多糖的電泳和層析技術(shù)研究進(jìn)展

1、 多糖的電泳和層析技術(shù) 多糖的化學(xué)性質(zhì)多糖（polysaccharide）糖鏈高分子碳水化合物多糖：相同的單糖組成eg淀粉、纖維素和糖原雜多糖：不同的單糖組成eg阿拉伯膠和肝素1.一般不溶于水 2.無(wú)甜味 3.不能形成結(jié)晶 4.無(wú)還原性和變旋現(xiàn)象多糖的藥理作用polysaccharide抗腫瘤 抗病毒 降血糖 抗炎 抗補(bǔ)體電泳技術(shù)層析技術(shù)多糖的電泳技術(shù)多糖分子在一定pH值的緩沖體系中也會(huì)解離帶電，帶電的離子在電場(chǎng)的作用下向一定的方向泳動(dòng)，電荷和分子大小決定了分子泳動(dòng)速率，根據(jù)泳動(dòng)速率的不同即可分離多糖。多糖研究中用到的電泳方法主要有紙電泳、醋酸纖維膜電泳、凝膠電泳、毛細(xì)管電泳四種。多糖電泳技術(shù)

2、的原理多糖的電泳技術(shù)紙電泳紙電泳原理紙電泳是根據(jù)電泳現(xiàn)象在滲透了緩沖液的紙上加上電場(chǎng)使物質(zhì)移動(dòng)的電泳技術(shù)，根據(jù)支持物材質(zhì)不同可分為濾紙電泳和玻璃纖維紙電泳兩種。電泳采用的緩沖液以硼酸鹽較普遍，因糖類物質(zhì)中的相鄰羥基易與硼酸離子結(jié)合，生成硼酸復(fù)鹽，增加了電導(dǎo)性。多糖的電泳技術(shù)紙電泳濾紙電泳操作步驟濾紙電泳操作步驟8cm24cm濾紙條載玻片線形點(diǎn)樣400V電泳2小時(shí)乙醇固定高碘酸溶液70%乙酸溶液沖洗亞硫酸品紅 30min，糖處呈現(xiàn)紫紅色玻璃纖維紙電泳操作步驟玻璃纖維紙電泳操作步驟5cm20cm玻璃纖維紙800V電泳40分鐘自然晾干，茴香胺硫酸溶液噴霧染色100烘烤15分鐘顯棕黃色載玻片線形點(diǎn)樣多

3、糖的電泳技術(shù)醋酸纖維膜電泳醋酸纖維膜電泳的原理醋酸纖維素膜電泳是以醋酸纖維素膜為介質(zhì)，其電泳原理與紙電泳基本相同。醋酸纖維素是纖維素的醋酸酯，由纖維素的羥基經(jīng)乙酰化而成，溶于丙酮后可涂布成均一的微孔薄膜，即醋酸纖維素膜。多糖的電泳技術(shù)醋酸纖維膜電泳醋酸纖維膜電泳操作步驟2cm8cm醋酸纖維薄膜緩沖液取出膜條夾在兩層濾紙內(nèi)吸去多余的緩沖液浸泡15min1mm5mm薄膜浸漬樣品溶液約1L緊貼在離膜條一端2cm處點(diǎn)樣250V，電泳20分鐘晾干，甲苯胺藍(lán)溶液染色90%的乙醇漂洗多糖處為藍(lán)色色斑多糖的電泳技術(shù)凝膠電泳凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳淀粉凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電

4、泳（PAGE）多糖的PAGE原理由于多糖的分子量較大，高分離膠的濃度才能使線性酸性多糖分子像球狀蛋白分子一樣在電場(chǎng)的作用下實(shí)現(xiàn)分離，因此分離膠濃度一般選用7.5%8%。多糖復(fù)合物的解離程度較微弱，電荷密度低又具有糖單元不均一性、不對(duì)稱性，以致多糖的電泳帶中呈帶狀分布，帶狀越明顯，說(shuō)明多糖的單元成分和結(jié)構(gòu)就越復(fù)雜。凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）判斷海洋硫酸多糖相對(duì)分子量大小和分布情況1.配制緩沖液（1）分散緩沖液：硼酸3.09g， Tris 6.15 g， EDTA 1.86 g，加水溶解，定容至500 ml（pH 8.3）（2）上層緩沖液：甘氨酸46.92 g， Tris12.12 g

