感受態(tài)細胞制備及各種感受態(tài)的特點

1、感受態(tài)細胞制備制備感受態(tài)常用的方法是電擊法和CaCl2制備法，以下介紹CaCl2制備法：1、可以從-80冰柜中，取出一支凍存菌株，于事先照過紫外的超凈臺中，用無菌的接種環(huán)輕輕蘸取菌種后，在無抗平板（由于Rocetta含有氯霉素抗性，需要涂布在氯霉素抗性的平板，后面的都是如此）上劃線，并將菌種快速放回-80保存，在劃線板上做好相應標記，于37培育過夜。2、從37培育過夜的新穎平板上挑取一個單克隆，接種于2mlEP管中，37，220rpm震蕩培育約6個小時至對數(shù)生長中后期；將該菌懸液以1:100的比例接種于50ml LB液體培育基（2瓶）中,37振蕩培育2.5小時至OD600=0.5。留意：接種比

2、例不得大于1:10。3、在無菌條件下將細菌轉(zhuǎn)移到一個無菌、預冷的離心管（50ml）中，在冰上放置510min；留意：劃板、接種為了防止意外發(fā)生最好多劃一塊平板和多接一根試管，劃板、接種、轉(zhuǎn)接均要嚴格依據(jù)無菌操作。4、4 5000g離心5分鐘。用預冷的去離子水洗滌沉淀，4 5000g離心5分鐘；Note：此步主要是為了洗去培育基中的鹽等5、沉淀加入2ml預冷的0.05mol/L CaCl2-15%甘油混合溶液，輕吹散，冰浴5分鐘，45000g離心5分鐘；6、沉淀加入2ml預冷的0.05mol/L CaCl2-15%甘油混合溶液，輕吹散，即成為感受態(tài)細胞懸液。分裝成50100l的小份，貯存于-70

3、可保存半年。含15%甘油的0.05mol/L CaCl2制備方法:稱取0.28g CaCl2(無水,分析純),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高壓滅菌。感受態(tài)細胞的特征感受態(tài)：通過特殊處理使細胞處于能夠吸取外源DNA的狀態(tài)。感受態(tài)細胞的特征：（1）細胞表面暴露出一些可接受外來DNA的位點（以溶菌酶處理，可促使受體細胞的接受位點充分暴露）。（2）細胞膜通透性增加（用鈣離子處理，可使膜通透性增加，使DNA直接穿過質(zhì)膜進入細胞）。（3）受體細胞的修飾酶活性最高，而限制酶活性最低，使轉(zhuǎn)入的DNA分子不易被切除或破壞。試驗室常用的感受態(tài)細胞1.DH5菌株克隆菌株：DH5是一種常

4、用于質(zhì)粒克隆和高拷貝質(zhì)粒的穩(wěn)定復制的菌株。E.coli DH5在使用pUC系列質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化時，其80lacZM15基因產(chǎn)物可與載體編碼的半乳糖苷酶氨基端實現(xiàn)互補，可用于藍白斑篩選鑒別重組菌株。Rec A1和end A1的突變有利于克隆DNA的穩(wěn)定和高純度質(zhì)粒DNA的提取?；蛐停篎-、80dlacZM15、(lacZYA-argF)U169、deoR、recA1、endA1、hsdR17(rk-，mk+)、phoA、supE44、-、thi-1、gyrA96、relA12.TOP10菌株克隆菌株：該菌株適用于高效的DNA克隆和質(zhì)粒擴增，能保證高拷貝質(zhì)粒的穩(wěn)定遺傳。基因型：F-、mcrA(mrr

5、-hsd RMS-mcrBC)、 80 、lacZM15、lac74、 recA1、ara139(ara-leu)7697、 galU 、galK 、rps、 (Strr) endA1、 nupG3.BL21(DE3) 菌株：蛋白表達菌株：該菌株用于高效表達克隆于含有噬菌體T7啟動子的表達載體（如pET系列）的基因。該菌株用于T7 RNA聚合酶為表達系統(tǒng)的高效外源基因的蛋白表達宿主，T7噬菌體RNA聚合酶基因的表達受控于 噬菌體DE3區(qū)的acUV5啟動子，該區(qū)整合于BL21的染色體上。該菌株適合于非毒性蛋白的表達?；蛐停篎-、ompT、 hsdS（rB-mB-）、gal、 dcm（DE3）4

6、.BL21(DE3) pLysS菌株蛋白表達菌株：該菌株含有質(zhì)粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。PLysS含有表達T7溶菌酶的基因，能夠降低目的基因的背景表達水平，但不干擾目的蛋白的表達。該菌適合表達毒性蛋白和非毒性蛋白?；蛐停篎-、ompT 、hsdS（rB-mB-）、gal、 dcm（DE3）、pLysS 、Camr5.Rocetta感受態(tài)特征：蛋白表達菌株Rosetta系列菌株來源于BL21系列宿主菌，該系列菌株含有原本在大腸桿菌中稀有的真核細胞密碼子，增加了真核細胞的蛋白表達水平。（1） Rocetta （DE3） 該菌株通過一個相容性氯霉素抗性質(zhì)粒補充大腸桿菌缺

