2010省科技腦血管標(biāo)書 222

1、摘要缺血性腦卒中是威脅人類健康的主要疾病，是人口死亡的主要原因之一，目前已經(jīng)公認(rèn)該疾病同時受遺傳和獲得因素的影響，而對獲得因素的控制可以延緩或逆轉(zhuǎn)疾病的發(fā)生和發(fā)展。缺血性腦卒中的發(fā)生涉及動脈粥樣硬化和血栓形成，而與此相關(guān)的三個基因位點(diǎn)亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）、低密度脂蛋白受體（LDLR）和血栓調(diào)節(jié)蛋白（TM）的表達(dá)水平與這兩個過程密切相關(guān)，這些基因的突變已被證實(shí)與缺血性腦卒中相關(guān)。DNA 甲基化修飾是一種使DNA 發(fā)生化學(xué)修飾、無基因序列改變、但可遺傳、可逆的表觀遺傳修飾方式，是表觀遺傳學(xué)的重要研究內(nèi)容之一，表觀遺傳是環(huán)境因素和細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)之間發(fā)生交互作用的結(jié)果。過去研究發(fā)現(xiàn)基因

2、啟動子區(qū)甲基化修飾的改變會影響到基因的表達(dá)水平，從而導(dǎo)致疾病發(fā)生，然而缺血性腦卒中相關(guān)基因啟動子區(qū)甲基化修飾狀況改變是否與缺血性腦卒中形成的相關(guān)，目前未見報道。故本研究擬采用病例對照研究的方法，利用基因測序技術(shù)、甲基化敏感單鏈構(gòu)象分析法（MS-SSCA 方法）和SIRPH 分析技術(shù)對這三個基因啟動子區(qū)的甲基化修飾狀況與缺血性腦卒中的關(guān)系進(jìn)行研究。研究成果將有助于缺血性腦卒中的早期干預(yù)，及尋找新的治療靶點(diǎn)，為深入研究缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制、臨床診斷提供新的視角。四、主要研究開發(fā)內(nèi)容和要達(dá)到的主要技術(shù)、經(jīng)濟(jì)指標(biāo)以及將提供的研究開發(fā)成果及形式1、主要研究開發(fā)內(nèi)容：1缺血性腦卒中患者特定基因甲基化修飾

3、狀況的檢測：以病例對照研究的方法，使用基因測序方法、甲基化敏感單鏈構(gòu)象分析法（MS-SSCA 方法）和SIRPH 分析技術(shù)，并與同步檢測的高血壓組和正常對照組比較，測定啟動子區(qū)的甲基化修飾水平，比較三種方法的可行性和有效性。2分析三種基因的表達(dá)水平，分析動脈粥樣硬化相關(guān)基因亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）、低密度脂蛋白受體（LDLR）和凝血相關(guān)基因血栓調(diào)節(jié)蛋白（TM）啟動子區(qū)的甲基化修飾程度與缺血性腦卒中的相關(guān)性。3綜合啟動子區(qū)甲基化水平與基因表達(dá)水平及患者的臨床表現(xiàn)，開發(fā)出一套較為完善的分子診斷方法。2、要達(dá)到的主要技術(shù)、經(jīng)濟(jì)指標(biāo)：1.完成動脈粥樣硬化相關(guān)基因亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHF

4、R）、低密度脂蛋白受體（LDLR）和凝血相關(guān)基因血栓調(diào)節(jié)蛋白（TM）啟動子區(qū)的甲基化修飾程度與缺血性腦卒中的關(guān)系研究，通過該研究獲得缺血性腦卒中分子診斷的新位點(diǎn)和治療的新靶點(diǎn)，以便使更多患者獲得早期診斷和有效救治，而且能填補(bǔ)我國這方面的研究空白。2.使用基因測序方法、甲基化敏感單鏈構(gòu)象分析法（MS-SSCA 方法）和SIRPH 分析技術(shù)測定該研究基因啟動子區(qū)甲基化修飾水平，比較三種方法的可行性和有效性。3.對缺血性腦卒中的早期診斷和治療將有助于減少我國缺血性腦卒中的致死率和致殘率，減少國家和個人的醫(yī)療費(fèi)用。3、將提供的研究開發(fā)成果及形式：1預(yù)期可獲得我國缺血性腦卒中相關(guān)基因甲基化修飾狀況，以及

