201456 PI法細(xì)胞周期檢測(cè)

1、細(xì)胞周期檢測(cè)（PI法）一、實(shí)驗(yàn)方法原理細(xì)胞周期（cell cycle)：是指細(xì)胞從前一次分裂結(jié)束起到下一次分裂結(jié)束為止的活動(dòng)過程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期組成。G1期：細(xì)胞開始RNA和蛋白質(zhì)的合成，但DNA含量仍保持二倍體。S期：DNA開始合成，這時(shí)細(xì)胞核內(nèi)DNA的含量介于G1期和G2期之間。當(dāng)DNA復(fù)制結(jié)束成為4倍體時(shí)，細(xì)胞進(jìn)入G2期。G2期的細(xì)胞繼續(xù)合成RNA及蛋白質(zhì)，直到進(jìn)入M期。因此，單純從DNA含量無法區(qū)分G2期和M期。一旦有絲分裂發(fā)生，細(xì)胞分裂成兩個(gè)細(xì)胞，這兩個(gè)細(xì)胞或者進(jìn)入下一個(gè)細(xì)胞周期，或者進(jìn)入靜止期（G0期），而G0期從DNA含量上同樣無法與G1期區(qū)分。因此，整個(gè)

2、復(fù)制周期可以描述為G0/G1、S、G2/M期。通過核酸染料PI標(biāo)記DNA,并由流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，可以得到細(xì)胞各個(gè)時(shí)期的分布狀態(tài)，計(jì)算出G0/G1%、S%、G2/M%，了解增殖能力，在腫瘤病理學(xué)研究中，通常以S期細(xì)胞比率作為判斷腫瘤增殖狀態(tài)的指標(biāo)。流式細(xì)胞儀的工作原理：是將待測(cè)細(xì)胞放入樣品管中，在氣體的壓力下進(jìn)入充滿鞘液的流動(dòng)室。在鞘液的約束下細(xì)胞排成單列由流動(dòng)室的噴嘴噴出，形成細(xì)胞柱。通過對(duì)流動(dòng)液體中排列成單列的細(xì)胞進(jìn)行逐個(gè)檢測(cè)，得到該細(xì)胞的光散射和熒光指標(biāo)，分析出其DNA特征。細(xì)胞周期檢測(cè)的原理：PI法是較常見的一種周期檢測(cè)方法。PI為插入性核酸熒光染料，能選擇性的嵌入核酸DNA和RNA雙

3、鏈螺旋的堿基之間與之結(jié)合，其結(jié)合的量與DNA的含量成正比例關(guān)系，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，就可以得到細(xì)胞周期各個(gè)階段的DNA分布狀態(tài)，從而計(jì)算出各個(gè)期的百分含量。PI染色后，假設(shè)G0/G1期細(xì)胞的熒光強(qiáng)度為1，那么含有雙份基因組DNA的G2/M期細(xì)胞的熒光強(qiáng)度的理論值為2，正在進(jìn)行DNA復(fù)制的S期細(xì)胞的熒光強(qiáng)度為1-2之間。細(xì)胞周期示意圖如（圖一）所示（圖一）二、材料及準(zhǔn)備工作1.材料準(zhǔn)備試劑、耗材名稱品牌貨號(hào)細(xì)胞培養(yǎng)瓶corning6孔板corning10ml離心管國(guó)產(chǎn)1.5ml EP管國(guó)產(chǎn)胰酶（無EDTA）貝博試劑盒中包括RNase-A貝博試劑盒中包括PI貝博試劑盒中包括無水乙醇國(guó)產(chǎn)PBS自配

4、2. 試劑配制10XPBS液體配方（0.1MPBS pH 7.4）以1L量為例： NaCl 80gNa2HPO4·12H2O 32.3gNaH2PO4·2H2O 4.5g（十二水合磷酸氫二鈉和二水合磷酸二氫鈉）加雙蒸水900mL 左右，用HCl/NaOH 調(diào)pH至7.4，最后定容為1000mL。使用時(shí)用去離子水稀釋成1XPBS3.儀器設(shè)備流式細(xì)胞儀；細(xì)胞培養(yǎng)孵箱；離心機(jī)；水??；冰箱；離心管；封口膜；移液器三、 實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)：（采用貝博公司的細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒）1. 細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備： 單次流式細(xì)胞儀檢測(cè)，1份樣品細(xì)胞數(shù)量約106（我校8樓免疫教研室的要求） 收集細(xì)胞培養(yǎng)

5、液備用。 用胰酶（無EDTA）消化細(xì)胞，至細(xì)胞可以被輕輕用吹打下來時(shí)，加入前面收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打下所有的貼壁細(xì)胞，并輕輕吹散細(xì)胞。 將細(xì)胞懸液收集到10ml的離心管內(nèi)。800g左右離心5min，沉淀細(xì)胞。小心吸除上清，殘留約50微升左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細(xì)胞。 加入1ml冰浴預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞， 800g×5min。為減少細(xì)胞損失可用1.5ml離心。 再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清，殘留約20ul左右的PBS，以 避免吸走細(xì)胞。重復(fù)第5步操作，用預(yù)冷的PBS再次洗細(xì)胞，并離心收集細(xì)胞。輕輕彈擊離心管底以適當(dāng)分散細(xì)胞，避免細(xì)胞成團(tuán)，用250ul預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞。2. 細(xì)胞

