2010省科技腦血管標書 222

1、摘要缺血性腦卒中是威脅人類健康的主要疾病，是人口死亡的主要原因之一，目前已經公認該疾病同時受遺傳和獲得因素的影響，而對獲得因素的控制可以延緩或逆轉疾病的發(fā)生和發(fā)展。缺血性腦卒中的發(fā)生涉及動脈粥樣硬化和血栓形成，而與此相關的三個基因位點亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）、低密度脂蛋白受體（LDLR）和血栓調節(jié)蛋白（TM）的表達水平與這兩個過程密切相關，這些基因的突變已被證實與缺血性腦卒中相關。DNA 甲基化修飾是一種使DNA 發(fā)生化學修飾、無基因序列改變、但可遺傳、可逆的表觀遺傳修飾方式，是表觀遺傳學的重要研究內容之一，表觀遺傳是環(huán)境因素和細胞內的遺傳物質之間發(fā)生交互作用的結果。過去研究發(fā)現基因

2、啟動子區(qū)甲基化修飾的改變會影響到基因的表達水平，從而導致疾病發(fā)生，然而缺血性腦卒中相關基因啟動子區(qū)甲基化修飾狀況改變是否與缺血性腦卒中形成的相關，目前未見報道。故本研究擬采用病例對照研究的方法，利用基因測序技術、甲基化敏感單鏈構象分析法（MS-SSCA 方法）和SIRPH 分析技術對這三個基因啟動子區(qū)的甲基化修飾狀況與缺血性腦卒中的關系進行研究。研究成果將有助于缺血性腦卒中的早期干預，及尋找新的治療靶點，為深入研究缺血性腦卒中的發(fā)病機制、臨床診斷提供新的視角。四、主要研究開發(fā)內容和要達到的主要技術、經濟指標以及將提供的研究開發(fā)成果及形式1、主要研究開發(fā)內容：1缺血性腦卒中患者特定基因甲基化修飾

3、狀況的檢測：以病例對照研究的方法，使用基因測序方法、甲基化敏感單鏈構象分析法（MS-SSCA 方法）和SIRPH 分析技術，并與同步檢測的高血壓組和正常對照組比較，測定啟動子區(qū)的甲基化修飾水平，比較三種方法的可行性和有效性。2分析三種基因的表達水平，分析動脈粥樣硬化相關基因亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）、低密度脂蛋白受體（LDLR）和凝血相關基因血栓調節(jié)蛋白（TM）啟動子區(qū)的甲基化修飾程度與缺血性腦卒中的相關性。3綜合啟動子區(qū)甲基化水平與基因表達水平及患者的臨床表現，開發(fā)出一套較為完善的分子診斷方法。2、要達到的主要技術、經濟指標：1.完成動脈粥樣硬化相關基因亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHF

4、R）、低密度脂蛋白受體（LDLR）和凝血相關基因血栓調節(jié)蛋白（TM）啟動子區(qū)的甲基化修飾程度與缺血性腦卒中的關系研究，通過該研究獲得缺血性腦卒中分子診斷的新位點和治療的新靶點，以便使更多患者獲得早期診斷和有效救治，而且能填補我國這方面的研究空白。2.使用基因測序方法、甲基化敏感單鏈構象分析法（MS-SSCA 方法）和SIRPH 分析技術測定該研究基因啟動子區(qū)甲基化修飾水平，比較三種方法的可行性和有效性。3.對缺血性腦卒中的早期診斷和治療將有助于減少我國缺血性腦卒中的致死率和致殘率，減少國家和個人的醫(yī)療費用。3、將提供的研究開發(fā)成果及形式：1預期可獲得我國缺血性腦卒中相關基因甲基化修飾狀況，以及

5、缺血性腦卒中與MTHFR、LDLR和TM基因DNA 甲基化修飾的關系，并為缺血性腦卒中的基因診斷和治療提供新方向。2使用基因測序方法、甲基化敏感單鏈構象分析法（MS-SSCA 方法）和SIRPH 分析技術測定啟動子區(qū)的甲基化修飾水平，比較三種方法的可行性和有效性。3成果以論文形式在國家核心刊物上發(fā)表25 篇。一、立項依據(一)目的和意義本研究從表觀遺傳學角度，擬采用病例對照研究的方法，利用基因測序技術、甲基化敏感單鏈構象分析法（MS-SSCA 方法）和SIRPH 分析技術，對缺血性腦卒中與動脈粥樣硬化和血栓形成這兩個病理過程中所涉及的三個相關基因：亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）、低密度脂蛋

