單鏈抗體A7基因真核表達載體的構建

1、單鏈抗體A 7基因真核表達載體的構建【摘要】 目的 構建抗乙酰膽堿受體主要免疫原區(qū)單鏈抗體A 7基因的真核表達載體，為單鏈抗體A 7基因的真核表達及基因治療重癥肌無力奠定基礎. 方法 應用PCR技術，從已構建的含有抗乙酰膽堿受體主要免疫原區(qū)單鏈抗體A 7基因的重組原核表達載體pHEN 2單鏈抗體A 7上擴增單鏈抗體A 7基因并純化，將純化后的PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoR和Avr雙酶切后，用低熔點瓊脂糖凝膠電泳回收并純化，再與經(jīng)同樣酶切并純化的真核表達載體pPIC 9 K連接，將其產(chǎn)物轉化至大腸桿菌DH 5 后擴增，再用Avr和EcoR酶切和測定序列檢查ScFv A 7基因插入的準確性. 結果 構建pP

2、IC 9 K-ScFv A 7重組載體，經(jīng)序列測定檢查核苷酸序列正確，且ScFv A 7基因準確地克隆至載體開放讀碼框架內(nèi). 結論 成功地構建了抗乙酰膽堿受體主要免疫原區(qū)單鏈抗體A 7基因的真核表達載體. 【關鍵詞】 重癥肌無力；抗體；真核表達載體 ABSTRACT: OBJECTIVE To construct a recombinant eukaryoic expression vector of the single chain variable fragment (ScFv) A 7 of antibody against the main immunogenic region (MI

3、R) of acetylcholine receptor (AChR) for the further eukaryoic expression and the gene therapy in myasthenia gravis (MG). METHODS The ScFv A 7 gene was amplified by PCR from the recombinant prokaryotic expression vector pHEN 2-ScFv A 7, then purified and digested with EcoRand Avr. The digested produc

4、ts were run in low melting point agarose gel eletrophoresis and purified by Wizard PCR Preps DNA Purification System, then ligated into eukaryotic expression vector pPIC 9 K digested and purified by the same method. The recombinant vector pPIC 9 K-ScFv A 7 was transformed into E. coli DH 5 for ampli

5、fication and isolated and digested with Avr and EcoR again. The pPIC 9 K-ScFv A 7 gene was analysed for an insert of the right size by digestion with Avr and EcoR. RESULTS The sequencing showed that the nucleotide sequence of constructed ScFv A 7 was correct and cloned into the open reading frame (O

6、RF) in pPIC 9 K. CONCLUSION The recombinant eukaryoic expression vector pPIC 9 K-ScFv A 7 has been successfully constructed. Key words:myasthenia gravis;antibodies;eukaryotic expression vector 重癥肌無力是抗乙酰膽堿受體（acetylcholine receptor, AchR）抗體介導的器官特異性自身免疫病,AchR是由 2 等5個同源亞單位組成的跨膜糖蛋白1.現(xiàn)已發(fā)現(xiàn),重癥肌無力患者血清中2/3的抗A

7、chR抗體針對的是亞單位的主要免疫原區(qū)的第6776位氨基酸表位2.當致病性抗體與神經(jīng)肌肉接頭處突觸后膜上相鄰2個AchR 亞單位上的主要免疫原區(qū)結合后，通過抗原調(diào)變或激活補體作用使突觸后膜損傷3，AchR數(shù)量減少，結果出現(xiàn)受累肌肉收縮無力及麻痹癥狀4.由抗AchR抗體制備的單鏈抗體（single chain variable fragment，ScFv）作為單價片段，只能與1個亞單位上的主要免疫原區(qū)結合，不引起抗原調(diào)變作用，且單鏈抗體無可結晶片段（Fc），不能激活補體導致AchR損傷.但單鏈抗體與主要免疫原區(qū)結合后，可特異性地封閉抗AchR抗體的結合位點，從而對AchR起到保護作用.本實驗將構