5、，加水溶解，定容至500 ml（3）分離膠緩沖液：丙烯酰胺10 g， 亞甲雙丙烯酰胺1.0 g， 蔗糖7.5g，用pH 8.3分散緩沖液溶解，定容至50 ml（4）濃縮膠緩沖液：丙烯酰胺2.375 g， 亞甲雙丙烯酰胺0.125 g，溶于40 ml分散緩沖液中，用0.1 mol/ L 鹽酸調(diào)pH 6.3，定容至50 ml 2.制膠 （1）分離膠緩沖液6 ml、10%APS 36l、TEMED 6l制成分離膠（2）濃縮膠緩沖液2 ml、10% APS 60l、TEMED 2l制成濃縮膠3.海洋硫酸多糖供試品上樣 CHS1、CHS2、DPS和GAS各上樣6g 凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）

6、200 V、溫度25電泳2小時(shí)0.5%的阿利新藍(lán)溶液水脫色幾種海洋硫酸多糖的PAGE 電泳圖譜均呈帶狀分布從而可看出其相對(duì)分子量呈連續(xù)分布1.CHS2；2.對(duì)照品肝素；對(duì)照品肝素；3.低分子肝素；低分子肝素；4.CHS1；5.DPS；6.GAS凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）譜圖經(jīng)圖象掃描分析軟件處理后可得到數(shù)字化圖譜，求得CHS1、CHS2、DPS 和GAS的相對(duì)分子量分布分別為3 000 10 000、6 200 8200、4 000 7 400、3 100 7 700。凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳的原理多糖的瓊脂糖凝膠電泳也是依據(jù)電荷密度和分子量差異進(jìn)行分離，制膠濃度在0.

7、5%1.2%之間，上樣量35l（約含110g多糖），電泳后用甲苯胺藍(lán)溶液染色，值得注意的是，因甲苯胺藍(lán)不易使中性糖染色，樣品以酸性多糖為宜。幾種多糖電泳技術(shù)的比較電泳技電泳技術(shù)術(shù)電極緩沖液電極緩沖液染色劑染色劑指指示示劑劑脫色劑脫色劑濾紙電泳硼酸鹽緩沖液（pH10.0）高碘酸西夫試劑+亞硫酸品紅溶液無(wú) 70%乙酸+亞硫酸鹽沖洗液玻璃纖維紙電泳0.025mol/L硼酸鹽緩沖液（pH10.2）p-茴香胺硫酸試劑無(wú) 無(wú)醋酸纖維膜電泳硼酸鹽緩沖液（pH12.5）0.5%甲苯胺藍(lán)溶液無(wú) 90%乙醇或1%醋酸聚丙烯酰胺凝膠電泳Tris-HCL緩沖液，pH9.1高碘酸西夫試劑、麝香草酚溶劑混合物或0.1%阿

8、利新藍(lán)溴酚藍(lán)用阿利新藍(lán)染色時(shí)用7%醋酸、0.6mol/HCL漂洗瓊脂糖凝膠電泳0.06 mol/L巴比妥緩沖液或0.05mol/L乙二胺緩沖液（pH8.5）0.1%甲苯胺藍(lán)溶液無(wú) 醋酸：乙醇：水=0.1:5:5其他多糖電泳技術(shù)毛細(xì)管電泳的原理毛細(xì)管電泳（CE）具有快速、高效和高靈敏度、所需樣品少等特點(diǎn)。CE是以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分之間分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的液相分離技術(shù)。毛細(xì)管電泳主要用于分析多糖中的單糖組分。其操作的一般過(guò)程為水解多糖樣品，水解產(chǎn)物與混合標(biāo)準(zhǔn)多糖分別進(jìn)行衍生化反應(yīng)，然后取產(chǎn)物進(jìn)入高效毛細(xì)管電泳分析，得出的樣品圖譜和標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行比對(duì)。另外兩

9、種常用的多糖電泳技術(shù)1 mol/L H2SO4 1 mL 100封管水解10mg GBSP 6小時(shí)，冷卻后，3000 r/min離心5 min，取上清液，BaCO3中和5000 r/min離心10 min，取上清50L 待衍生。取樣品上清50L 和標(biāo)準(zhǔn)單糖各10 mg，加入40L 衍生劑，80 衍生1小時(shí)，加500L 三氯甲烷及500L 雙蒸水，混勻，6000 r/min離心15分鐘，取上清用于高效毛細(xì)管電泳分析。電泳緩沖液為pH10.2 的50 mmol/L硼砂緩沖液，電壓16 kV，毛細(xì)管：50m （id）27cm；UV：254nm。1.L-鼠李糖；鼠李糖；2.葡萄糖；葡萄糖；3.4-D-

