乳酸菌作為DNA疫苗載體的研究進(jìn)展.docx

1、乳酸菌作為DNA疫苗載體的研究進(jìn)展劉晶，楊桂連，王春鳳，姜延龍（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院吉林省動(dòng)物微生態(tài)制劑工程研究中心，吉林K春130118）中圖分類號(hào)：Q78史獻(xiàn)標(biāo)志碼：A乳酸菌（lacticacidBacteria,LAB）屬于革蘭陽(yáng)性、兼性厭氧菌，其基因組中GC含量較低，是一類可以利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生乳酸的一類菌的總稱，包括腸球菌、乳桿菌、乳球菌、明串珠菌、片球菌、鏈球菌和雙歧桿菌等眾多種屬，被廣泛地應(yīng)用于食品發(fā)酵、醫(yī)藥生產(chǎn)、保健藥物及飼料添加劑等工業(yè)，美國(guó)食品和藥品監(jiān)督管理局（FDA）將乳酸菌認(rèn)定為安全的食品級(jí)微生物氣乳酸菌最重要的特點(diǎn)是具有高度安全性，已成為一種新型載體氣替代

2、了像病原微生物、脂質(zhì)體和微粒子等各種細(xì)菌的弱毒菌株之類的載體。1乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)乳酸菌作為一種原核表達(dá)系統(tǒng)，在保證機(jī)體安全的前提下，能夠發(fā)揮持續(xù)且高效的免疫力。Pouwels等人的試驗(yàn)表明，乳酸桿菌表達(dá)系統(tǒng)可將外源蛋白表達(dá)于菌體細(xì)胞內(nèi)，且能誘發(fā)針對(duì)該抗原的局部或全身黏膜免疫應(yīng)答，并表明乳酸桿菌作為活菌的疫苗抗原載體能夠表現(xiàn)出較高的安全性。LAB之所以能作為極具應(yīng)用前景的理想抗原呈遞載體，原因有以下幾點(diǎn)：（1）易培養(yǎng)，且某些菌種可構(gòu)建出新的表達(dá)載體系統(tǒng)；（2）遺傳操作方法簡(jiǎn)便、重復(fù)性好且效率高；（3）能保障基因工程產(chǎn)品的相對(duì)安全性，構(gòu)建出可供直接口服的食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)；（4）具有高度可調(diào)控的啟

3、動(dòng)子系統(tǒng)，能表達(dá)毒素基因；（5）外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)外均可獲得良好的表達(dá)效果；（6）能夠有效引起機(jī)體的免疫反應(yīng)和免疫耐受，且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)；（7）乳酸菌安全，表達(dá)的外源蛋白無需進(jìn)行純化，就可直接連同菌體一起服用。收稿日期：2015-08-10基金項(xiàng)目：國(guó)家863計(jì)為項(xiàng)目（2013AA102806.2011AA10A215）;國(guó)家目然科學(xué)基金項(xiàng)目（31272552,31272541）;吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20111816）；吉林省世行貸款農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全項(xiàng)目（2011-Y07）作者簡(jiǎn)介：劉晶（I991-）,女，鎮(zhèn)士生，研究方向動(dòng)物微生態(tài)與黏膜免疫學(xué),E-ail：1558755144通訊作者:姜延龍,

4、E-mail:yjiang81文章編號(hào)：0529-6005（2016）07-0067-022DNA疫苗DNA疫苗又稱核酸疫苗或基因疫苗,是在分子生物學(xué)技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的第3代新型疫苗，其生產(chǎn)過程主要是借助基因重組技術(shù)，定向構(gòu)建含病原體抗原基因片段的重組DNA真核表達(dá)載體。2.1 DNA疫苗的優(yōu)點(diǎn)相對(duì)于原核表達(dá),DNA疫苗最大的優(yōu)點(diǎn)是其可以在遞送病毒或寄生蟲抗原的過程中，對(duì)抗原表位進(jìn)行翻譯后的糖基化加工，這對(duì)某些抗原表位的構(gòu)象非常重要，而原核表達(dá)系統(tǒng)中沒有糖基化過程，因此更適用于原核病原菌。2.2 DNA疫苗的不足作為一種基因調(diào)控手段,DNA疫苗必需攜帶外源基因，外源基因?qū)霗C(jī)體后，存在激活宿