5、缺血性腦卒中與MTHFR、LDLR和TM基因DNA 甲基化修飾的關(guān)系，并為缺血性腦卒中的基因診斷和治療提供新方向。2使用基因測序方法、甲基化敏感單鏈構(gòu)象分析法（MS-SSCA 方法）和SIRPH 分析技術(shù)測定啟動子區(qū)的甲基化修飾水平，比較三種方法的可行性和有效性。3成果以論文形式在國家核心刊物上發(fā)表25 篇。一、立項(xiàng)依據(jù)(一)目的和意義本研究從表觀遺傳學(xué)角度，擬采用病例對照研究的方法，利用基因測序技術(shù)、甲基化敏感單鏈構(gòu)象分析法（MS-SSCA 方法）和SIRPH 分析技術(shù)，對缺血性腦卒中與動脈粥樣硬化和血栓形成這兩個病理過程中所涉及的三個相關(guān)基因：亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）、低密度脂蛋

6、白受體（LDLR）和血栓調(diào)節(jié)蛋白（TM）進(jìn)行研究，觀察其編碼基因啟動子區(qū)DNA 甲基化的修飾狀況，并探討其與缺血性腦卒中的相關(guān)性，成果將有助于缺血性腦卒中的早期干預(yù)，及尋找新的治療靶點(diǎn)，本項(xiàng)目將為深入研究缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制、臨床診斷打下基礎(chǔ)。(二)國內(nèi)外概況目前腦血管病已成為我國城市和農(nóng)村人口的第一位致殘和死亡原因，且發(fā)病有逐年增加的趨勢，我國每年有150萬200萬新發(fā)腦卒中病例，其中缺血性腦卒中占全部腦卒中的60%80%，隨著人口老年化和經(jīng)濟(jì)水平的快速發(fā)展及生活方式的變化，缺血性腦卒中發(fā)病率明顯上升，提示以動脈粥樣硬化為基礎(chǔ)的缺血性腦血管?。òǘ虝盒阅X缺血發(fā)作，TIA）發(fā)病率正在增長。

7、全國腦卒中患者直接醫(yī)療費(fèi)用支出年年遞增，與醫(yī)療支出日益增長相對應(yīng)的是腦卒中發(fā)病率不但未降，反而以每年10%的速度遞增1。因此，早期診斷和治療將有助于減少我國缺血性腦卒中的致死率和致殘率，減少國家和個人的醫(yī)療費(fèi)用。缺血性腦血管病是以動脈粥樣硬化為基礎(chǔ)的，目前，研究發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致動脈粥樣硬化的原因很多，其中高半胱氨酸（Hcy）血癥是導(dǎo)致動脈粥樣硬化(AS) 的危險誘發(fā)因素，并增加了腦卒中發(fā)生的風(fēng)險1、2。其致As的機(jī)制包括損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞、促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖、導(dǎo)致氧化應(yīng)激、激活炎癥過程等2。同時血中高半胱氨酸水平還會引起血液的高凝狀態(tài)和增加血小板的聚集性3，參與血栓的發(fā)生4。 Hcy是在肝臟、肌肉及其它

8、一些組織中由蛋氨酸(methionine,Met)脫甲基生成的一種含巰基的氨基酸。在體內(nèi)，Hcy通過蛋氨酸合酶催化的甲基化反應(yīng)可以轉(zhuǎn)化成Met，這種酶促反應(yīng)需甲基四氫葉酸為甲基的供體，后者由亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)催化產(chǎn)生，MTHFR是蛋氨酸代謝中的一個關(guān)鍵酶，該酶活性受其輔酶葉酸、維生素B12的影響。當(dāng)MTHFR活性減低或表達(dá)下降時，出現(xiàn)高半胱氨酸血癥5。MTHFR基因錯義突變也可引起MTHFR缺陷，如熱不穩(wěn)定性及活性降低，其中677位C/T堿基突變最常見。人MTHFR基因定位于染色體1P363上，MTHFR6

9、77C-T突變導(dǎo)致原第222位密碼子所編碼的丙氨酸由纈氨酸替代，該突變位于亞甲基四氫葉酸還原酶N末端的催化區(qū)域，突變造成MTHFR熱不穩(wěn)定，使MTHFR活性下降，從而導(dǎo)致同型半胱氨酸(Hcy)增高6、7。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)：MTHFR基因變異會是導(dǎo)致高同型半胱氨酸血癥，引發(fā)動脈粥樣硬化性疾病，使缺血性腦血管病的患病機(jī)率升高8-11。MTHFR的表達(dá)水平下降必將也導(dǎo)致血漿中同型半胱氨酸水平的升高，從而引發(fā)缺血性腦血管病。MTHFR表達(dá)的下調(diào)會受到多方面的調(diào)控，包括遺傳和后天獲得性因素，其中基因啟動子區(qū)的CpG島的甲基化可能是下調(diào)或關(guān)閉基因轉(zhuǎn)錄的最重要的調(diào)控方式之一。已經(jīng)明確LDL異常在AS發(fā)生中占有