10、甘露糖；甘露糖；4.D-半乳糖；半乳糖；5.GBSP如銀杏白果多糖（GBSP）的成分分析另外兩種常用的多糖電泳技術(shù)等電聚焦電泳是PAGE電泳的一種特殊方法，以兩性電解質(zhì)為載體，在電場(chǎng)中逐步形成pH梯度，電泳時(shí)把具有兼性離子電解質(zhì)的生物樣品聚焦，達(dá)到等電狀態(tài)相應(yīng)有效pH梯度時(shí)，利用凝膠的抗對(duì)流作用使其不被擴(kuò)散，達(dá)到分離目的。在多糖分離中針對(duì)的是酸性多糖樣品，根據(jù)酸性多糖解離度不同而實(shí)現(xiàn)分離。等電聚焦電泳的原理多糖的層析技術(shù)層析技術(shù)是利用混合物中各組分的理化性質(zhì)（吸附力、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力、分配系數(shù)等）的差異，造成混合物中各組分距離不等的遷移，從而達(dá)到分離的目的。多糖研究中常用的

11、有紙層析、柱層析。層析層析技術(shù)技術(shù)吸附吸附力力分子分子親和親和力力分配分配系數(shù)系數(shù)分子分子形狀形狀和大和大小小分子分子極性極性多糖的層析技術(shù)紙層析多糖經(jīng)酸（硫酸或鹽酸）水解成單糖，再進(jìn)行紙層析（1）常用的溶劑系統(tǒng)粘多糖：0.067mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.4）直鏈淀粉：75%異丙醇（V/V）：乙醇=9：1（V/V）（2）斑點(diǎn)的檢出1）鑒定直鏈淀粉用苯胺一鄰苯二甲酸試劑2）鑒定還原性多糖用Sornogyi試劑3）鑒定粘多糖用甲苯胺藍(lán)試劑4）鑒定淀粉用1%碘乙醇溶液多糖的層析技術(shù)柱層析纖維素柱層析陰離子交換柱層析凝膠柱層析親和層析氣相層析高效液相層析柱層析 纖維素柱層析纖維素柱層析中的載體是

12、纖維素。先用乙醇液將柱內(nèi)纖維素平衡好，然后多糖混合物沉淀于惰性的纖維素上面。用不同濃度乙醇水溶液（如80%，60%，40% ，20%）階梯洗脫，不同多糖就依次洗脫出來(lái)。先洗脫的是分子量最小的多糖，最終洗脫的是分子量最大的多糖。纖維素柱層析的原理柱層析陰離子交換柱層析陰離子交換柱層析的原理陰離子交換柱層析適合于分離各種酸性、中性多糖及粘多糖，是目前多糖純化中應(yīng)用最普遍的一種方法，特別是對(duì)于體積較大的多糖溶液，大多首先采用陰離子交換柱層析進(jìn)行濃縮及初步純化柱層析陰離子交換柱層析常用的陰離子交換劑DEAE-纖維素DEAE-葡聚糖DEAE-瓊脂糖多糖的分離純化（1）流速過(guò)慢（2）柱床高度會(huì)隨緩沖液濃度

13、及pH的改變而改變（3）穩(wěn)定性差（4）使用壽命短原因在于：化學(xué)穩(wěn)定性好、流速快的Sepharose FF柱層析陰離子交換柱層析DEAE-32纖維素柱層析分析蟲(chóng)草多糖組分DEAE-32 纖維素層析柱的制備：DEAE-32 纖維素粉溶脹漂洗3 次 1mol/L NaOH浸泡4h 蒸餾水洗至中性 1mol/L HCl 浸泡4h 蒸餾水洗至中性重復(fù)35 次裝柱平衡加樣洗脫（速度為5ml/10min）冬蟲(chóng)夏草胞外多糖蒸餾水洗脫曲線冬蟲(chóng)夏草胞外多糖蒸餾水洗脫曲線 冬蟲(chóng)夏草胞內(nèi)多糖蒸餾水洗脫曲線冬蟲(chóng)夏草胞內(nèi)多糖蒸餾水洗脫曲線柱層析凝膠柱層析一、葡聚糖凝膠 (Sephadex)二、修飾葡聚糖凝膠 (Modif

14、ied Sephadex)三、聚丙烯酰胺凝膠 （Bio-Gel P）四、瓊脂糖類凝膠 （Sepharose ） 五、多孔玻璃微球 (Bio-glas)六、疏水性凝膠（hydrophobic gels） 編號(hào)交聯(lián)度吸液量膨脹速度凝膠孔徑分離限凝膠強(qiáng)度Sephadex GSephadex G150150 小大慢大大小Sephadex GSephadex G 5050 大小快小小大柱層析親和層析某些特定多糖具有和某些專一分子可逆結(jié)合的特性，如刀豆球蛋白能專一地與分支多糖結(jié)合。把ConA作為配基，與不溶性載體結(jié)合使其固定化，裝入色譜柱（親和柱），然后把含有欲分離的多糖溶液作流動(dòng)相，這時(shí)溶液中只有能和配基具有親和力