7、乏的6種稀有密碼子（AUA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA）對應的tRNA，這樣Rocetta菌株供應了“萬能”的翻譯，從而避開因大腸桿菌密碼子使用頻率導致的表達限制，提高外源基因尤其是真核基因在原核系統(tǒng)中的表達水平。tRNA基因由它們的自然啟動子驅(qū)動。基因型： F- 、ompT、hsdSB (rB - mB - )、gal、dcm、lacY1(DE3)、pRARE(argU，argW，ileX，glyT，leuW，proL)(Cmr ) 補充：稀有密碼子對蛋白表達的影響：數(shù)氨基酸都有一個以上的密

8、碼子，對E.coli密碼子應用狀況分析表明一些密碼子很少使用,尤其是精氨酸密碼子AGA , AGG , CGG , CGA；異亮氨酸的密碼子AUA；亮氨酸的密碼子CUA和甘氨酸的密碼子GGA和脯氨酸的密碼子CCC很少被用到。 目的基因中含有過多的稀有密碼子被認為是低表達水平和產(chǎn)生不完全產(chǎn)物的一個緣由。當在氨基端四周消滅多個稀有密碼子的時候，狀況更為嚴峻，很多爭辯表明，精氨酸的密碼子AGA 和AGG的高頻消滅可能大大影響蛋白的產(chǎn)量。當這些密碼子消滅在N-端四周時候，這種影響將達到最大。  多個試驗室報道，在宿主菌中增加同類tRNA時那些含有稀有密碼子基因的蛋白產(chǎn)量將大大提高。

9、RosettaTM菌株可以增加精氨酸稀有密碼子AGG 和AGA,異亮氨酸的密碼子AUA；亮氨酸的密碼子CUA和甘氨酸的密碼子GGA和脯氨酸的密碼子CCC。因此,很適合用于表達那些含E.coli稀有密碼子基因的目的蛋白.（引用自網(wǎng)址 （2）Rosetta 2 (DE3) pLySs來源于Rosetta(DE3)，本菌株含有pRARE2質(zhì)粒，除了能夠供應原Rosetta(DE3)宿主菌含有AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, 和GGA六個稀有密碼子的tRNA外，還供應了第七個稀有密碼子CGG的tRNA。同時，pRARE2質(zhì)粒具有氯霉素抗性。Rosetta2(DE3)pLySs載體通過供

10、應稀有密碼子，使得該宿主菌相對于其他大腸桿菌，能夠供應更加“通用”的蛋白質(zhì)表達，從而提升目的蛋白表達水平。DE3是溶源性的 DE3, 所以帶有T7 RNA聚合酶的染色體拷貝。該菌株適用于pET系列載體，及其他T7啟動子系列載體。含有pLSs質(zhì)粒，pLySs質(zhì)粒能夠產(chǎn)生T7溶菌酶，可以有效降低目的基因的基礎表達水平。pLySs質(zhì)粒使得該菌株具有氯霉素抗性。pLySs質(zhì)粒的起始復制位點是p15 Origin, 這使得該質(zhì)粒能夠和pUC-及pBR322-衍生的質(zhì)粒相互共存。轉(zhuǎn)化1、 轉(zhuǎn)化的原理：溶液中的Ca離子和細菌細胞膜結(jié)合，在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，在42，90s熱激下，這種液晶結(jié)構(gòu)收縮，將細胞膜扯

11、開孔道，使DNA進入細菌細胞中。2、 轉(zhuǎn)化的步驟：（1）取感受態(tài)細胞置于冰浴中，如需分裝可將剛?cè)芑募毎麘乙悍盅b到無菌預冷的離心管中，置于冰浴中。（2） 向感受態(tài)細胞中加入目的DNA（50ul感受態(tài)細胞能夠被1ng超螺旋DNA所飽和），輕彈混勻，在冰浴中靜置30min；留意：一次轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的建議用量為50ul，可以依據(jù)實際狀況分裝使用，應留意所用DNA體積不能超過感受態(tài)細胞懸液體積的格外之一，也有說法是不能超過5%。不能加入太多DNA，會影響轉(zhuǎn)化效率，體積不能超過10ul，所以連接時做10ul連接體系可用一半做轉(zhuǎn)化，剩下的放在4°C。（3）將離心管置于42度水浴中放置90s，然后快速轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細胞冷卻2-3min（一般2min），該過程不要搖動離心管；（4）向每個離心管中加入500ul無菌的LB培育基（不含抗生素），混勻后置于37度搖床震蕩培育45min（150rpm），目的是使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標記基因表達，使菌體復蘇。（5）將離心管內(nèi)容物混勻，可吸取適量（可吸取200-300ul，也可據(jù)狀況而定）轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布平板，而假如估計的克隆較少，可通過離心（4000rpm，2min）后，吸掉部分上清，懸浮菌體后將其涂布于一個平板中。留意：涂布