細(xì)菌鞭毛染色及運(yùn)動(dòng)性觀(guān)察

1、細(xì)菌鞭毛染色及活菌運(yùn)動(dòng)性觀(guān)察【摘要】本實(shí)驗(yàn)以銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌為實(shí)驗(yàn)菌種，先使用壓滴法制片，之后用光學(xué)顯微鏡的油鏡觀(guān)察細(xì)菌的活體運(yùn)動(dòng)。然后，使用鞭毛染色法（用硝酸銀染液A液和B液進(jìn)行染色）對(duì)其染色，之后用光學(xué)顯微鏡的油鏡觀(guān)察細(xì)菌鞭毛的形態(tài)；雖然最后并沒(méi)有在顯微鏡下觀(guān)察到染色后的鞭毛，但在實(shí)驗(yàn)中已大致掌握相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作?！娟P(guān)鍵詞】銅綠假單胞菌；枯草芽孢桿菌；鞭毛染色法；壓滴法【前言】鞭毛是生長(zhǎng)在某些細(xì)菌體表的長(zhǎng)絲狀，波曲型的蛋白質(zhì)附屬物，具有運(yùn)動(dòng)功能。鞭毛的有無(wú)、數(shù)量及著生方式也是細(xì)菌分類(lèi)的重要指標(biāo)。鞭毛直徑一般為1020nm，只有用電子顯微鏡才能觀(guān)察到。但可以使用鞭毛染色法，使之能用普通

2、光學(xué)顯微鏡觀(guān)察到。因此在本實(shí)驗(yàn)中，要觀(guān)察細(xì)菌鞭毛形態(tài)，就要使用鞭毛染色法。本實(shí)驗(yàn)使用染液的是硝酸銀染液A液和B液。而觀(guān)察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性時(shí)要使用壓滴法。本實(shí)驗(yàn)選用的的菌種是具周生鞭毛的枯草芽孢桿菌和具端生鞭毛的的銅綠假單胞菌，均可使用兩種方法進(jìn)行觀(guān)察。本實(shí)驗(yàn)報(bào)告先介紹了本次實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)材料與方法，然后是對(duì)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與分析進(jìn)行描述，最后是總結(jié)性的小結(jié)部分。1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.1學(xué)習(xí)并掌握鞭毛染色法并了解鞭毛的形態(tài)特征1.2鞏固顯微鏡操作技術(shù)及無(wú)菌操作技術(shù)1.3學(xué)習(xí)壓滴法觀(guān)察細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性（活細(xì)胞）2 實(shí)驗(yàn)原理21細(xì)菌鞭毛染色法的基本原理簡(jiǎn)單染色法適用于一般的微生物菌體的染色，而某些微生物具有一些特殊結(jié)構(gòu)，如鞭

3、毛，對(duì)它們進(jìn)行觀(guān)察之前需要進(jìn)行有針對(duì)性的染色。鞭毛是細(xì)菌的纖細(xì)絲狀的運(yùn)動(dòng)器。鞭毛的有無(wú)、數(shù)量及著生方式也是細(xì)菌分類(lèi)的重要指標(biāo)。鞭毛直徑一般為1030nm，只有用電鏡才可以直接觀(guān)察到。若要用普通光學(xué)顯微鏡觀(guān)察，必須使用鞭毛染色法。首先用媒染劑處理，使媒染劑附著在鞭毛上使其加粗，然后用堿性復(fù)紅（Gray氏染色法）、堿性復(fù)品紅（Leifson氏染色法）、硝酸銀（West氏染色法）或結(jié)晶紫（Difco氏染色法）進(jìn)行染色。2.2菌種壓滴法觀(guān)察活菌運(yùn)動(dòng)的基本原理鞭毛的功能相當(dāng)于船的螺漿，在水中可以高速旋轉(zhuǎn)從而推動(dòng)菌體前行，因此水體環(huán)境才是鞭毛細(xì)菌自由馳騁的天地。鞭毛的旋轉(zhuǎn)速度是非常快的，每秒鐘旋轉(zhuǎn)兩百到一