8、建在原核表達載體pHEN 2上的抗AchR主要免疫原區(qū)單鏈抗體A 7（ScFv A 7）基因克隆至真核表達載體pPIC 9 K上，構建了重組真核表達載體. 1 材料與方法 1.1 菌種與載體 腸桿菌DH 5 由荷蘭馬斯特里赫特大學醫(yī)學院神經(jīng)學系神經(jīng)免疫學實驗室提供，載體質(zhì)粒pPIC 9 K由軍事醫(yī)學科學院輸血研究所章金剛教授惠贈，大腸桿菌HB 2151（pHEN 2-ScFv A 7）由本實驗室構建. 1.2 試劑 Wizard Plus Minipreps/ Midipreps Purification System, Wizard PCR Preps DNA Purification Sy

9、stem為美國Promega公司產(chǎn)品，High Fidelty PCR System-5 Kb為華美生物工程公司產(chǎn)品，DL 2000/2000+15000 DNA標志物為日本TAKARA大連分公司產(chǎn)品，限制性核酸內(nèi)切酶EcoR，Avr,T 4 DNA連接酶為美國NEB公司產(chǎn)品，A 7 VH 5和A 7 myc 3引物由上海Sangon生物工程公司合成. 1.3 pHEN 2-ScFv A 7和pPIC 9 K的提取與純化 將-80 保存的大腸桿菌HB 2151（pHEN 2-ScFv A 7）和大腸桿菌DH 5 （pPIC 9 K）各接種于5 mL LB培養(yǎng)基（含100 mg/L Amp）中，

10、37 過夜振蕩培養(yǎng).將培養(yǎng)物分離劃線在LB平板培養(yǎng)基（含100 mg/L Amp）上，37 培養(yǎng)直至長出菌落.分別從平板中挑選單個菌落各接種于100 mL LB培養(yǎng)基（含100 mg /L Amp）中，37 過夜振蕩培養(yǎng).pHEN 2-ScFv A 7和pPIC 9 K的提取及純化分別按Wizard Plus Minipreps DNA Purification System, Wizard Plus Midipreps DNA Purification System試劑盒說明書進行. 1.4 PCR擴增及產(chǎn)物純化 根據(jù)ScFv A 7前10位氨基酸設計A 7 VH 5引物ATGAATTCCC

11、AGGTGCAGCGCAGGAGTCAGGGGGAGGC，根據(jù)ScFv A 7后連接的c-myc的最后8位氨基酸的互補核苷酸序列設計A 7 myc 3引物AACCTAGGATTCAGATCCTCTTCTGAGATG,劃線部分為引入的酶切位點.PCR反應體系如下：在50 L總反應體積中依次加入蒸餾水27.5 L，20×PCR反應緩沖液（氯化鎂-Free）2.5 L，氯化鎂3 L，dNTPs（10 mmol/L）1 L，A 7 VH 5和A 7 myc 3引物（10 mol/L）各1.5 L，pHEN 2-ScFv A 7（0.05 g/L）10 L，Pfu DNA聚合酶1 L（1 U）

12、，Taq DNA聚合酶2 L（2 U），混合后再加入50 L石蠟；10 L蒸餾水代替pHEN 2-ScFv A 7作為陰性對照.反應條件：在PCR儀中進行35次循環(huán)，擴增前94 預變性10 min.每個循環(huán)為94 變性30 s，55 退火60 s，72 延伸45 s.循環(huán)后72 延伸10 min.PCR產(chǎn)物純化按Wizard PCR Preps DNA Purification System試劑盒說明書進行. 1.5 ScFv A 7基因和載體pPIC 9 K的酶切、純化及連接 分別對ScFv A 7和pPIC 9 K進行雙酶切，ScFv A 7的雙酶切反應如下：在50 L的總反應體積中依次加