10、舉足輕重的地位，而且膽固醇水平與缺血性腦卒中的關(guān)系很大，有關(guān)LDLR基因突變的研究報道已經(jīng)證實(shí)并顯示其與家族性高膽固醇血癥、AS之間明確的因果關(guān)系，同時近期研究發(fā)現(xiàn)AS病人基因啟動子區(qū)甲基化程度增高, 提示在LDLR基因調(diào)控區(qū)的高甲基化修飾可能參與了AS的發(fā)病12。但有關(guān)LDLR基因啟動子區(qū)的甲基化修飾在缺血性腦卒中病人是否出現(xiàn)異常、及其與缺血性腦卒中的關(guān)系研究卻迄今未見報道。缺血性腦卒中是在動脈粥樣硬化基礎(chǔ)上，當(dāng)不穩(wěn)定斑塊破裂，伴隨凝血/纖溶系統(tǒng)的失衡，表現(xiàn)為凝血功能的升高，纖溶功能的下降，局部血栓形成。血栓調(diào)節(jié)蛋白（thrombomodulin,TM）是近年來新發(fā)現(xiàn)的存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面

11、的糖蛋白，作為凝血酶的受體，它參與蛋白C（PC）活化，在調(diào)控血栓形成及溶解中發(fā)揮重要作用，此外，它還能降解纖溶酶原激活物抑制劑，促進(jìn)纖溶，越來越多的研究表明，動脈粥樣斑塊的發(fā)生、形成及消退等與血栓、凝血系統(tǒng)密切相關(guān)，TM通過結(jié)合凝血酶，可以對抗由其損傷內(nèi)皮引起的促動脈粥樣硬化（AS）作用，因此，作為內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)因子之一，且具有抗血栓形成功能的TM在AS中的作用令人關(guān)注。TM水平表達(dá)變化被發(fā)現(xiàn)與腦梗死發(fā)生有密切關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)急性腦梗死的病人血漿TM濃度與腦梗死的嚴(yán)重度呈負(fù)相關(guān)，1月后的恢復(fù)期血漿TM 濃度較急性期顯著升高13。而老年人腔隙性腦梗死和缺血性白質(zhì)疏松血漿TM顯著增高血清中TM 的濃

12、度檢測有助病人的早期診斷和病情動態(tài)觀察14。國內(nèi)一些研究也表明與凝血功能有關(guān)的血清標(biāo)記物的升高增加了腦血管疾病發(fā)病危險, TM與高血壓一樣是腦血管疾病獨(dú)立危險因素15。近年來TM 基因多個位點(diǎn)的變異與腦血管病的關(guān)系也有較多的報道。有研究發(fā)現(xiàn)TM分子中Ala 25Thr的突變與血栓性疾病和心腦血管疾病有關(guān), 是動靜脈血栓危險因素16。然而，也有研究顯示Ala 25Thr位點(diǎn)變異并非腦血管病主要危險因素17。另有研究發(fā)現(xiàn)C1418T 等位基因變異是卒中的潛在危險，雖然C1418T等位基因變異在亞洲人群較為普遍, 但前者與亞洲人群中腦血管病及血栓形成之間的關(guān)系目前還不明確18。其他研究發(fā)現(xiàn)與腦血管病

13、有關(guān)的變異包括：G21748C 位點(diǎn)突變導(dǎo)致SP-1反應(yīng)元件與結(jié)合部位不相一致, 致使TM的轉(zhuǎn)錄發(fā)生改變；G21166A 突變改變了SSRE 的核心結(jié)合序列而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能異常, 從而增加血栓形成風(fēng)險。但最近有研究報道TM 的G1748C、1208-1209 delTT、C1418T 這三種常見的基因變異與腦梗死的發(fā)病率、卒中后5年的總死亡率及血漿中TM 濃度的關(guān)系均無相關(guān)19。由此可見,目前對TM的基因變異與腦血管病的確切關(guān)系國內(nèi)外尚無統(tǒng)一的結(jié)論。近來研究發(fā)現(xiàn)，TM表達(dá)的上調(diào)同樣會受到多方面的調(diào)控，其中基因啟動子區(qū)的CpG島的去甲基化可能是TM基因轉(zhuǎn)錄的最重要的調(diào)控方式之一20。大部分情況

