PCR技術克隆目的基因全過程

1、試驗：目的基因克?。≒CR技術） 【課前預習】 PCR (polymerase chain reaction) 反應的基本原理。 【目的要求】 1學習和把握 PCR 反應的基本原理與試驗技術方法。 2認真完成每一步試驗操作，具體記錄試驗現(xiàn)象和結果并加以分析和總結。 【基本原理】 類似于 DNA 的自然復制過程，其特異性依靠于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR 由變性-退火-延長三個基本反應步驟構成：模板 DNA的變性：模板 DNA 經(jīng)加熱至93左右肯定時間后，使模板 DNA雙鏈或經(jīng) PCR 擴增形成的雙鏈DNA 解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作預備；模板 DNA 與引物的

2、退火(復性)：模板 DNA 經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板 DNA 單鏈的互補序列配對結合；引物的延長：DNA 模板-引物結合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板 DNA 鏈互補的半保留復制鏈重復循環(huán)變性-退火-延長三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需 24 分鐘，23 小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。 【試驗用品】 1材料：重組質粒DNA作為模板 2器材和儀器：移液器

3、及吸頭，硅烷化的 PCR 小管，DNA擴增儀(PE 公司)，瓊脂糖凝膠電泳所需設備(電泳槽及電泳儀)，臺式高速離心機 3試劑： 10×PCR 反應緩沖液：500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris·Cl, 在 25下, pH9.0, 1.0 Triton X-100。 MgCl2 ：25mmol/L。 4 種 dNTP 混合物:每種 2.5mmol/L。 Taq DNA聚合酶 5U/l。 T4 DNA連接酶及連接緩沖液： 【方法步驟】 （一）PCR反應 1. 依次混勻下列試劑 35l H2 O 5l 10×PCR反應緩沖液 4l 25mmol/L

4、MgCl2 4l 4種dNTP 0.5l 上游引物（引物） 0.5l 下游引物（引物） 0.5l 模板DNA(約1ng) 混勻后離心5秒。 2. 將混合物在94下加熱5分鐘后冰冷,快速離心數(shù)秒, 使管壁上液滴沉至管底,加入Taq DNA聚合酶（0.5l約2.5U），混勻后稍離心,加入一滴礦物油掩蓋于反應混合物上。 3. 用94變性1分鐘，45退火1分鐘, 72延長2分鐘, 循環(huán)35輪,進行PCR。最終一輪循環(huán)結束后, 于72下保溫10分鐘，使反應產(chǎn)物擴增充分。 4 電泳 按前所述,取10l擴增產(chǎn)物用1瓊脂糖凝膠進行電泳分析,檢查反應產(chǎn)物及長度。 留意 1. PCR格外靈敏, 操作應盡可能在無菌

5、操作臺中進行。 2. 吸頭、離心管應高壓滅菌, 每次吸頭用畢應更換, 不要相互污染試劑。 3. 加試劑前, 應短促離心10秒鐘, 然后再打開管蓋, 以防手套污染試劑及管壁上的試劑污染吸頭側面。 4. 應設含除模板DNA全部其它成分的負對比。 【試驗結果】 【留意事項】 微量操作、PCR 反應體系的設計、引物設計、擴增條件的優(yōu)化 【思考題 】 1. 降低退火溫度對反應有何影響？ 2. 延長變性時間對反應有何影響？ 3. 循環(huán)次數(shù)是否越多越好？為何？ 4. PCR有哪些用途？舉例說明。 附：PCR學問(供參考) （一）PCR 反應體系與反應條件 標準的 PCR 反應體系： 10×擴增緩沖

6、液 10ul 4 種 dNTP 混合物 各 200umol/L 引物 各 10100pmol 模板DNA 0.12ugTaq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加雙或三蒸水至 100ul PCR 反應五要素： 參與 PCR 反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和 Mg2+ 引物： 引物是 PCR 特異性反應的關鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理 論上，只要知道任何一段模板 DNA序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用 PCR 就可將模板DNA在體外大量擴增。 設計引物應遵循以下原則： 引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右

7、。 引物擴增跨度： 以 200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至 10kb 的片段。 引物堿基：G+C 含量以 40-60%為宜，G+C 太少擴增效果不佳，G+C 過多易消滅非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避開5 個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 避開引物內部消滅二級結構，避開兩條引物間互補，特殊是 3端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。 引物 3端的堿基，特殊是最末及倒數(shù)其次個堿基，應嚴格要求配對，以避開因末端堿基不配對而導致 PCR 失敗。 引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。 引物的特異性：引物應

8、與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。 引物量： 每條引物的濃度 0.11umol 或 10100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。 酶及其濃度： 目前有兩種 Taq DNA聚合酶供應， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的自然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的 PCR 反應約需酶量 2.5U(指總反應體積為 100ul 時)，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量削減。 dNTP 的質量與濃度：dNTP 的質量與濃度和 PCR 擴增效率有親密關系，dNTP 粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物