6、固定：緩慢加入750ul冰浴預(yù)冷無水乙醇，輕輕吹打混勻，4固定2小時(shí)或-20固定1小時(shí)，封口膜封口（此步可停止，-20保存樣品，1周內(nèi)樣品檢測(cè)不受影響）。3. 染色：1000g左右離心3-5min，沉淀細(xì)胞。小心吸除上清，可以殘留約50ul左右的70%乙醇，以避免吸走細(xì)胞。加入約1ml冰浴預(yù)冷的PBS，洗滌細(xì)胞一次。再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清。用200ul預(yù)冷的PBS重懸細(xì)加入Rnase A溶液20ul，37水浴30min。 每管細(xì)胞樣品中加入400ul碘化丙啶染色液，緩慢并充分混勻后4避光孵育30 min。染色完成后宜在24h內(nèi)完成流式檢測(cè)。. 流式檢測(cè)和分析：用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長(zhǎng)48

7、8nm波長(zhǎng)處檢測(cè)紅色熒光，同時(shí)檢測(cè)光散射情況。采用適當(dāng)分析軟件進(jìn)行細(xì)胞DNA含量分析和光散射分析。注意事項(xiàng)1.RNaseA用PBS配制，但是注意要沸水浴去除DNase的活性。試劑盒中帶有配制好的酶。2.流式分析時(shí)需要的是單個(gè)細(xì)胞懸液，因此在操作過程中充分混懸細(xì)胞。3.固定過程中不直接加70%乙醇的原因是：直接加入乙醇會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞團(tuán)聚的現(xiàn)象，很難重懸成單細(xì)胞。乙醇固定之后沒有細(xì)胞沉淀。3. PI液體4避光保存。FlowJo分析細(xì)胞周期數(shù)據(jù)的過程1.把細(xì)胞周期樣品拖入FlowJo軟件，雙擊打開原始數(shù)據(jù)。如(圖二)所示：(圖二)X軸選擇FSC,Y軸選擇SSC。分析細(xì)胞周期的細(xì)胞選擇上圖所示的細(xì)胞群體進(jìn)

8、行分析。2. 在SSC/FSC圖中雙擊分析的細(xì)胞群體，如（圖三）所示：（圖三）X軸選擇FL3-LIN,用來表示PI的線性信號(hào)。Y軸選擇FL3-PEAK,用來表示PI的峰值信號(hào)。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采集采用的是貝克曼儀器采集的數(shù)據(jù)。（如果是BD的儀器采集的數(shù)據(jù)，X軸選擇FL2-W,用來表示PI的寬度信號(hào)。Y軸選擇FL2-A,用來表示PI的面積信號(hào)），如上圖所示多倍體或異倍體細(xì)胞不予分析。3.在FlowJo工作臺(tái)中選中“用于周期分析的二倍體細(xì)胞”這個(gè)結(jié)點(diǎn)，在工具欄的“工具”中選擇“細(xì)胞周期”。如（圖四）所示（圖四）說明：1) 分析的模型有Watson和DJF兩種，用戶可以選擇任意一種進(jìn)行分析，兩模型間沒有實(shí)

9、質(zhì)的差別。模式右邊是兩種模型的顯示方式。2) 細(xì)胞周期擬合原則：G1峰限制和G2峰限制。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果擬合情況，對(duì)G1峰限制和G2峰限制進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。曲線調(diào)整原則：粉色的曲線為模型曲線，黑色的為樣本曲線，理想狀況是粉色和黑色曲線吻合一致為最佳。擬和的好壞可以l 根據(jù)右邊的RMS值來判斷。RMS(root mean square)值越小越好。但是這只是一個(gè)相對(duì)值，只在同樣本不同模擬情況下，選取最小值來達(dá)到最佳擬和。你可以選中G1期的峰或G2期的峰，根據(jù)調(diào)節(jié)按鈕調(diào)節(jié)峰的寬度l 通常來說，G2的位置為G1的2倍。 你可以根據(jù)相對(duì)固定的那個(gè)峰來確定另外一個(gè)峰的位置，如G1峰相對(duì)固定的話，就選擇G2峰的

10、均數(shù)為G1的2倍(2G1)；如果G2峰相對(duì)固定的話，就選擇G1峰為G2峰的0.5G2細(xì)胞周期結(jié)果解讀：G0/G1期細(xì)胞占總的61.2%，峰位于橫座標(biāo)的45.76G2/M期占13.07，峰位于橫座標(biāo)的91.43S期占25.73G2/G1為2.0（即G2期為4倍體細(xì)胞，而G1期為2倍體細(xì)胞，比值為2）峰的變異系數(shù)為4.54%（好）細(xì)胞碎片為0.48%，細(xì)胞聚集體有0.06%。總的細(xì)胞數(shù)（儀器檢測(cè)到的）為17525個(gè)，在細(xì)胞周期中分析的細(xì)胞數(shù)為17431個(gè)（即排除了碎片及聚集體后）CV是變異系數(shù)。一般CV越小，峰形越好，越尖銳。能控制在5%左右是比較好的結(jié)果，一般小于10%就可以認(rèn)可了。細(xì)胞周期分析常用術(shù)語：· CV：變異系數(shù)。不同細(xì)胞群體DNA含量的細(xì)微差別可能有生物學(xué)上的重要意義，因此DNA含量的流式分析中分辨率尤其關(guān)鍵。通常檢測(cè)分辨率或精度由G0/G1峰的CV來反映。影響CV的因素主要包括兩方面：儀器因素和樣品制備及染色過程對(duì)標(biāo)本的人為影響。· Ploidy:倍體。原指染色體數(shù)目。流式中用來描述總的DNA含量。二倍體細(xì)胞有正常細(xì)胞的DNA 含量但不排除染色體的異常。S期含量 :S期細(xì)胞占總細(xì)胞周期的比例。細(xì)胞周期數(shù)據(jù)結(jié)果輸出1. 細(xì)胞周期結(jié)果的輸出根據(jù)最終的需求可以有多種輸出方式· 在細(xì)胞周期分析窗口工具欄中選擇“文件