羅格列酮對動(dòng)脈粥樣硬化兔主動(dòng)脈TNFα表達(dá)的影響

1、    【摘要】    目的 評價(jià)胰島素增敏劑羅格列酮對兔主動(dòng)脈腫瘤壞死因子（TNF）表達(dá)水平的影響，探討羅格列酮減輕動(dòng)脈粥樣硬化（AS）的機(jī)制。方法 健康大耳白兔37只，隨機(jī)分為3組，分別給予普通飼料及高脂飼料，并在Rs組加用羅格列酮。觀察14 w，采用蘇丹紅染色方法觀察主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積，并用免疫組化法檢測各組兔主動(dòng)脈TNF蛋白質(zhì)表達(dá)水平。結(jié)果 AS兔經(jīng)羅格列酮治療后主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積明顯縮小，且TNF在主動(dòng)脈中的表達(dá)水平明顯減少。結(jié)論 羅格列酮可能通過糾正胰島素抵抗，從而減少主動(dòng)脈TNF蛋白表達(dá)水平，

2、對AS起到一定的抑制作用。    【關(guān)鍵詞】 羅格列酮；動(dòng)脈粥樣硬化；兔；TNF 近年來，國內(nèi)外越來越多的研究報(bào)道腫瘤壞死因子（TNF）可能參與動(dòng)脈粥樣硬化（AS）的發(fā)生發(fā)展過程1。本實(shí)驗(yàn)擬通過檢測主動(dòng)脈TNF蛋白表達(dá)水平，探討TNF在AS發(fā)病過程中的作用及胰島素增敏劑羅格列酮對AS的抑制作用。1 材料與方法1.1 動(dòng)物健康雄性日本大耳白兔37只，選自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，78 w齡，體重（1.98±0.16）kg。1.2 方法1.2.1 分組與飼養(yǎng)隨機(jī)將動(dòng)物分為3組，對照組9只、AS組12只、羅格列酮組（Rs組）16只，各組兔均單籠

3、飼養(yǎng)。1.2.2 造模方法對照組給予普通飼料（吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）；AS組給予高脂飼料（1%膽固醇，14%蛋黃粉，5%豬油）120150 g/d；Rs組給予同樣高脂飼料。第1天由耳緣靜脈一次性給予AS組及Rs組牛血清白蛋白1 g/kg，對照組靜脈注射等量生理鹽水。1.2.3 給藥方法將羅格列酮（馬來酸羅格列酮片，葛蘭素史克公司，批號：05010038）混在第一口飼料中飼喂Rs組兔，劑量平均為1.5 mg/kg。1.2.4 實(shí)驗(yàn)周期實(shí)驗(yàn)前1 w對動(dòng)物進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)，每周測定飲食量，每2周測量一次全部兔體重，觀察兔的活動(dòng)、進(jìn)食及皮毛狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)期共14 w。1.3 標(biāo)本的采集和檢測于

4、第14周末處死動(dòng)物，心臟直接采集全血，血液標(biāo)本在收集后10 min內(nèi)以4 000 rmin離心5 min后立即送檢。測定指標(biāo)：血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDLC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDLC)、空腹血糖（FPG）、血胰島素（FINS）。應(yīng)用Beckman700全自動(dòng)生化分析儀，放射免疫分析法測定FINS，采血當(dāng)日完成。1.4 主動(dòng)脈標(biāo)本采集及脂質(zhì)斑塊染色將兔麻醉后從主動(dòng)脈根部游離至髂動(dòng)脈水平，剝離主動(dòng)脈，將其置于4多聚甲醛固定24 h，再按常規(guī)蘇丹紅染色方法處理。在有脂質(zhì)浸潤的斑塊處主動(dòng)脈內(nèi)膜呈橘紅或鮮紅著色，觀察大體標(biāo)本中AS斑塊形成的情況。用Image軟

5、件進(jìn)行計(jì)量分析，系統(tǒng)測量斑塊面積、血管總面積，計(jì)算斑塊面積占主動(dòng)脈內(nèi)膜總面積的百分比數(shù)。1.5 免疫組化剝離主動(dòng)脈，將標(biāo)本切成小塊，固定于10%的福爾馬林固定液中，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋后，切片。切片厚為4 m，烤干后備用。采用免疫組織化學(xué)SP法，按說明書操作，DAB顯色。以胞漿呈棕黃色顆粒為陽性結(jié)果。應(yīng)用LX70OLYMPUS顯微鏡CooledCCD采集視野圖片，并采用計(jì)量分析系統(tǒng)(Image.Proplus Analysis Software)進(jìn)行分析。1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS10.0對各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)，各組計(jì)量資料以x±s表示，組間比較用單因素方差分析。2 結(jié)果2.