9、學活性。dNTP 溶液呈酸性，使用時應配成高濃度后，以 1M NaOH 或 1M Tris。HCl的緩沖液將其 PH調整到 7.07.5，小量分裝，-20冰凍保存。多次凍融會使 dNTP 降解。在 PCR 反應中，dNTP 應為 50200umol/L， 尤其是留意 4 種 dNTP 的濃度要相等( 等摩爾配制)， 如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。濃度過低又會降低 PCR 產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP 能與 Mg2+結合，使游離的 Mg2+濃度降低。 模板(靶基因)核酸：模板核酸的量與純化程度，是 PCR 成敗與否的關鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的 DNA 純化方法通常接受 SDS

10、 和蛋白酶 K 來消化處理標本。SDS 的主要功能是： 溶解細胞膜上的脂類與蛋白質，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質結合而沉淀；蛋白酶 K 能水解消化蛋白質，特殊是與 DNA 結合的組蛋白，再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR 反應。一般臨床檢測標本，可接受快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離，直接用于 PCR 擴增。RNA 模板提取一般接受異硫氰酸胍或蛋白酶K 法，要防止 RNase降解 RNA。Mg2+ 濃度： Mg2+ 對 PCR 擴增的特異性和產(chǎn)量

11、有顯著的影響，在一般的 PCR 反應中，各種 dNTP 濃度為 200umol/L時，Mg2+濃度為 1.52.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應特異性降低，消滅非特異擴增，濃度過低會降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反應產(chǎn)物削減。 PCR 反應條件的選擇 PCR 反應條件為溫度、時間和循環(huán)次數(shù)。 溫度與時間的設置： 基于 PCR 原理三步驟而設置變性-退火-延長三個溫度點。在標準反應中接受三溫度點法，雙鏈 DNA 在 9095變性，再快速冷卻至 40 60，引物退火并結合到靶序列上，然后快速升溫至 7075，在 Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延長。對于較短靶基因(長

12、度為 100300bp 時)可接受二溫度點法， 除變性溫度外、退火與延長溫度可合二為一，一般接受 94變性，65左右退火與延長(此溫度 Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。 變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不完全是導致 PCR 失敗的最主要緣由。一般狀況下，9394lmin足以使模板 DNA變性，若低于 93則需延長時間，但溫度不能過高，由于高溫環(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或 PCR 產(chǎn)物完全變性，就會導致 PCR 失敗。 退火(復性)溫度與時間：退火溫度是影響 PCR 特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至 4060，可使引物和模板發(fā)生結合。由于模板 DNA 比引物簡單得

13、多，引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于 20 個核苷酸，G+C 含量約 50%的引物，55為選擇最適退火溫度的起點較為抱負。引物的復性溫度可通過以下公式掛念選擇合適的溫度： Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)2(A+T) 復性溫度=Tm值-(510) 在Tm值允許范圍內， 選擇較高的復性溫度可大大削減引物和模板間的非特異性結合，提高 PCR 反應的特異性。復性時間一般為3060sec，足以使引物與模板之間完全結合。 延長溫度與時間：Taq DNA聚合酶的生物學活性： 7080 150核苷酸/S/酶

14、分子 70 60 核苷酸/S/酶分子 55 24 核苷酸/S/酶分子 高于90時， DNA合成幾乎不能進行。 PCR 反應的延長溫度一般選擇在 7075之間，常用溫度為 72，過高的延長溫度不利于引物和模板的結合。PCR 延長反應的時間，可依據(jù)待擴增片段的長度而定，一般 1Kb以內的DNA片段，延長時間1min是足夠 的。34kb 的靶序列需 34min；擴增 10Kb 需延長至 15min。延進步間過長會導致非特異性擴增帶的消滅。對低濃度模板的擴增，延長時間要稍長些。 循環(huán)次數(shù)：循環(huán)次數(shù)打算 PCR 擴增程度。PCR 循環(huán)次數(shù)主要取決于模板 DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在 3040 次之間

15、，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。 PCR 反應特點特異性強 PCR 反應的特異性打算因素為： 引物與模板 DNA 特異正確的結合； 堿基配對原則； Taq DNA 聚合酶合成反應的忠實性； 靶基因的特異性與保守性。 其中引物與模板的正確結合是關鍵。引物與模板的結合及引物鏈的延長是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應的忠實性及 Taq DNA 聚合酶耐高溫性，使反應中模板與引物的結合(復性)可以在較高的溫度下進行，結合的特異性大大增加，被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。靈敏度高 PCR 產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能