6、白受體（LDLR）和血栓調節(jié)蛋白（TM）進行研究，觀察其編碼基因啟動子區(qū)DNA 甲基化的修飾狀況，并探討其與缺血性腦卒中的相關性，成果將有助于缺血性腦卒中的早期干預，及尋找新的治療靶點，本項目將為深入研究缺血性腦卒中的發(fā)病機制、臨床診斷打下基礎。(二)國內外概況目前腦血管病已成為我國城市和農村人口的第一位致殘和死亡原因，且發(fā)病有逐年增加的趨勢，我國每年有150萬200萬新發(fā)腦卒中病例，其中缺血性腦卒中占全部腦卒中的60%80%，隨著人口老年化和經濟水平的快速發(fā)展及生活方式的變化，缺血性腦卒中發(fā)病率明顯上升，提示以動脈粥樣硬化為基礎的缺血性腦血管?。òǘ虝盒阅X缺血發(fā)作，TIA）發(fā)病率正在增長。

7、全國腦卒中患者直接醫(yī)療費用支出年年遞增，與醫(yī)療支出日益增長相對應的是腦卒中發(fā)病率不但未降，反而以每年10%的速度遞增1。因此，早期診斷和治療將有助于減少我國缺血性腦卒中的致死率和致殘率，減少國家和個人的醫(yī)療費用。缺血性腦血管病是以動脈粥樣硬化為基礎的，目前，研究發(fā)現導致動脈粥樣硬化的原因很多，其中高半胱氨酸（Hcy）血癥是導致動脈粥樣硬化(AS) 的危險誘發(fā)因素，并增加了腦卒中發(fā)生的風險1、2。其致As的機制包括損傷血管內皮細胞、促進平滑肌細胞增殖、導致氧化應激、激活炎癥過程等2。同時血中高半胱氨酸水平還會引起血液的高凝狀態(tài)和增加血小板的聚集性3，參與血栓的發(fā)生4。 Hcy是在肝臟、肌肉及其它

8、一些組織中由蛋氨酸(methionine,Met)脫甲基生成的一種含巰基的氨基酸。在體內，Hcy通過蛋氨酸合酶催化的甲基化反應可以轉化成Met，這種酶促反應需甲基四氫葉酸為甲基的供體，后者由亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)催化產生，MTHFR是蛋氨酸代謝中的一個關鍵酶，該酶活性受其輔酶葉酸、維生素B12的影響。當MTHFR活性減低或表達下降時，出現高半胱氨酸血癥5。MTHFR基因錯義突變也可引起MTHFR缺陷，如熱不穩(wěn)定性及活性降低，其中677位C/T堿基突變最常見。人MTHFR基因定位于染色體1P363上，MTHFR6

9、77C-T突變導致原第222位密碼子所編碼的丙氨酸由纈氨酸替代，該突變位于亞甲基四氫葉酸還原酶N末端的催化區(qū)域，突變造成MTHFR熱不穩(wěn)定，使MTHFR活性下降，從而導致同型半胱氨酸(Hcy)增高6、7。國內外研究發(fā)現：MTHFR基因變異會是導致高同型半胱氨酸血癥，引發(fā)動脈粥樣硬化性疾病，使缺血性腦血管病的患病機率升高8-11。MTHFR的表達水平下降必將也導致血漿中同型半胱氨酸水平的升高，從而引發(fā)缺血性腦血管病。MTHFR表達的下調會受到多方面的調控，包括遺傳和后天獲得性因素，其中基因啟動子區(qū)的CpG島的甲基化可能是下調或關閉基因轉錄的最重要的調控方式之一。已經明確LDL異常在AS發(fā)生中占有

10、舉足輕重的地位，而且膽固醇水平與缺血性腦卒中的關系很大，有關LDLR基因突變的研究報道已經證實并顯示其與家族性高膽固醇血癥、AS之間明確的因果關系，同時近期研究發(fā)現AS病人基因啟動子區(qū)甲基化程度增高, 提示在LDLR基因調控區(qū)的高甲基化修飾可能參與了AS的發(fā)病12。但有關LDLR基因啟動子區(qū)的甲基化修飾在缺血性腦卒中病人是否出現異常、及其與缺血性腦卒中的關系研究卻迄今未見報道。缺血性腦卒中是在動脈粥樣硬化基礎上，當不穩(wěn)定斑塊破裂，伴隨凝血/纖溶系統(tǒng)的失衡，表現為凝血功能的升高，纖溶功能的下降，局部血栓形成。血栓調節(jié)蛋白（thrombomodulin,TM）是近年來新發(fā)現的存在于血管內皮細胞表面