14、下，人類疾病有半數(shù)原因與基因遺傳有關(guān)，另一半則取決于基因組外遺傳變化，這種基因組外遺傳變化是在不改變遺傳信息DNA 序列的情況下，但基因表達(dá)卻發(fā)生了可遺傳的變化，這種改變是細(xì)胞內(nèi)除了遺傳信息以外的其它可遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，并最終導(dǎo)致了表型的變化，被稱為表觀遺傳學(xué)(epigenetics)，從根本上講，表觀遺傳是環(huán)境因素和細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)之間發(fā)生交互作用的結(jié)果。這種遺傳方式的改變主要通過DNA甲基化和組蛋白的修飾來調(diào)控基因表達(dá)，其中DNA甲基化修飾是最早發(fā)現(xiàn)的、最常見的DNA修飾方式之一。DNA甲基化能關(guān)閉某些基因的活性，去甲基化則誘導(dǎo)了基因的重新活化和表達(dá)。真核生物中甲基化僅發(fā)生于胞嘧啶。DNA

15、的甲基化是在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5'端的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?'甲基胞嘧啶。這種DNA修飾方式并沒有改變基因序列，但是它調(diào)控了基因的表達(dá)21。脊椎動物基因的甲基化狀態(tài)有三種：持續(xù)的低甲基化狀態(tài)；去甲基化狀態(tài)和高度甲基化狀態(tài)。在哺乳動物基因組中約有4萬個CpG島，而且只有CpG島的胞嘧啶能夠被甲基化，CpG島通常位于基因的啟動子區(qū)或是第一個外顯子區(qū)。健康人基因組中，CpG島中的CpG位點(diǎn)通常是處于非甲基化狀態(tài)，而在CpG島外的CpG位點(diǎn)則通常是甲基化的。這種甲基化的形式在細(xì)胞分裂的過程中能夠穩(wěn)定的保留22。甲基化可抑制基因的表達(dá)，而去甲基化則可表現(xiàn)出基

16、因的活躍。正常情況下CpG島通常是以非甲基化形式存在于基因的啟動子內(nèi)，但在某些病理?xiàng)l件下或外界因素影響下，基因啟動子的去甲基化會使基因轉(zhuǎn)錄增加。如王麗珍等23研究發(fā)現(xiàn)，高Hcy可促進(jìn)人血管平滑肌細(xì)胞MTHFR啟動子區(qū)域去甲基化，提高M(jìn)THFR mRNA 的表達(dá)水平。雖然對 DNA 甲基化的研究主要集中在腫瘤方面，但近年來表觀遺傳學(xué)，尤其是DNA 甲基化修飾在心腦血管疾?。ㄓ绕涫莿用}硬化）中的重要作用逐漸被重視。有研究發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化形成過程會出現(xiàn)異常的DNA 甲基化修飾，可能與動脈粥樣硬化的形成的主要原因24。那么在動脈粥樣硬化最終演變?yōu)槿毖阅X卒中的過程中，是否存在異常的DNA 甲基化修飾情

17、況，而DNA 甲基化修飾情況是否與缺血性腦卒中相關(guān)，目前國內(nèi)外尚未見文獻(xiàn)報道。本項(xiàng)目擬通過病例對照研究，以缺血性腦卒中患者為研究對象，采用近年來被證明有效且各有優(yōu)缺點(diǎn)的三種DNA 甲基化檢測方法：甲基化敏感單鏈構(gòu)象分析法（MS-SSCA 方法）、基因直接測序方法25和SIRPH 分析技術(shù)26，并與同步檢測的高血壓和正常對照組比較，擬探討動脈粥樣硬化相關(guān)基因亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）、低密度脂蛋白受體（LDLR）和凝血相關(guān)基因血栓調(diào)節(jié)蛋白（TM）啟動子區(qū)的甲基化修飾狀況與缺血性腦卒中的關(guān)系，從分子遺傳學(xué)水平揭示缺血性腦卒中發(fā)病的分子機(jī)制，為缺血性腦卒中的分子臨床診斷和尋求新的治療靶點(diǎn)提供