13、入蒸餾水24 L，10×酶切緩沖液5 L，ScFv A 7（50 mg/L）19 L，Avr（4 MU/L）1 L，EcoR（100 MU/L）1 L，37 反應2 h.pPIC 9 K的雙酶切反應如下：在50 L的總反應體積中依次加入蒸餾水24 L，10×酶切緩沖液5 L，pPIC 9 K（0.175 g/L）15 L，Avr（4 MU/L）5 L，EcoR（100 MU/L）1 L，37 反應2 h.將上述2種酶切產(chǎn)物加樣于10 mLL的低熔點瓊脂糖凝膠板上，在100 V，80 mA條件下電泳1 h.在紫外燈下觀察后迅速將含有目的質(zhì)粒的條帶切下，轉至1.5 mL離心管中

14、，在70 條件下直至瓊脂溶化，加入1 mL樹脂混勻20 s，以下步驟同PCR產(chǎn)物純化.連接反應:在20 L總反應體積中依次加入蒸餾水7 L，10×T 4 DNA連接緩沖液2 L，ScFv A 7（50 mg/L）5 L，pPIC 9 K（0.1 g/L）5 L，T 4 DNA連接酶（400 MU/L）1 L，室溫（2025 ）條件下反應1 h. 1.6 重組載體pPIC 9 K-ScFv A 7轉化大腸桿菌DH 5 按分子生物學常規(guī)操作制備D H 5 感受態(tài)細胞后進行轉化.取100 L感受態(tài)細胞加入20 L連接反應物，冰浴放置30 min，42 條件下熱休克90 s，迅速取出置于冰浴

15、內(nèi)2 min，加入900 L不含Amp的LB培養(yǎng)基，在37 條件下以100 r/min復蘇細菌45 min，在4 條件下以4 000 r/min離心5 min，吸棄800 L上清液，用剩余液體重懸細菌.取20,180 L上述液體分別滴加在2個已鋪好的LB平板培養(yǎng)基（含100 mg /L Amp）上，1214 h后計數(shù)菌落數(shù). 1.7 克隆結果的酶切檢查及序列測定 當培養(yǎng)基上長出菌落后，隨機在平板上挑取菌落并培養(yǎng)擴增，按Wizard Plus Minipreps DNA Purification System試劑盒說明書純化重組質(zhì)粒，純化后的重組質(zhì)粒再經(jīng)EcoR/Avr雙酶切后，行瓊脂糖凝膠電泳

16、檢查，并測定序列，以證實基因是否準確插入. 2 結果 利用PCR方法從pHEN 2-ScFv A 7質(zhì)粒上擴增ScFv A 7基因，同時在兩端引入EcoR和Avr的2個酶切位點，瓊脂糖凝膠電泳檢查顯示約在800 bp處可見清晰條帶（Fig 1）.純化后的PCR產(chǎn)物及載體pPIC 9 K經(jīng)EcoR/Avr雙酶切及低熔點瓊脂糖凝膠電泳回收、純化和連接后，將重組載體轉化D H 5 .挑選陽性克隆用純化試劑盒分離純化重組質(zhì)粒，經(jīng)EcoR/Avr酶切及電泳檢查，確認插入基因的準確性，約在800 bp處可見酶切片段（Fig 2）.構建的pPIC 9 K-ScFv A 7重組載體經(jīng)測定序列檢查證實核苷酸序列

17、正確，ScFv A 7基因準確地插入到pPIC 9 K開放讀碼框架內(nèi)，長度為807 bp. 3 討論 酵母是單細胞低等真核生物，既具有原核生物易于培養(yǎng)、繁殖快、便于基因工程操作和高密度發(fā)酵等特性，同時又具有適合于真核生物基因產(chǎn)物正確折疊的細胞內(nèi)環(huán)境和糖鏈加工系統(tǒng)，還可向培養(yǎng)液中分泌外源蛋白，利于純化5，6.畢赤酵母的高產(chǎn)量是它之所以吸引人們目光的很重要的原因,而Goel等7構建的二價單鏈抗體CC 49經(jīng)實驗證實在畢赤酵母中的表達量是在大腸桿菌中表達量的3040倍.Eldin8等報道，在搖瓶中培養(yǎng)單鏈抗體可獲得250 mg/L水平的產(chǎn)量.Freyre等9在發(fā)酵條件下，利用畢赤酵母表達系統(tǒng)成功地分