4、千多轉(zhuǎn)，比一般的電動(dòng)機(jī)要快得多。鞭毛的高速旋轉(zhuǎn)是由其附著于菌體上的基體旋轉(zhuǎn)帶動(dòng)的，基體實(shí)際上就是鞭毛的基部，它由一個(gè)中軸套上兩個(gè)或四個(gè)環(huán)構(gòu)成，鑲嵌固定在細(xì)菌的體表（細(xì)胞膜和細(xì)胞壁）中，在科學(xué)家的眼中，基體簡(jiǎn)直就是一臺(tái)精巧的納米機(jī)械分子馬達(dá)，但這個(gè)馬達(dá)并不是靠電流驅(qū)動(dòng)，而是用伴隨著細(xì)胞膜兩側(cè)質(zhì)子梯度的消失產(chǎn)生的生物能量ATP來(lái)驅(qū)動(dòng)，鞭毛馬達(dá)還可以轉(zhuǎn)向（從反時(shí)針旋轉(zhuǎn)變?yōu)轫槙r(shí)針旋轉(zhuǎn)）從而使菌體發(fā)生翻滾進(jìn)而改變細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)方向，事實(shí)上細(xì)菌在游動(dòng)時(shí)也并不是單純地一直朝前游，而是伴隨著不時(shí)的隨機(jī)翻滾轉(zhuǎn)向，但從表觀(guān)上看仍表現(xiàn)為細(xì)菌的前行。細(xì)菌未染色時(shí)無(wú)色透明，在顯微鏡下主要靠細(xì)菌的折光率與周?chē)h(huán)境的不同來(lái)進(jìn)行

5、觀(guān)察。有鞭毛的細(xì)菌運(yùn)動(dòng)活潑，且不同時(shí)向一個(gè)方向運(yùn)動(dòng)，而無(wú)鞭毛的細(xì)菌則呈不規(guī)則布朗運(yùn)動(dòng)。這樣便可以在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察到細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)。3材料與方法3.1 材料枯草芽孢桿菌，銅綠假單胞菌。硝酸銀鞭毛染液（A、B液），蒸餾水，95%的乙醇。普通光學(xué)顯微鏡，擦鏡紙，酒精燈，載玻片，蓋玻片，雙層瓶（內(nèi)裝香柏油和二甲苯），接種環(huán)，試管架，鑷子，吸水紙，滴管等。3.2 步驟和方法先在載玻片上滴一滴蒸餾水，無(wú)菌操作用接種環(huán)由枯草芽孢桿菌（或銅綠假單胞菌）1418h牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基斜面上挑去適量菌落邊緣菌體在水中輕輕蘸幾下，注意保持其不受猛烈震蕩。再另取一潔凈蓋玻片讓其一端緊靠液滴，再緩慢放下，避免產(chǎn)生氣泡。

6、使用光學(xué)顯微鏡中的油鏡進(jìn)行鏡檢，觀(guān)察到兩個(gè)或以上的細(xì)菌分別朝著相反或不同的方向運(yùn)動(dòng)時(shí)則說(shuō)明細(xì)菌自身在運(yùn)動(dòng)。洗片95%乙醇浸泡5分鐘涂片自然干燥A液染色35min水洗B液沖覆蓋30s1min（稍加熱）水洗自然干燥鏡檢先用去污粉洗凈載玻片約8片（每人兩片），再在培養(yǎng)皿中倒入適量的95%的乙醇溶液，將洗凈的載玻片放入浸泡5分鐘。然后取出在酒精燈外焰灼燒，使其上的酒精揮發(fā)掉。在載玻片上滴一滴蒸餾水，無(wú)菌操作用接種環(huán)由枯草芽孢桿菌（或銅綠假單胞菌）1418h牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基斜面上挑去適量菌落邊緣菌體在水中輕輕蘸一蘸，注意保持其不受猛烈震蕩。傾斜玻片，使菌懸液緩慢流向另一端，用吸水紙吸去多余菌懸液，