11、的糖蛋白，作為凝血酶的受體，它參與蛋白C（PC）活化，在調控血栓形成及溶解中發(fā)揮重要作用，此外，它還能降解纖溶酶原激活物抑制劑，促進纖溶，越來越多的研究表明，動脈粥樣斑塊的發(fā)生、形成及消退等與血栓、凝血系統(tǒng)密切相關，TM通過結合凝血酶，可以對抗由其損傷內皮引起的促動脈粥樣硬化（AS）作用，因此，作為內皮細胞的保護因子之一，且具有抗血栓形成功能的TM在AS中的作用令人關注。TM水平表達變化被發(fā)現與腦梗死發(fā)生有密切關系。研究發(fā)現急性腦梗死的病人血漿TM濃度與腦梗死的嚴重度呈負相關，1月后的恢復期血漿TM 濃度較急性期顯著升高13。而老年人腔隙性腦梗死和缺血性白質疏松血漿TM顯著增高血清中TM 的濃

12、度檢測有助病人的早期診斷和病情動態(tài)觀察14。國內一些研究也表明與凝血功能有關的血清標記物的升高增加了腦血管疾病發(fā)病危險, TM與高血壓一樣是腦血管疾病獨立危險因素15。近年來TM 基因多個位點的變異與腦血管病的關系也有較多的報道。有研究發(fā)現TM分子中Ala 25Thr的突變與血栓性疾病和心腦血管疾病有關, 是動靜脈血栓危險因素16。然而，也有研究顯示Ala 25Thr位點變異并非腦血管病主要危險因素17。另有研究發(fā)現C1418T 等位基因變異是卒中的潛在危險，雖然C1418T等位基因變異在亞洲人群較為普遍, 但前者與亞洲人群中腦血管病及血栓形成之間的關系目前還不明確18。其他研究發(fā)現與腦血管病

13、有關的變異包括：G21748C 位點突變導致SP-1反應元件與結合部位不相一致, 致使TM的轉錄發(fā)生改變；G21166A 突變改變了SSRE 的核心結合序列而導致內皮細胞功能異常, 從而增加血栓形成風險。但最近有研究報道TM 的G1748C、1208-1209 delTT、C1418T 這三種常見的基因變異與腦梗死的發(fā)病率、卒中后5年的總死亡率及血漿中TM 濃度的關系均無相關19。由此可見,目前對TM的基因變異與腦血管病的確切關系國內外尚無統(tǒng)一的結論。近來研究發(fā)現，TM表達的上調同樣會受到多方面的調控，其中基因啟動子區(qū)的CpG島的去甲基化可能是TM基因轉錄的最重要的調控方式之一20。大部分情況

14、下，人類疾病有半數原因與基因遺傳有關，另一半則取決于基因組外遺傳變化，這種基因組外遺傳變化是在不改變遺傳信息DNA 序列的情況下，但基因表達卻發(fā)生了可遺傳的變化，這種改變是細胞內除了遺傳信息以外的其它可遺傳物質發(fā)生改變，并最終導致了表型的變化，被稱為表觀遺傳學(epigenetics)，從根本上講，表觀遺傳是環(huán)境因素和細胞內的遺傳物質之間發(fā)生交互作用的結果。這種遺傳方式的改變主要通過DNA甲基化和組蛋白的修飾來調控基因表達，其中DNA甲基化修飾是最早發(fā)現的、最常見的DNA修飾方式之一。DNA甲基化能關閉某些基因的活性，去甲基化則誘導了基因的重新活化和表達。真核生物中甲基化僅發(fā)生于胞嘧啶。DNA

15、的甲基化是在DNA甲基化轉移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5'端的胞嘧啶轉變?yōu)?'甲基胞嘧啶。這種DNA修飾方式并沒有改變基因序列，但是它調控了基因的表達21。脊椎動物基因的甲基化狀態(tài)有三種：持續(xù)的低甲基化狀態(tài)；去甲基化狀態(tài)和高度甲基化狀態(tài)。在哺乳動物基因組中約有4萬個CpG島，而且只有CpG島的胞嘧啶能夠被甲基化，CpG島通常位于基因的啟動子區(qū)或是第一個外顯子區(qū)。健康人基因組中，CpG島中的CpG位點通常是處于非甲基化狀態(tài)，而在CpG島外的CpG位點則通常是甲基化的。這種甲基化的形式在細胞分裂的過程中能夠穩(wěn)定的保留22。甲基化可抑制基因的表達，而去甲基化則可表現出基