18、泌表達了抗癌胚抗原單鏈抗體，獲得了1.2 g/L的單鏈抗體表達水平.由于巴斯德畢赤酵母沒有穩(wěn)定的附加體質(zhì)粒，所以一般用整合型質(zhì)粒作為外源基因的表達載體.本實驗所選用的載體pPIC 9 K是由酵母的部分基因序列和細菌的部分基因序列所組成的，它的原核部分主要包括可在大腸桿菌中復制的起始序列和特定的抗性基因序列，酵母部分包括營養(yǎng)缺陷型選擇標記組氨酸脫氫酶基因（HIS 4）10、抗性選擇標記kanr基因11、來源于醇氧化酶-1（AOX1）基因5端的啟動子序列的0.9 kb片段和來源于AOX 1基因轉錄終止序列的0.9 kb片段、多克隆位點和-因子信號肽序列.pPIC 9 K的多克隆位點上有SnaB，E

19、coR，Avr,Not等4個可供插入的酶切位點，但由于目的基因ScFv A 7上存在酶切位點Not，而SnaB酶切后為平末端，因此本實驗選用了EcoR,Avr的2個酶切位點.在PCR引物設計時目的基因ScFv A 7兩端分別引入了EcoR,Avr酶切位點.實驗選用雙酶切方法可不必考慮在單酶切時為防止載體自身連接和環(huán)化而對其末端再進行磷酸化，也可避免平末端連接困難的問題，同時雙酶切也不必考慮克隆后鑒定外源基因在重組子中的連接方向.連接反應中，目的基因與載體二者比例適合是消除載體自身連接和片段多拷貝準確插入的關鍵，通常以摩爾數(shù)比例計算，插入片段與載體的適合比例為5110112.本實驗中連接反應條件

20、根據(jù)NEB公司的T 4 DNA連接酶使用說明，應用室溫連接反應方法，即室溫條件下在20 L反應體系中加入1 L（400 U）T 4 DNA連接酶反應1 h，插入片段與載體的比例約為51.本實驗將來源于致病性抗AchR單克隆抗體A 7的單鏈抗體ScFv A 7基因克隆至真核表達載體上，成功地構建了重組真核表達載體，以期進一步轉入酵母菌進行真核表達而獲得更高水平的ScFv A 7產(chǎn)量，為重癥肌無力的基因治療奠定了基礎. 【參考文獻】 1 Skerra A, Pluckthun A. Assembly of functional immunoglobulin Fv fragment in Esche

21、richia coliJ.Science,1988,240:1 038.2 Tzartos SJ, Swybold ME, Lindstrom JM.Specificities of antibody to acetylcholine receptors in sera from myasthenia gravis patients measured by monoclonal antibodiesJ.Proc Natl Acad Sci USA,1982,79(1):188.3 Verma R, Boleti E, George AJ.Antibody engineering: compar

22、ison of bacterial, yeast, insect and mammalian expression systemsJ.J Immunol Methods,1998, 216:165.4 Mukherjee KJ, Rowe DC, Watkins NA, et al.Studies of single-chain antibody expression in quiescent Escherichia coliJ.Appl Environ Microbiol,2004,70(5): 3 005.5 Barr PJ, Steimer KS, Sabin EA, et al.Ant

23、igenicity and immunogenicity of domains of the human immunodeficiency virus (HIV) envelope polypeptide expressed in the yeast Saccharomyces cerevisiaeJ.Vaccine,1987,5:90.6 Liu YY, Woo JH, Neville DM.Overexpression of an anti-CD 3 immunotoxin increases expression and secretion of molecular chaperone

24、BiP/Kar2p by Pichia pastorisJ.Appl Environ Microbiol,2005, 71(9):5 332.7 Goel A, Beresford GW, Colcher D, et al.Divalent forms of CC 49 single-chain antibody constructs in Pichia pastoris:expression, purification and characterizationJ.J Biochem,2000,127(5):829.8 Eldin P, Pauza ME, Hieda Y, et al.High-level secretion of two antibody single chain Fv fragments by Pic