)構(gòu)成RNA主鏈由核糖與磷酸二酯鍵構(gòu)成，與之相連的四個(gè)堿基以一些特殊次序排成一個(gè)多核苷酸序列，從若干個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)一直到

2、成千上萬(wàn)個(gè)基地。研究表明，核苷酸的堿基的主要構(gòu)成是含氮雜環(huán)化合物，這些化和物質(zhì)主要有嘧啶衍生物和嘌呤衍生物兩類。其中嘧啶生物包括胞嘧啶C、尿嘧啶和胸腺嘧啶；嘌呤生物包括鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤。鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤和胞嘧啶同樣存在與DNA分子中，但胸腺嘧啶只存在與DNA中。他們相應(yīng)的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖2.2。圖2.2核苷酸各堿基的化學(xué)組成通過(guò)對(duì)上圖的綜合分析，我們發(fā)現(xiàn)RNA的化學(xué)結(jié)構(gòu)并不非常復(fù)雜，都是通過(guò)氫鍵分別將A和U、C和G連起來(lái)，形成互補(bǔ)堿基配對(duì)，不同的地方是連接氫鍵個(gè)數(shù)的差別，即A和U之間最多形成兩個(gè)氫鍵；G和C之間最多形成3個(gè)氫鍵，如圖2.3所示。圖2.3RNA堿基配對(duì)中的氫鍵構(gòu)成除了一些小的RNA病毒，

3、大部分RNA的主要以單鏈形式存在，但這種單鏈形式的產(chǎn)生不是偶然，而是在堿基堆積作用下，使單鏈結(jié)構(gòu)其中個(gè)別區(qū)段借助堿基的互補(bǔ)配對(duì)，將自身折疊并且形成一個(gè)短的雙螺旋區(qū)。這種RNA短雙螺旋結(jié)構(gòu)和單一的未配對(duì)鏈結(jié)構(gòu)，與DNA雙鏈雙螺旋結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比，其穩(wěn)定性明顯差很多。但正是這一穩(wěn)定的特點(diǎn)，使RNA能形成更復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)。除了“AU”和“GC”配對(duì)之外，還存在一些非典型的配對(duì)，如“G=U”配對(duì)等。在熱力學(xué)方面，“G=U”配對(duì)有穩(wěn)定性的特點(diǎn)，即同上面兩個(gè)典型Waston-Crick配對(duì)很接近，因此“G=U”配對(duì)又稱為晃動(dòng)配對(duì)。那么，如果從穩(wěn)定性上將上述配對(duì)放一起做比較的話，通常情況應(yīng)為“GC”>“A

4、=U”>“G=U”。2.2 RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的特征生物RNA的分子結(jié)構(gòu)分別有一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)和四級(jí)四種，其中四級(jí)結(jié)構(gòu)最復(fù)雜。同時(shí)，RNA分子結(jié)構(gòu)具有跟蛋白質(zhì)類似的種類繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的特點(diǎn)。生物RNA分子中共有四種不同的核苷酸，它們按照不同順序排列在一起就形成RNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)。RNA分子存在很多由互補(bǔ)堿基對(duì)構(gòu)成的單鏈區(qū)結(jié)構(gòu)、莖環(huán)結(jié)構(gòu)，以及雙鏈結(jié)構(gòu)等各種不同的組件形成的平面結(jié)構(gòu)，并通過(guò)這些結(jié)構(gòu)來(lái)進(jìn)行自我折疊運(yùn)動(dòng)，所構(gòu)成的結(jié)構(gòu)就是RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)。2.2.1 RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的組成上文提到，RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)是RNA分子在自然條件下對(duì)自身進(jìn)行各種形式的回折，在不同的堿基互補(bǔ)對(duì)莖區(qū)之間，以非匹配的環(huán)區(qū)形式