18、理論依據(jù)。參考文獻(xiàn)：1.中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)病學(xué)分會腦血管病學(xué)組缺血性腦卒中二級預(yù)防指南撰寫組，中國缺血性腦卒中和短暫性腦血性發(fā)作二級預(yù)防指南2010，中華神經(jīng)科雜志，2010，2（43）：1-7.2.Taylor LM J . Elevated plasma homocysteine as risk factor for peripheral arterial disease what is t he evidence ? Semin Vasc Surg, 2003, 16:215-222.3.Albaidi MK, Philippou H, Stubbs PJ , et al. Relation

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30、apid,quantitative,non-radioactive bisulfate-SnuPE-IPRP HPLC assay for methylation analysis at specific CPG sites.Nucleic Aacids Res .2002,30:e25.（三）市場預(yù)測和發(fā)展趨勢缺血性腦卒中是威脅人類健康的主要疾病，是人口死亡的主要原因之一，我國發(fā)病率正逐年增加，并有年輕化的趨向。該研究有助于缺血性腦卒中的早期診斷和預(yù)防，以及為尋找新的藥物靶點(diǎn)和特定基因的個體化治療提供理論依據(jù)。二、研究開發(fā)內(nèi)容、方法、技術(shù)路線（一）具體研究開發(fā)內(nèi)容和要重點(diǎn)解決的技術(shù)關(guān)鍵問題1

31、具體研究開發(fā)的內(nèi)容1.1 缺血性腦卒中患者特定基因甲基化修飾狀況的檢測：以病例對照研究的方法，使用基因測序方法、甲基化敏感單鏈構(gòu)象分析法（MS-SSCA方法）和SIRPH分析技術(shù)，并與同步檢測的正常對照組比較，測定啟動子區(qū)的甲基化修飾水平，比較三種方法的可行性和有效性。1.2 檢測三種基因的表達(dá)水平，分析相關(guān)基因啟動子區(qū)的甲基化修飾程度與缺血性腦卒中的相關(guān)性。1.3 綜合分析啟動子區(qū)甲基化水平與基因表達(dá)水平及患者的臨床表現(xiàn)之間的相互關(guān)系，開發(fā)出一套較為完善的分子診斷方法。2要重點(diǎn)解決的技術(shù)關(guān)鍵問題2.1 采用三種優(yōu)勢互補(bǔ)的檢測方法，減少假陽性，提高實(shí)驗(yàn)的精確度。2.2 盡可能擴(kuò)大樣本數(shù)，提高研

32、究結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性。（二）項(xiàng)目的特色和創(chuàng)新之處首次從表觀遺傳的角度研究與缺血性腦卒中相關(guān)基因的甲基化修飾狀況，為進(jìn)一步完善缺血性腦卒中的病因提供科學(xué)依據(jù)，為缺血性腦卒中的分子診斷、早期預(yù)防和治療開辟了一個重要的新領(lǐng)域。（三）要達(dá)到的技術(shù)、經(jīng)濟(jì)指標(biāo)及社會、經(jīng)濟(jì)效益1.完成動脈粥樣硬化相關(guān)基因亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）、低密度脂蛋白受體（LDLR）和凝血相關(guān)基因血栓調(diào)節(jié)蛋白（TM）啟動子區(qū)的甲基化修飾程度與缺血性腦卒中的關(guān)系研究，通過該研究獲得缺血性腦卒中分子診斷的新位點(diǎn)和治療的新靶點(diǎn)，以便使更多患者獲得有效救治，而且能填補(bǔ)我國這方面的研究空白。2.比較基因測序方法、甲基化敏感單鏈構(gòu)象

33、分析法（MS-SSCA 方法）和SIRPH分析技術(shù)測定該研究基因啟動子區(qū)甲基化修飾水平，比較三種方法的可行性和有效性。3.對缺血性腦卒中的早期診斷和治療將有助于減少我國缺血性腦卒中的致死率和致殘率，減少國家和個人的醫(yī)療費(fèi)用，具有一定的社會和經(jīng)濟(jì)效益。（四）采用的方法、技術(shù)路線以及工藝流程1研究方法1.1 入選標(biāo)準(zhǔn)：按照中國急性缺血性腦卒中診治指南2010缺血性腦卒中診斷標(biāo)準(zhǔn)入選缺血性腦卒中患者100例和相匹配的高血壓組及正常對照各100例。1.2 觀察指標(biāo)： 記錄患者一般情況：年齡、性別、體重指數(shù)、肝腎功能、心血管疾病史、家族史、服藥史、心血管危險因素等； 頸動脈超聲：評價頸動脈斑塊情況； 取