5、主內(nèi)源性原癌基因或使宿主抑癌基因失活的可能性，并且疫苗具有較低的免疫原性同,還能引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗DNA抗體，人彳IJ已檢測(cè)出DNA疫苗并沒有相關(guān)整合到宿主細(xì)胞的基因組。3乳酸菌在DNA疫苗中的作用乳酸菌屬于食品級(jí)的細(xì)菌，其本身可作為DNA疫苗載體，但無侵入能力，因此遞送DNA的能力不強(qiáng)；而一些弱致病菌如減毒沙門菌由于其可侵入到細(xì)胞中，可以更好的遞送1）NA。因此可模擬病原菌的侵入過程，構(gòu)建侵入型重組乳酸菌,使其具有更好的遞送能力。乳酸乳球菌（Lactococcuslaclis）是一種較為典型的乳酸菌，由于其沒有致病性，所以較安全。乳酸乳球菌可以大量產(chǎn)生并遞送抗原及細(xì)胞因子，最近已成為口服DNA疫

6、苗的運(yùn)載工具。為了增加DNA的遞送能力，科研人員對(duì)乳酸菌進(jìn)行了改造以期獲得具有侵入能力的乳酸菌。金黃色葡萄球菌是一種具有侵入宿主細(xì)胞能力的病原菌，研究表明其細(xì)菌表面表達(dá)的纖連蛋白結(jié)合蛋白A（FnBPA）對(duì)其侵入能力至關(guān)重要因此在乳酸乳球菌中表達(dá)外源FnBPA后將使乳球曲-本身獲得侵入細(xì)胞的能力。此外，一種被稱作pValac的新型質(zhì)粒也可在乳酸菌中進(jìn)行表達(dá)，進(jìn)而成為構(gòu)建真核DNA疫苗的一種載體，這種新型質(zhì)粒包括巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子(pCMV)和來自牛生長(zhǎng)激素(BGH)中的聚腺苜酸化序列(polyA)兩個(gè)部分?？蒲腥藛T將含有綠色熒光蛋白(GFP)的pValac質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至PK15及Caco-2細(xì)胞中

7、并獲得了表達(dá)氣由于乳酸乳球菌沒有定植能力，因此只能在黏膜水平上對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行加工傳遞同,并且乳酸乳球菌在體內(nèi)和體外四均能將功能完整的質(zhì)粒遞送到真核細(xì)胞中。為了進(jìn)一步提高乳酸菌的細(xì)胞侵入能力，科研人員在乳酸乳球菌中表達(dá)了外源蛋白FnBPA和InIA(產(chǎn)單核細(xì)胞內(nèi)化蛋白)，并通過體內(nèi)試驗(yàn)和體外試驗(yàn)檢測(cè)FnBPA及InIA的表達(dá)情況。試驗(yàn)結(jié)果表明，外源侵入型蛋白的表達(dá)有效增強(qiáng)了乳酸菌的細(xì)胞侵入能力。DanielaPontes和SilviaInnocenlin等人已證明了表達(dá)FnBPA的乳酸萌萌株FnBPA+是體內(nèi)傳遞質(zhì)粒的最佳選擇載體，而且不管是在體內(nèi)的胃腸道中還是在體外細(xì)胞中，表達(dá)了FnBPA或In

8、IA的乳酸乳球菌都能提高質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移效率叫。乳酸菌中另一典型的菌種則是乳桿菌屬中的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，此菌具有免疫調(diào)節(jié)作用，同時(shí)具有佐劑的特性四。之前有研究表明，植物乳桿萌能夠?qū)︶t(yī)學(xué)上重要的蛋白質(zhì)進(jìn)行改進(jìn)，并且能夠以多種方式對(duì)其進(jìn)行表面錨定。由于乳酸菌能夠?qū)DNA遞送到宿主細(xì)胞，因此為了提高乳酸菌遞送DNA的能力，MichonChristophe和KatarzynaKuczkowska等人頃構(gòu)建了表面錨定表達(dá)針對(duì)DEC-205的重組單鏈抗體(aDec)的植物乳桿茜。DEC-205是位于樹突狀細(xì)胞(dendriticcells,DCs)表面的一個(gè)受體。其特