16、因的活躍。正常情況下CpG島通常是以非甲基化形式存在于基因的啟動子內，但在某些病理條件下或外界因素影響下，基因啟動子的去甲基化會使基因轉錄增加。如王麗珍等23研究發(fā)現，高Hcy可促進人血管平滑肌細胞MTHFR啟動子區(qū)域去甲基化，提高MTHFR mRNA 的表達水平。雖然對 DNA 甲基化的研究主要集中在腫瘤方面，但近年來表觀遺傳學，尤其是DNA 甲基化修飾在心腦血管疾?。ㄓ绕涫莿用}硬化）中的重要作用逐漸被重視。有研究發(fā)現動脈粥樣硬化形成過程會出現異常的DNA 甲基化修飾，可能與動脈粥樣硬化的形成的主要原因24。那么在動脈粥樣硬化最終演變?yōu)槿毖阅X卒中的過程中，是否存在異常的DNA 甲基化修飾情

17、況，而DNA 甲基化修飾情況是否與缺血性腦卒中相關，目前國內外尚未見文獻報道。本項目擬通過病例對照研究，以缺血性腦卒中患者為研究對象，采用近年來被證明有效且各有優(yōu)缺點的三種DNA 甲基化檢測方法：甲基化敏感單鏈構象分析法（MS-SSCA 方法）、基因直接測序方法25和SIRPH 分析技術26，并與同步檢測的高血壓和正常對照組比較，擬探討動脈粥樣硬化相關基因亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）、低密度脂蛋白受體（LDLR）和凝血相關基因血栓調節(jié)蛋白（TM）啟動子區(qū)的甲基化修飾狀況與缺血性腦卒中的關系，從分子遺傳學水平揭示缺血性腦卒中發(fā)病的分子機制，為缺血性腦卒中的分子臨床診斷和尋求新的治療靶點提供

18、理論依據。參考文獻：1.中華醫(yī)學會神經病學分會腦血管病學組缺血性腦卒中二級預防指南撰寫組，中國缺血性腦卒中和短暫性腦血性發(fā)作二級預防指南2010，中華神經科雜志，2010，2（43）：1-7.2.Taylor LM J . Elevated plasma homocysteine as risk factor for peripheral arterial disease what is t he evidence ? Semin Vasc Surg, 2003, 16:215-222.3.Albaidi MK, Philippou H, Stubbs PJ , et al. Relation

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30、apid,quantitative,non-radioactive bisulfate-SnuPE-IPRP HPLC assay for methylation analysis at specific CPG sites.Nucleic Aacids Res .2002,30:e25.（三）市場預測和發(fā)展趨勢缺血性腦卒中是威脅人類健康的主要疾病，是人口死亡的主要原因之一，我國發(fā)病率正逐年增加，并有年輕化的趨向。該研究有助于缺血性腦卒中的早期診斷和預防，以及為尋找新的藥物靶點和特定基因的個體化治療提供理論依據。二、研究開發(fā)內容、方法、技術路線（一）具體研究開發(fā)內容和要重點解決的技術關鍵問題1

31、具體研究開發(fā)的內容1.1 缺血性腦卒中患者特定基因甲基化修飾狀況的檢測：以病例對照研究的方法，使用基因測序方法、甲基化敏感單鏈構象分析法（MS-SSCA方法）和SIRPH分析技術，并與同步檢測的正常對照組比較，測定啟動子區(qū)的甲基化修飾水平，比較三種方法的可行性和有效性。1.2 檢測三種基因的表達水平，分析相關基因啟動子區(qū)的甲基化修飾程度與缺血性腦卒中的相關性。1.3 綜合分析啟動子區(qū)甲基化水平與基因表達水平及患者的臨床表現之間的相互關系，開發(fā)出一套較為完善的分子診斷方法。2要重點解決的技術關鍵問題2.1 采用三種優(yōu)勢互補的檢測方法，減少假陽性，提高實驗的精確度。2.2 盡可能擴大樣本數，提高研

32、究結果的穩(wěn)定性和可靠性。（二）項目的特色和創(chuàng)新之處首次從表觀遺傳的角度研究與缺血性腦卒中相關基因的甲基化修飾狀況，為進一步完善缺血性腦卒中的病因提供科學依據，為缺血性腦卒中的分子診斷、早期預防和治療開辟了一個重要的新領域。（三）要達到的技術、經濟指標及社會、經濟效益1.完成動脈粥樣硬化相關基因亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）、低密度脂蛋白受體（LDLR）和凝血相關基因血栓調節(jié)蛋白（TM）啟動子區(qū)的甲基化修飾程度與缺血性腦卒中的關系研究，通過該研究獲得缺血性腦卒中分子診斷的新位點和治療的新靶點，以便使更多患者獲得有效救治，而且能填補我國這方面的研究空白。2.比較基因測序方法、甲基化敏感單鏈構象