34、靜脈血測量血半胱氨酸、血脂和TM水平； 取靜脈血5ml 測基因DNA 甲基化。1.3 特異位點(diǎn)的甲基化分析： DNA 的提取； DNA 的亞硫酸氮鈉修飾、純化和回收； 甲基化敏感性單鏈構(gòu)象分析（ methylation-specific single-strand conformation analysis，MS-SSCA）22又稱重亞硫酸鹽甲基化-PCR-SSCP （ Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP），方法是：先用重亞硫酸鹽處理待測片段，針對非CG 二核苷酸區(qū)設(shè)計引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物變性后作非變性的聚丙酰胺凝膠電泳，由于DN

35、A 電泳時的移動性取決于其二級結(jié)構(gòu)即DNA 的空間構(gòu)象，而后者又由DNA 堿基的序列決定。因此，經(jīng)處理后變性的單鏈DNA 將停留在聚丙酰胺膜的不同位置上，這樣甲基化與非甲基化的就被分離開，隨后行單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析加以明確（見圖1）：圖1：甲基化敏感性單鏈構(gòu)象分析示意圖這種方法的優(yōu)點(diǎn)：A.能夠方便的應(yīng)用于任何序列的甲基化狀態(tài)分析；B.能夠?qū)谆牡任换蜻M(jìn)行半定量；C.可以提示甲基化狀態(tài)分布的不均勻性；D高通量的方法，價格便宜缺點(diǎn)是：A.只有甲基化水平較高的單鏈才能明顯的區(qū)分開，而較低水平的則不易分開，有時會因甲基化的CpG 位點(diǎn)隨機(jī)和不均勻分布導(dǎo)致電泳條帶出現(xiàn)擁擠、拖尾的現(xiàn)象，故敏感性及準(zhǔn)確

36、性略低；B.檢測片段不宜過長。134 基因直接測序22基因直接測序：重亞硫酸鹽使DNA 中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)變成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不變（見圖2），行PCR 擴(kuò)增所需片段,則尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶，最后,對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測序并且與未經(jīng)處理的序列比較，判斷是否CpG 位點(diǎn)發(fā)生甲基化。圖 2：重亞硫酸鹽處理過程示意圖（直接測序）此方法的優(yōu)點(diǎn)：可靠性及精確度高，能明確目的片段中每一個CpG 位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。缺點(diǎn)：需要大量的克隆測序，過程較為繁瑣、昂貴。 SIRPH 分析技術(shù)23SIRPH 分析技術(shù)是SNnPE 結(jié)合IP-RP-HPLC 對特定CPG 位點(diǎn)DNA 甲基化的定量測

37、定。是使用單核苷酸引物延伸（SNnPE）對特定CPG 位點(diǎn)進(jìn)行DNA 甲基化定量分析方法：先將研究序列用硫酸氫鈉處理，未甲基化的胞嘧啶全部轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變。接著用側(cè)翼有CPG 位點(diǎn)的寡核苷酸，通過重亞硫酸鹽處理進(jìn)行SNnPE 反應(yīng)，根據(jù)各自位點(diǎn)的甲基化的還是未甲基化的，使用ddCTP或ddTTP 來延伸寡核苷酸，產(chǎn)物用HPLC 來進(jìn)行分析。優(yōu)點(diǎn)：反應(yīng)是定量和線性的，可同時分析2-3 個位點(diǎn)，可對延長產(chǎn)物進(jìn)行精確分析。缺點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)步驟略復(fù)雜，若要檢測多個位點(diǎn)時則需設(shè)計多個引物。1.4 采用熒光半定量PCR 方法測定血細(xì)胞中MTHFR、LDLR和TM mRNA 表達(dá)量。2技術(shù)路線確診的缺血性腦卒中患者樣本、高血壓和正常對照樣本各100例MTHFR、LDLR和TM基因mRNA表達(dá)MTHFR、LDLR和TM基因DNA甲基化測定血半胱氨酸、血脂和TM水平記錄患者一般情況和頸動脈超聲 直接測序MS-SSCASIRPH分析研究缺血性腦卒中組、高血壓組和正常對照組間臨床情況、頸動脈斑塊情況、血半胱氨酸、血脂和TM水平以及相關(guān)基因MTHFR、LDLR和TM DNA甲基化程