5、和最頂部單鏈形式兩者交替出現(xiàn)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。這些莖環(huán)結(jié)構(gòu)又能分出一些子結(jié)構(gòu)，也叫做RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)元件，正是這些按一定規(guī)律組合在一起的元件才構(gòu)成了各種RNA完整的二級(jí)分子結(jié)構(gòu)。這個(gè)復(fù)雜的形成過(guò)程里面，有三對(duì)堿基作為研究的重點(diǎn)，即AU堿基對(duì)、GC堿基對(duì)和GU堿基對(duì)。常見(jiàn)的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)如圖2.10所示。圖2.10常見(jiàn)的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖（表示堿基對(duì)，數(shù)字表示堿基的序列號(hào)）所謂的莖區(qū)結(jié)構(gòu)就是我們通過(guò)RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖會(huì)發(fā)現(xiàn)有一部分雙螺旋區(qū)域是由兩方面組織，一部分是堿基互補(bǔ)對(duì)的形式構(gòu)建起來(lái)的，另一部分是其余被隔離在雙螺旋區(qū)域之外且沒(méi)有堿基對(duì)的單鏈則形成了環(huán)結(jié)構(gòu)。所謂環(huán)結(jié)構(gòu)，在RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖

6、中，我們根據(jù)圖形與實(shí)物的比較，很容易找出幾種形象的環(huán)形結(jié)構(gòu)，它們有：發(fā)卡環(huán)、膨脹環(huán)、內(nèi)環(huán)和多分支環(huán)等如圖2.11所示。圖2.11莖區(qū)及環(huán)的示意圖RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)中還有兩個(gè)重要的組成部分，一個(gè)叫做多分支環(huán)，它是連接著RNA分子結(jié)構(gòu)各個(gè)區(qū)域沒(méi)有實(shí)現(xiàn)配對(duì)的各個(gè)發(fā)卡環(huán)；另一個(gè)叫做自由單鏈，它是RNA分子結(jié)構(gòu)排序組合最頂端沒(méi)有形成配對(duì)的單鏈。假結(jié)，在RNA分子結(jié)構(gòu)中一般包含兩種假結(jié)的形式：一種叫做平面假結(jié)，是在RNA分子結(jié)構(gòu)中環(huán)結(jié)構(gòu)上和環(huán)結(jié)構(gòu)外區(qū)域的堿基配對(duì)，能夠以平面圖形的表示的形式假結(jié)形式；跟前者相反的另外一種情況被稱為非平面假結(jié)。RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的模體是由RNA分子基本單元按照一定的排列組合而構(gòu)成的。

7、如圖2.12所示：2.12RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)模型以及其個(gè)結(jié)構(gòu)單元關(guān)系目前，關(guān)于RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的研究依然是RNA分子結(jié)構(gòu)領(lǐng)域當(dāng)中的重點(diǎn)和難點(diǎn)。其第一個(gè)原因是RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)是RNA分子從一級(jí)結(jié)構(gòu)到三級(jí)結(jié)構(gòu)跨越必不可少的橋梁。第二個(gè)原因是通過(guò)弄清RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果，就可以在大范圍內(nèi)確定RNA三級(jí)結(jié)構(gòu)的問(wèn)題。并且，當(dāng)研究者的意見(jiàn)都?xì)w于一致時(shí)，在RNA分子結(jié)構(gòu)當(dāng)中，對(duì)于各個(gè)組成方面所具有的生物學(xué)意義與其堿基序列的組成相比意義更大，這個(gè)對(duì)比對(duì)非編碼的RNA或者DNA同樣適用。此外，RNA的分子結(jié)構(gòu)還有一個(gè)相似性的特點(diǎn)，就是在各同源RNA當(dāng)中，通常它的二級(jí)結(jié)構(gòu)都是不自覺(jué)接受或相像；但是相似存在這個(gè)特性幾乎

8、不會(huì)出現(xiàn)在一級(jí)結(jié)構(gòu)上。并且，RNA的同源性和保守型特征都是建立在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上而不是一級(jí)結(jié)構(gòu)的保守序列上的。因此，當(dāng)對(duì)某種RNA基本情況有所了解后，研究者就可根據(jù)給出的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)問(wèn)題做出相對(duì)準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，就是通過(guò)用計(jì)算機(jī)手段和有關(guān)數(shù)學(xué)方法，對(duì)給定的RNA分子堿基序列按照一些方法來(lái)計(jì)算，從而最大可能地來(lái)測(cè)出該RNA分子多具備的二級(jí)結(jié)構(gòu)。2.2.2 RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方法的發(fā)展Von Heijne總結(jié)并敘述了預(yù)測(cè)RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的各種方法.Tinoco et al第一次大概算出了有關(guān)二級(jí)結(jié)構(gòu)的能量，他通過(guò)研究小分子和利用外推法來(lái)預(yù)測(cè)最穩(wěn)定的大分子結(jié)構(gòu)。這個(gè)預(yù)測(cè)包括了雙鏈區(qū)里堆疊堿基對(duì)有