7、自然干燥。滴加硝酸銀染液A液覆蓋菌面35min后用蒸餾水沿載玻片背面沖洗，充分洗去A液。用硝酸銀染液B液洗去殘留水分后，再滴加B液覆蓋菌面數(shù)秒至1min，其間可用微火加熱，當(dāng)菌面出現(xiàn)明顯褐色時(shí)，立即用蒸餾水沖洗，自然干燥。使用光學(xué)顯微鏡中的油鏡鏡檢：將做好的涂片放到顯微鏡下，由多到少觀(guān)察兩種菌，以方便找到鞭毛（注：枯草桿菌的菌體較大，為周生鞭毛，也可能會(huì)出現(xiàn)側(cè)生鞭毛的現(xiàn)象，這是因?yàn)楸廾珨嗟?；銅綠假單胞菌菌體較小，為端生鞭毛）4.結(jié)果與分析4.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果在使用壓滴法進(jìn)行觀(guān)察時(shí)，我們觀(guān)察到假單胞菌的運(yùn)動(dòng)。在對(duì)本組四名同學(xué)制作的八個(gè)鞭毛染色的玻片進(jìn)行觀(guān)察時(shí)，均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)鞭毛結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)繪圖另附。42

8、結(jié)果分析根據(jù)本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知：某些細(xì)菌雖然微小，但是具有運(yùn)動(dòng)性。根據(jù)本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果知，枯草芽孢桿菌結(jié)構(gòu)呈細(xì)長(zhǎng)狀，多為鏈型，銅綠假單胞菌為橢圓狀，多單個(gè)分布。通過(guò)觀(guān)察其他組成功制得的鞭毛的玻片可知，枯草芽孢桿菌具周生鞭毛；銅綠假單胞菌具端生鞭毛。鞭毛染色失敗的可能原因主要有以下幾點(diǎn)：1.2.接種的菌種位于菌落中間，菌齡可能比較老，老齡的菌種的鞭毛極易脫落，因此染色后很難看見(jiàn)有鞭毛。 在蓋玻片上接種的時(shí)候，用力過(guò)猛，動(dòng)作太重太大，菌種的鞭毛就被刮落了。5.小結(jié)本次實(shí)驗(yàn)要求我們使用鞭毛染色法和壓滴法對(duì)細(xì)菌的鞭毛形態(tài)和其運(yùn)動(dòng)性進(jìn)行觀(guān)察。因此在實(shí)驗(yàn)中我們首次接觸到了鞭毛染色法和壓滴法，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)后對(duì)其大致操

9、作已經(jīng)基本了解。但是在實(shí)驗(yàn)中還有很多需要注意的地方，本實(shí)驗(yàn)中的注意事項(xiàng)：（1） 選用活躍生長(zhǎng)期菌種進(jìn)行鞭毛染色，老齡菌鞭毛易脫落。（2） 載玻片必須清潔、光滑、無(wú)油跡，否則菌液不能散開(kāi)，造成菌體堆積，鞭毛相互糾纏而難以看清，而且染色后背景臟亂。（3） 制片過(guò)程中條件要溫和，不能劇烈震蕩、涂抹菌液，也不能采用加熱法進(jìn)行固定，否則鞭毛易脫落。（4） 硝酸銀染液B液的使用方式和染色時(shí)間的掌握是本實(shí)驗(yàn)?zāi)芊癯晒Φ年P(guān)鍵環(huán)節(jié)。若時(shí)間過(guò)短或方式不當(dāng)，就很難在媒染劑上著色，那么，我們也就沒(méi)有辦法在顯微鏡下觀(guān)察到鞭毛了。（5） 本次實(shí)驗(yàn)的染色結(jié)果差強(qiáng)人意：菌體中鞭毛大都已脫落，而且染色后觀(guān)察的菌體并不很清楚，有些太過(guò)密集，全都連成一片了。實(shí)驗(yàn)中，還有很多事需要注意，首先是載玻片上油跡比較多，多次進(jìn)行清潔后效果可能仍然不佳，這可能是觀(guān)察不清楚的原因；其次，接種的菌種位于菌落中間，菌齡可能比較老，老齡的菌種的鞭毛極易