6、1 一般指標(biāo)從實(shí)驗(yàn)第6周起，AS組及Rs組動(dòng)物進(jìn)食量減少，日?；顒?dòng)減少，AS組平均膽固醇攝入量較Rs組減少，見表1。2.2 血脂及FINS情況 見表1。2.3 主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成情況對主動(dòng)脈大體標(biāo)本進(jìn)行觀察：對照組見極少量散在分布的針尖大小深紅色點(diǎn)狀物；AS組見大面積呈連續(xù)片塊狀深紅色粥樣斑塊病變；Rs組見片狀深紅色粥樣硬化病變形成，以主動(dòng)脈近端，尤其主動(dòng)脈弓處為多，病變不連續(xù)，呈散在分布。用Image軟件計(jì)算各組動(dòng)脈粥樣硬化病變與血管總面積之比，見表1。2.4 各組TNF免疫組化結(jié)果見表1及圖1。對照組未見陽性顆粒；AS組著色細(xì)胞主要是泡沫細(xì)胞胞漿、內(nèi)皮細(xì)胞及中膜平滑肌細(xì)胞，著色細(xì)胞比例

7、高，著色強(qiáng)度深，呈棕黃褐色；Rs組見泡沫細(xì)胞胞漿及平滑肌細(xì)胞著色比例及強(qiáng)度均明顯減弱，呈淡黃褐色。表1 各組血脂、FINS及主動(dòng)脈粥樣硬化病變/血管總面積百分比(略)3 討 論 AS的發(fā)生發(fā)展是多因素共同作用的結(jié)果，近年來，胰島素抵抗（IR）及代償性高胰島素血癥在其中的作用越來越受到重視，且大量臨床及動(dòng)物試驗(yàn)研究提示IR可能是導(dǎo)致AS發(fā)病的關(guān)鍵2。由于IR和代償性高胰島素血癥導(dǎo)致肥胖、高血脂、高血壓、高血糖等一組機(jī)體代謝紊亂的狀態(tài)，并且各種成分間相互關(guān)聯(lián)，共同促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展。 細(xì)胞因子TNF在AS的形成中占有重要地位：TNF作為促炎因子,在AS病變局部起到多方面作用,如導(dǎo)致炎癥、細(xì)胞壞死及

8、新生血管的形成；促進(jìn)內(nèi)皮素1的產(chǎn)生而引起血管壁的損傷,還可以影響巨噬細(xì)胞ApoE的分泌,增加清道夫受體的活性；參與炎癥過程并導(dǎo)致血液促凝狀態(tài),促進(jìn)AS的形成3；通過影響胰島素受體磷酸化和激酶活性，降低葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體4的表達(dá)，使拮抗胰島素激素如糖皮質(zhì)激素、腎上腺素等分泌增多等作用引起IR和高胰島素血癥,造成脂代謝紊亂,促進(jìn)AS的發(fā)生。由此可見，TNF與IR相互促進(jìn),共同參與了AS的發(fā)病過程4。 胰島素增敏劑羅格列酮屬于噻唑烷二酮類（TZDs）藥物，其降糖作用已得到肯定，廣泛應(yīng)用于2型糖尿病的治療。近年來國內(nèi)外諸多研究報(bào)道羅格列酮具有改善IR及抑制AS的作用。筆者曾應(yīng)用羅格列酮治療AS兔，結(jié)果發(fā)現(xiàn)

9、羅格列酮不但能降低血脂、改善IR，并能明顯縮小斑塊面積及改善主動(dòng)脈、頸動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮下脂質(zhì)及平滑肌細(xì)胞等超微結(jié)構(gòu)方面的改變5，說明羅格列酮具有抑制或糾正AS的作用。 本研究通過注射異種血清白蛋白及高脂飲食成功塑造了AS模型。典型的AS模型表現(xiàn)為白兔存活期進(jìn)食量減少，活力不足，體重增長相對緩慢，化驗(yàn)呈血脂紊亂狀態(tài)，動(dòng)脈壁脂質(zhì)染色明顯。本實(shí)驗(yàn)AS組兔呈上述表現(xiàn)，說明造模成功，并且通過蘇丹紅染色方法得到證實(shí)，經(jīng)羅格列酮治療后，主動(dòng)脈炎癥因子TNF的蛋白表達(dá)明顯減少，從而減輕炎癥反應(yīng)的血管損傷作用，起到治療AS的作用。 羅格列酮通過降低TNF蛋白表達(dá)從而起到糾正或抑制IR的作用，機(jī)制可能與以下途徑

10、有關(guān)：TNF從不同層次干擾胰島素功能，影響脂代謝和糖代謝以及生糖激素的分泌，降低TNF對胰島素的敏感性，從而誘導(dǎo)或加重IR的程度。羅格列酮作為胰島素增敏劑，通過改善胰島素敏感性從而減輕IR的作用6。TNF還可抑制內(nèi)皮細(xì)胞（EC）一氧化氮合酶（NOS）表達(dá)，促進(jìn)脂肪細(xì)胞內(nèi)脂肪分解，使FFA水平升高，促使白細(xì)胞生成活性氧簇（ROS）增加，增加氧化應(yīng)激，啟動(dòng)EC的炎癥過程，從而導(dǎo)致AS。羅格列酮可通過減輕IR，增加eNOS作用，從而抑制致AS的氧化應(yīng)激作用，恢復(fù)血管內(nèi)皮功能7。羅格列酮還可降低血管壁組織及脂肪細(xì)胞TNF mRNA的表達(dá),使TNF蛋白水平降低，起到糾正或抑制IR的作用8。 綜上所述，本研究表明：羅格列酮可通過改善IR狀態(tài)，從而起到延緩或阻止AS的作用。其可能機(jī)制之一是抑制TNF蛋白的表達(dá)，更