9、關(guān)的穩(wěn)態(tài)能量跟未配對(duì)區(qū)域不穩(wěn)定的影響，帕帕和麥克馬洪研發(fā)的程序能夠列出tRNA序列里所有有可能的螺旋區(qū)。他們采用改良版的威士頓-克里克堿基配對(duì)原則，利用排列組合適當(dāng)?shù)穆菪玫剿锌赡艿亩?jí)結(jié)構(gòu)，且測(cè)算了任何一個(gè)可能結(jié)構(gòu)的全部自由能。斯洛伐克設(shè)計(jì)出一種能夠使合適的雙鏈區(qū)相加就獲得能量最適合結(jié)構(gòu)的方法。馬丁內(nèi)斯列出了可能雙鏈區(qū)，并利用計(jì)算波磁慢函數(shù)給出之前所指區(qū)域在它平衡常量里的比例，這里的-G是這些區(qū)域里的自由能，r為氣體常數(shù)，t是溫度。用蒙特 卡洛的辦法折疊RNA分子，這個(gè)方法當(dāng)中的每個(gè)起始區(qū)域都是經(jīng)一個(gè)加權(quán)集合里任意選擇的，這跟用余吉不思取樣的辦法是差不多的。假設(shè)每一個(gè)可能的雙鏈區(qū)用袋子里的

10、彈珠來(lái)表示。每種類型了彈珠用博磁慢概率給與權(quán)重，這樣能量越穩(wěn)定的區(qū)域?qū)?yīng)的彈珠就越有可能被選中。另外可能區(qū)域的選擇可通過(guò)權(quán)重進(jìn)一步進(jìn)行，一直到不能再加了。這個(gè)方法產(chǎn)生了一系列的通過(guò)能量加權(quán)的可能結(jié)構(gòu)，但沒(méi)有考慮到未配對(duì)區(qū)域不穩(wěn)定的影響。博磁慢概率函數(shù)現(xiàn)在已經(jīng)被用作找尋最有可能的二級(jí)結(jié)構(gòu)了。2.2.3 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)基本原理 分子里的堿基相互配對(duì)形成了RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)。堿基配對(duì)有三種形式：G-C、A-U、G-U，他們中間分別有3個(gè)，2個(gè)跟1個(gè)氫鍵。堿基之間連續(xù)不斷的配對(duì)形成了螺旋區(qū)，對(duì)RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)有著穩(wěn)定作用來(lái)降低整體結(jié)構(gòu)的自由能，而RNA分子中沒(méi)有配對(duì)的部分形成“發(fā)卡環(huán)，內(nèi)部換，膨脹環(huán)跟多分支環(huán)

11、”等環(huán)裝結(jié)構(gòu)，不利于穩(wěn)定結(jié)構(gòu) 和升高結(jié)構(gòu)的自由能，RNA二級(jí)機(jī)構(gòu)就是在這種矛盾之間的平衡中形成的。在各種可能結(jié)構(gòu)之間找最小自由能結(jié)構(gòu)是預(yù)測(cè)RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)最常用的方法，而通過(guò)研究體外少核苷酸穩(wěn)定性可以得到基本結(jié)構(gòu)的自由能數(shù)據(jù)。最常用的自由能數(shù)據(jù)是薩爾澤跟瘤能量積分系統(tǒng)，但在這兩組數(shù)據(jù)中沒(méi)有提到多分支環(huán)的能量計(jì)算，目前一般將之作內(nèi)部處理，或用公式計(jì)算：4.7+0.4x單鏈堿基數(shù)+0.1x螺旋區(qū)數(shù)目.有了這些數(shù)據(jù)，就能夠評(píng)價(jià)RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，通過(guò)這種方法可以得到近似穩(wěn)定能量的結(jié)構(gòu)和最可靠預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)。在有關(guān)序列當(dāng)中發(fā)現(xiàn)的序列變異也能用來(lái)預(yù)測(cè)可能在每個(gè)分子里都存在的堿基配對(duì)。預(yù)測(cè)一組可能形成一種特殊