9、異性抗體在乳桿菌表面表達(dá)能增強(qiáng)乳桿菌對(duì)DC的靶向作用及結(jié)合能力，從而提高cDNA向DC的傳遞能力。無論是在體外的細(xì)胞中還是在體內(nèi)的胃腸道中，aDec在菌種表面上的表達(dá)都能提高質(zhì)粒由乳酸菌進(jìn)入到樹突狀細(xì)胞的傳遞效率。針對(duì)上述對(duì)乳酸乳球菌和植物乳桿菌的介紹，可見構(gòu)建一種侵入型的乳酸菌，使其作為DNA疫苗的載體，這對(duì)DNA疫苗傳遞載體的選擇至關(guān)重要。4乳酸菌作為DNA疫苗載體的優(yōu)勢(shì)使用乳酸菌作為DNA疫苗載體具有以下幾點(diǎn)優(yōu)勢(shì)：(1)門服DNA疫苗載體能夠通過誘導(dǎo)局部的IgA免疫反應(yīng)產(chǎn)生特異性保護(hù)對(duì)抗食物過敏;(2)與裸質(zhì)粒DNA的免疫進(jìn)行對(duì)比,不需要進(jìn)一步的質(zhì)粒擴(kuò)增和純化，能夠降低成本和勞動(dòng)；(3)

10、乳酸菌是食品級(jí)的細(xì)菌，與類似的傳遞病原體的系統(tǒng)相比，能傳遞只編碼所需抗原的基因；(4)可避免像減毒沙門細(xì)菌作為疫苗載體的一些缺點(diǎn)。5展望自從乳酸菌的第一次報(bào)道至今已有20多年歷史，關(guān)于乳酸前作為疫苗載體的許多研究均有報(bào)道。大多數(shù)研究者使用乳酸菌作為外源蛋白載體對(duì)人體進(jìn)行免疫，從而抵抗通過消化道和呼吸道黏膜進(jìn)入人體內(nèi)的病原體。由于DNA疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比沒有主動(dòng)侵入性，是一個(gè)依賴載體的被動(dòng)俘獲過程，因此可模擬病原菌的侵入過程，從而能更好的將DNA遞送到細(xì)胞內(nèi)?？梢娙樗峋鳛镈NA疫苗載體具有很好的研究?jī)r(jià)值叫，將會(huì)成為未來研究熱點(diǎn)。參考文獻(xiàn)：(1 任晟誠(chéng)，艾春育，張秋香，等.乳酸萌作為黏膜重組疫苗

11、呈遞載體的研究進(jìn)展UL食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào).2014.5(4)：983-989.(2 AgnieszkaWyszyfiska,PalrycjaKobierecka,JacekBardowski,elal.lacticacidbacteria-20yearsexploringtheirpotentialaslivevectorsformucosalvaccinationJ.ApplMicrobiolBiotechno!,2015,99:2967-2977.3J郭衍冰.樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)肽重組NDVHN基因乳酸菌的制備及免疫效果檢測(cè)DJ.長(zhǎng)春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),2014.|4SidgiSyedAnwerA

12、bdoHasson,JumaKhalifaZayidAl-Busaidi,TalalAbdulmalekSallam.Thepast.currentandfuturetrendsinDNAvaccineimmunizations.AsianPacJTropBiomed,2015.5(5):344-353.5|SheetsRL,SteinJ,ManctzTS,elal.BiodistributionofDNAPlasmidVaccinesagainstHIV-1,Ebola,SevereAcuteRespiratorySyndrome,orWestNileVirusIsSimilar.witho

13、utIntegration,DespiteDifferingPlasmidBackbonesorGeneInsertsJ.ToxicologicalSciences,2006,91:610-619.6VanessaBastosPereira.TessdliaDinizLuerceSaraiva,BiancaMendesSouza.DcvelopmenlofanewDNAvaccinebasedonmycobacterialESAT-6antigendeliveredbyrecombinantinvasiveLactococcuslactisFnBPA+J.ApplMicrobiolBiotec

14、hnol.2015,99:1817-1826.|7GuiniarSesV,InnocentinS,ChatelJM,eta/.AnewplasmidvectorforDNAdeliveryusinglactococcifj.GenetVaccinesTher,2009,7:1-24.|8|WellsJM,MercenierA.Mucosaldeliveryoftherapeuticandprophylacticmoleculesusinglacticacidbacteria|J.NatKevMicrobiol,2008.6:349-362.9ChatelJM,PotheluneL,.：lung