16、將皮克(pg=10 -12 g)量級的起始待測模板擴增到微克(ug=10 -6 g)水平。能從100 萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，PCR 的靈敏度可達 3 個 RFU(空斑形成單位)；在細菌學中最小檢出率為 3 個細菌。 簡便、快速 PCR 反應用耐高溫的 Taq DNA 聚合酶，一次性地將反應液加好后，即在 DNA 擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延長反應，一般在 24 小時完成擴增反應。擴增產(chǎn)物一般用電泳分析，不肯定要用同位素，無放射性污染、易推廣。 對標本的純度要求低 不需要分別病毒或細菌及培育細胞，DNA 粗制品及總 RNA均可作為擴增模板?？芍苯佑门R床標本如血液、體腔液

17、、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等粗制的 DNA 擴增檢測。 PCR 擴增產(chǎn)物分析 PCR 產(chǎn)物是否為特異性擴增 ，其結果是否精確牢靠，必需對其進行嚴格的分析與鑒定，才能得出正確的結論。PCR產(chǎn)物的分析，可依據(jù)爭辯對象和目的不同而接受不同的分析方法。 凝膠電泳分析：PCR產(chǎn)物電泳，EB 溴乙錠染色紫外儀下觀看，初步推斷產(chǎn)物的特異性。PCR產(chǎn)物片段的大小應與估計的全都，特殊是多重 PCR，應用多對引物，其產(chǎn)物片斷都應符合預訐的大小，這是起碼條件。 瓊脂糖凝膠電泳： 通常應用 12%的瓊脂糖凝膠，供檢測用。 聚丙烯酰胺凝膠電泳：610%聚丙烯酰胺凝膠電泳分別效果比瓊脂糖好，條帶比較集中，可用于科研及檢

18、測分析。 酶切分析：依據(jù) PCR 產(chǎn)物中限制性內切酶的位點，用相應的酶切、電泳分別后，獲得符合理論的片段，此法既能進行產(chǎn)物的鑒定，又能對靶基因分型，還能進行變異性爭辯。 分子雜交：分子雜交是檢測 PCR 產(chǎn)物特異性的有力證據(jù)，也是檢測 PCR 產(chǎn)物堿基突變的有效方法。 Southern 印跡雜交： 在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈(內部寡核苷酸)標記后做探針，與 PCR 產(chǎn)物雜交。此法既可作特異性鑒定，又可以提高檢測PCR 產(chǎn)物的靈敏度，還可知其分子量及條帶外形，主要用于科研。 斑點雜交： 將 PCR 產(chǎn)物點在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上，再用內部寡核苷酸探針雜交，觀看有無著色斑點，主要用于 PC

19、R 產(chǎn)物特異性鑒定及變異分析。 核酸序列分析：是檢測 PCR 產(chǎn)物特異性的最牢靠方法。 PCR 常見問題總結 PCR 產(chǎn)物的電泳檢測時間一般為 48h 以內，有些最好于當日電泳檢測，大于 48h 后帶型不規(guī)章甚致消逝。 假陰性，不消滅擴增條帶 PCR 反應的關鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備，引物的質量與特異性，酶的質量及活性 PCR循環(huán)條件。查找緣由亦應針對上述環(huán)節(jié)進行分析爭辯。 模板：模板中含有雜蛋白質，模板中含有 Taq 酶抑制劑，模板中蛋白質沒有消化除凈，特殊是染色體中的組蛋白，在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。模板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時，不消滅擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模

20、板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應固定不宜任憑更改。 酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性丟失或不夠而導致假陰性。需留意的是有時忘加 Taq 酶或溴乙錠。 引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是 PCR 失敗或擴增條帶不抱負、簡潔彌散的常見緣由。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：選定一個好的引物合成單位。引物的濃度不僅要看 OD值，更要留意引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，肯定要有引物條帶消滅，而且兩引物帶的亮度應大體全都，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做 P

21、CR 有可能失敗，應和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。引物設計不合理，如引物長度不 夠，引物之間形成二聚體等。 Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對 PCR 擴增效率影響很大，濃度過高可降低 PCR擴增的特異性，濃度過低則影響 PCR 擴增產(chǎn)量甚至使 PCR擴增失敗而不出擴增條帶。 反應體積的轉變：通常進行 PCR 擴增接受的體積為 20ul、30ul、50ul?；?100ul，應用多大體積進行 PCR 擴增，是依據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如 20ul 后

22、，再做大體積時，肯定要模索條件，否則簡潔失敗。 物理緣由：變性對 PCR 擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能消滅假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低 PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延長溫度，這也是PCR失敗的緣由之一。 靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其 PCR 擴增是不會成功的。 假陽性消滅的 PCR 擴增條帶與目的靶序列條帶全都，有時其條帶更整齊，亮度更高。 引物設計不合適： 選擇的擴增序