12、結(jié)構(gòu)的序列是RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方法的另外一種形式。從序列來(lái)預(yù)測(cè)RNA三維結(jié)構(gòu)的方法還在發(fā)展當(dāng)中。還有一種常見(jiàn)的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)方法考慮到堿基配對(duì)的保守形式，這些形式在一定的rna分子進(jìn)化過(guò)程中是相對(duì)保守的。發(fā)現(xiàn)序列中堿基配對(duì)的區(qū)域在rna分子進(jìn)化的同時(shí)發(fā)生改變，使結(jié)構(gòu)的完整度能以維持。例如，如果在一個(gè)給定類型的序列中兩個(gè)位置（G和C形成一個(gè)堿基對(duì)），則在相應(yīng)的位置上保留了G和C、A和U或U和A的序列被認(rèn)為是可能的匹配。RNA分子中這些協(xié)同變異模式是RNA二級(jí)機(jī)構(gòu)的一種表現(xiàn)，課件預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)。計(jì)算上遇到的挑戰(zhàn)是如何在其他序列變化的背景中發(fā)現(xiàn)這些協(xié)同變量的位置。3.1.3 RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的表示RN

13、A二級(jí)結(jié)構(gòu)的表示方法很多，如半圓表示、圓形表示、點(diǎn)陣表示。山峰表示。正多邊形表示等，其中以正多邊形表示最為直觀形象，便于分子生物學(xué)家觀察，研究RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)特征，但是利用這種方法來(lái)比較不同的結(jié)構(gòu)是較為困難的，因?yàn)槔眠@種表示方式時(shí)，常導(dǎo)致許多結(jié)構(gòu)的重疊，為此，人們不得不借助于旋轉(zhuǎn)的辦法來(lái)克服重疊現(xiàn)象，這樣以來(lái)，即使是對(duì)同一結(jié)構(gòu)，可能由于在不同的地方旋轉(zhuǎn)或在同一地方旋轉(zhuǎn)的角度不同而導(dǎo)致結(jié)構(gòu)形狀的變化。目前，再現(xiàn)結(jié)構(gòu)對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較的最好方法是樹(shù)狀表示方法，這種方法是從圖論的角度來(lái)考慮的，與上述方法不同，在RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)中，每個(gè)配對(duì)堿基用一個(gè)點(diǎn)表示，然后用一條有向線段將點(diǎn)按順序連接起來(lái)，便可獲得RN

14、A二級(jí)結(jié)構(gòu)的樹(shù)狀表示，在這種顯示中，環(huán)區(qū)堿基等信息將被丟失。最小自由能RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)被劃分為莖區(qū)，外環(huán)，凸環(huán)，內(nèi)環(huán)，發(fā)卡環(huán)以及多分枝環(huán)等。Zuker，Turner等人詳細(xì)地給出了各個(gè)部分結(jié)構(gòu)的能量計(jì)算方法，到目前為止，有些能量值還在不斷地被修正和補(bǔ)充。其中較有影響的軟件Mfold采用的就是最近鄰能量規(guī)則，也被稱為環(huán)依賴的能量規(guī)則。環(huán)依賴的能量規(guī)則在如下三個(gè)方面做了約定：（1） 二級(jí)結(jié)構(gòu)中不允許訊在一個(gè)堿基和兩個(gè)以上堿基同時(shí)配對(duì)的情形。（2） 發(fā)卡環(huán)的長(zhǎng)度必須大于等于3。（3） 二級(jí)結(jié)構(gòu)中不允許訊在假結(jié)，即任意兩莖區(qū)之間只能是嵌套關(guān)系或順次關(guān)系。假結(jié)和三堿基配對(duì)的情形的能量，由于目前實(shí)驗(yàn)手段的限制，和數(shù)據(jù)不足兩方面的原因而無(wú)法給出其準(zhǔn)確的能量計(jì)算公式。堿基i和k配對(duì)可以表示為i.k的形式。如果單堿基r或者堿基對(duì)I.k滿足條件i<