15、S,etal.Invivotransferofplasmidfromfood-gradetransitinglactococcitomurineepithelialceilsfJl.GeneTher,2008,15：1184-1190.糖皮質(zhì)激素和非留體類抗炎藥在犬白內(nèi)障術(shù)后的使用楊星，董軼（北京芭比堂動(dòng)物醫(yī)院，北京海淀100039）中圖分類號(hào):R779.6文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B白內(nèi)障是導(dǎo)致犬失明原因之一，目前國(guó)內(nèi)治療犬白內(nèi)障惟一有效且效果顯著的方法是白內(nèi)障超聲乳化術(shù)。通常術(shù)后眼內(nèi)會(huì)繼發(fā)不同程度的炎癥，使用抗炎類藥物可以加快炎癥消褪，目前局部使用糖皮質(zhì)激素和非笛體類藥物是治療犬白內(nèi)障術(shù)后眼內(nèi)炎癥的主要

16、藥物。1材料與方法全部病例來自北京芭比堂動(dòng)物醫(yī)院2013年1月-12月手術(shù)病例，共計(jì)74例（118只眼），其中；公犬46例，母犬28例，發(fā)病年齡8個(gè)月-12歲，平均發(fā)病年齡4.8歲，發(fā)病時(shí)間1個(gè)月-24個(gè)月，平均發(fā)病時(shí)間4.1個(gè)月。選取確診為白內(nèi)障并進(jìn)行手術(shù)的74個(gè)病例（118H眼），術(shù)前患眼進(jìn)行全面的檢查，包括眼壓、熒光素鈉染色、裂隙燈檢查（檢查房水閃輝情況）及視網(wǎng)膜功能檢查（ERG）o在手術(shù)前2h動(dòng)物需使用妥布霉素地塞米松滴眼液和雙氯芬酸鈉滴眼液點(diǎn)眼，每30min重復(fù)使用一次控制眼內(nèi)炎癥并同時(shí)使用復(fù)方托毗卡胺滴眼液點(diǎn)眼進(jìn)行散瞳。丙泊酚誘導(dǎo)麻醉，異氟烷維持麻醉，動(dòng)物仰臥保定固定頭部，術(shù)部剃毛

17、消毒，于角鞏膜緣12點(diǎn)位置做3.2mm切口，前房注入黏彈劑重建前收稿日期：2015-08-19作者簡(jiǎn)介：楊星（1983-），男，獸醫(yī)師，本科，從事小動(dòng)物臨床工作，E-mail：vetyangl166通訊作者：蕾軼，E-mail:dydvm文章編號(hào)：0529-6005（2016）07-0。69-02房，用撕囊鑲在晶狀體前囊做環(huán)形撕囊，持超聲手柄將晶狀體乳化，注吸出晶狀體核，抽吸晶狀體皮質(zhì)后植入人工晶狀體，用8/0可吸收縫合線結(jié)節(jié)縫合方式閉合切口，全部118只眼均采用超聲乳化聯(lián)合人工晶狀體植入術(shù)（均由同一位醫(yī)生完成）。術(shù)后仍以妥布霉素地塞米松滴眼液和雙氯芬酸納滴眼液為主要抗炎藥控制眼內(nèi)炎癥，每天3

18、4次，分別于術(shù)后的2、12h,l、2、3d及7d用裂隙燈檢查房水閃輝（aqueousflare）現(xiàn)象，并按照（清具體說明分級(jí)方法的名稱，然后注明參考文獻(xiàn)號(hào)）參考文獻(xiàn)1分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)將房水閃輝分為5級(jí)，即0、1+、2+、3+、4+。2結(jié)果全部74例（118只眼）術(shù)后一周使用糖皮質(zhì)激素和非留體類抗炎藥治療眼內(nèi)炎癥效果見表1、圖1,由圖1可見，術(shù)后第3天，0、1+眼數(shù)略有升高，2+、3+眼數(shù)略有降低。術(shù)后第7天與術(shù)后第3天相比較0、1+眼數(shù)有顯著升高，2+、3+眼數(shù)有顯著降低。因此犬白內(nèi)障術(shù)后使用糖皮質(zhì)激素和非帶體類抗炎藥治療眼內(nèi)炎癥效果良好，眼內(nèi)炎癥得到有效抑制，房水閃輝得到明顯改善。3討論白內(nèi)障超聲乳化術(shù)后眼內(nèi)炎癥的主要原因是手術(shù)過程中機(jī)械刺激與損傷，以及植入眼內(nèi)的人工晶狀體異物反應(yīng)和殘存的晶狀體上皮細(xì)胞等110PontesD,InnocentinS,delCarmenS,etal.ProductionofFibronectinBindingProteinAattheSurfaceofLactococcuslactisIncreasesPlasmidTransferInVitroandInVivo(J.PLoSONE,2012,7(9)：e44892.11 PontesD,AzevedoM,Innoc