23、列與非目的擴增序列有同源性， 因而在進行 PCR 擴增時， 擴增出的 PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，簡潔消滅假陽性。需重新設計引物。 靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種緣由：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應當心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外，全部試劑或 器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有肯定的同源性?？上嗷テ唇?，與引物互補后，可擴增出 PC

24、R產(chǎn)物，而導致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR 方法來減輕或消退。 消滅非特異性擴增帶 PCR 擴增后消滅的條帶與估計的大小不全都，或大或小，或者同時消滅特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的消滅，其緣由：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是 Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及 PCR 循環(huán)次數(shù)過多有關。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易消滅非特異條帶而另一來源的酶則不消滅，酶量過多有時也會消滅非特異性擴增。其對策有：必要時重新設計引物。減低酶量或調換另一來源的酶。降低引物量，適當增加模板量，削減循環(huán)次數(shù)。適當提高退火溫度或接受二溫度點法(93變性，65左右退火與延長

25、)。消滅片狀拖帶或涂抹帶 PCR 擴增有時消滅涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其緣由往往由于酶量過多或酶的質量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：削減酶量，或調換另一來源的酶。削減 dNTP的濃度。適當降低 Mg2+濃度。增加模板量，削減循環(huán)次數(shù)。 PCR 污染與對策 PCR 反應的最大特點是具有較大擴增力量與極高的靈敏性，但令人頭痛的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生。 污染緣由 (一) 標本間交叉污染:標本污染主要有收集標本的容器被污染，或標本放置時，由于密封不嚴溢于容器外，或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染;標本核酸模板在提取過程中

26、，由于吸樣槍污染導致標本間污染;有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而集中，導致彼此間的污染。 (二) PCR 試劑的污染:主要是由于在 PCR 試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被 PCR核酸模板污染. (三) PCR擴增產(chǎn)物污染:這是PCR反應中最主要最常見的污染問題， 由于PCR產(chǎn)物拷貝量 大(一般為1013拷貝/ml)，遠遠高于 PCR 檢測數(shù)個拷貝的極限，所以極微量的 PCR 產(chǎn)物 污染，就可造成假陽就可形成假陽性。還有一種簡潔忽視，最可能造成 PCR 產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染;在空氣與液風光摩擦時就可形成氣溶膠，在操作時比較猛烈地搖動反應管，開蓋時、吸樣

27、時及污染進樣槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計算一個氣溶膠顆?？珊?48000 拷貝，因而由 其造成的污染是一個值得特殊重視的問題。 (四) 試驗室中克隆質粒的污染:在分子生物學試驗室及某些用克隆質粒做陽性對比的檢驗室，這個問題也比較常見。由于克隆質粒在單位容積內含量相當高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細胞內的質粒，由于活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力，其污染可能性也很大。 污染的監(jiān)測 一個好的試驗室，要時刻留意污染的監(jiān)測，考慮有無污染是什么緣由造成的污染，以便實行措施，防止和消退污染。 對比試驗 1. 陽性對比:在建立 PCR 反應試驗室及一般的檢驗單位都應設

28、有 PCR 陽性對比，它是PCR 反應是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標志。陽性對比要選擇擴增度中等、重復性好，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標本，如以重組質粒為陽性對比，其含量宜低不宜高(100 個拷貝以下)，但陽性對比尤其是重組質粒及高濃度陽性標本，其對檢測或擴增樣品污染的可能性很大。因而當某一 PCR 試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定，檢驗人員心中有數(shù)時，在以后的試驗中可免設陽性對比。 2. 陰性對比:每次 PCR 試驗務必做陰性對比。它包括標本對比:被檢的標本是血清就用鑒定后的正常血清作對比;被檢的標本是組織細胞就用相應的組織細胞作對比。試劑對比:在 PCR 試劑中不加模板 DNA

29、或RNA，進行 PCR 擴增，以監(jiān)測試劑是否污染。 3. 重復性試驗 4. 選擇不同區(qū)域的引物進行PCR 擴增 防止污染的方法 (一) 合理分隔試驗室:將樣品的處理、配制 PCR 反應液、PCR 循環(huán)擴增及 PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進行，特殊留意樣本處理及 PCR產(chǎn)物的鑒定應與其它步驟嚴格分開。最好能劃分標本處理區(qū);PCR 反應 液制備區(qū);PCR 循環(huán)擴增區(qū);PCR 產(chǎn)物鑒定區(qū)。其試驗用品及吸樣槍應專用，試驗前應將試驗室用紫外線消毒以破壞殘留的DNA 或 RNA。 (二) 吸樣槍:吸樣槍污染是一個值得留意的問題。由于操作時不慎將樣品或模板核酸吸入槍內或粘上槍頭是一個嚴峻的污染源，因而加樣或吸取模板核酸時要格外當心，吸樣要慢，吸樣時盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。