33、分析法（MS-SSCA 方法）和SIRPH分析技術測定該研究基因啟動子區(qū)甲基化修飾水平，比較三種方法的可行性和有效性。3.對缺血性腦卒中的早期診斷和治療將有助于減少我國缺血性腦卒中的致死率和致殘率，減少國家和個人的醫(yī)療費用，具有一定的社會和經濟效益。（四）采用的方法、技術路線以及工藝流程1研究方法1.1 入選標準：按照中國急性缺血性腦卒中診治指南2010缺血性腦卒中診斷標準入選缺血性腦卒中患者100例和相匹配的高血壓組及正常對照各100例。1.2 觀察指標： 記錄患者一般情況：年齡、性別、體重指數、肝腎功能、心血管疾病史、家族史、服藥史、心血管危險因素等； 頸動脈超聲：評價頸動脈斑塊情況； 取

34、靜脈血測量血半胱氨酸、血脂和TM水平； 取靜脈血5ml 測基因DNA 甲基化。1.3 特異位點的甲基化分析： DNA 的提??； DNA 的亞硫酸氮鈉修飾、純化和回收； 甲基化敏感性單鏈構象分析（ methylation-specific single-strand conformation analysis，MS-SSCA）22又稱重亞硫酸鹽甲基化-PCR-SSCP （ Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP），方法是：先用重亞硫酸鹽處理待測片段，針對非CG 二核苷酸區(qū)設計引物進行PCR 擴增，擴增產物變性后作非變性的聚丙酰胺凝膠電泳，由于DN

35、A 電泳時的移動性取決于其二級結構即DNA 的空間構象，而后者又由DNA 堿基的序列決定。因此，經處理后變性的單鏈DNA 將停留在聚丙酰胺膜的不同位置上，這樣甲基化與非甲基化的就被分離開，隨后行單鏈構象多態(tài)性分析加以明確（見圖1）：圖1：甲基化敏感性單鏈構象分析示意圖這種方法的優(yōu)點：A.能夠方便的應用于任何序列的甲基化狀態(tài)分析；B.能夠對甲基化的等位基因進行半定量；C.可以提示甲基化狀態(tài)分布的不均勻性；D高通量的方法，價格便宜缺點是：A.只有甲基化水平較高的單鏈才能明顯的區(qū)分開，而較低水平的則不易分開，有時會因甲基化的CpG 位點隨機和不均勻分布導致電泳條帶出現擁擠、拖尾的現象，故敏感性及準確

36、性略低；B.檢測片段不宜過長。134 基因直接測序22基因直接測序：重亞硫酸鹽使DNA 中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉變成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不變（見圖2），行PCR 擴增所需片段,則尿嘧啶全部轉化成胸腺嘧啶，最后,對PCR 產物進行測序并且與未經處理的序列比較，判斷是否CpG 位點發(fā)生甲基化。圖 2：重亞硫酸鹽處理過程示意圖（直接測序）此方法的優(yōu)點：可靠性及精確度高，能明確目的片段中每一個CpG 位點的甲基化狀態(tài)。缺點：需要大量的克隆測序，過程較為繁瑣、昂貴。 SIRPH 分析技術23SIRPH 分析技術是SNnPE 結合IP-RP-HPLC 對特定CPG 位點DNA 甲基化的定量測

37、定。是使用單核苷酸引物延伸（SNnPE）對特定CPG 位點進行DNA 甲基化定量分析方法：先將研究序列用硫酸氫鈉處理，未甲基化的胞嘧啶全部轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變。接著用側翼有CPG 位點的寡核苷酸，通過重亞硫酸鹽處理進行SNnPE 反應，根據各自位點的甲基化的還是未甲基化的，使用ddCTP或ddTTP 來延伸寡核苷酸，產物用HPLC 來進行分析。優(yōu)點：反應是定量和線性的，可同時分析2-3 個位點，可對延長產物進行精確分析。缺點：實驗步驟略復雜，若要檢測多個位點時則需設計多個引物。1.4 采用熒光半定量PCR 方法測定血細胞中MTHFR、LDLR和TM mRNA 表達量。2技術路線確診的缺血性腦卒中患者樣本、高血壓和正常對照樣本各100例MTHFR、LDLR和TM基因mRNA表達MTHFR、LDLR和TM基因DNA甲基化測定血半胱氨酸、血脂和TM水平記錄患者一般情況和頸動脈超聲 直接測序MS-SSCASIRPH分析研究缺血性腦卒中組、高血壓組和正常對照組間臨床情況、頸動脈斑塊情況、血半胱氨酸、血脂和TM水平以及相關基因MTHFR、LDLR和TM DNA甲基化程