膠體金生產(chǎn)工藝配方原則

1、膠體金生產(chǎn)工藝配方原則2內(nèi)內(nèi) 容容一、和膜相關(guān)的配方和原理一、和膜相關(guān)的配方和原理二、和金子墊相關(guān)的配方和原理二、和金子墊相關(guān)的配方和原理三、和樣品墊相關(guān)的配方和原理三、和樣品墊相關(guān)的配方和原理四、相關(guān)問題四、相關(guān)問題3一、和膜相關(guān)的配方和原理一、和膜相關(guān)的配方和原理電鏡下的NC膜4硝酸纖維膜生產(chǎn)工藝圖硝酸纖維膜生產(chǎn)工藝圖5孔徑定義的問題孔徑定義的問題6孔徑對側(cè)向?qū)游鏊俣鹊挠绊懣讖綄?cè)向?qū)游鏊俣鹊挠绊?不同種類膜的不同種類膜的 IgG結(jié)合能力結(jié)合能力8不同種類膜的不同種類膜的 BSA結(jié)合能力結(jié)合能力9為什么蛋白會結(jié)合到膜上為什么蛋白會結(jié)合到膜上?結(jié)合力是什么? 靜電 疏水力這兩種結(jié)合力的效應(yīng)是

2、什么? 使蛋白從溶液中分離出來 長久結(jié)合作用10v靜電作用力靜電作用力是正負(fù)電荷相互吸引產(chǎn)生的作用力v疏水作用力疏水作用力又稱為疏水鍵。它是由側(cè)鏈的疏水基團(tuán)相互接近. 而形成的一種作用力。對維持分子的三、四級結(jié)構(gòu)起著重要的作用。每一個蛋白質(zhì)都具有疏水基團(tuán)和親水基團(tuán)。11v蛋白質(zhì)疏水性狀和親水性狀當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶解在溶劑中時，蛋白質(zhì)處于非常穩(wěn)定的狀態(tài)，此時蛋白質(zhì)的親水基團(tuán)展開在外，疏水基團(tuán)收縮在內(nèi)，親水基團(tuán)和水分子接觸，保證了溶解性的狀態(tài)；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)沉淀出來時，疏水基團(tuán)展開，親水基團(tuán)收縮，此時為疏水狀態(tài)，也呈現(xiàn)不穩(wěn)定的固體狀態(tài)，疏水基團(tuán)和其他固體物的疏水基團(tuán)通過疏水作用力結(jié)合，達(dá)到固定的目的。12蛋白結(jié)

3、合到固相材料上蛋白結(jié)合到固相材料上v 蛋白結(jié)合到固相材料上是一個多步驟過程v取決于 蛋白溶液擴(kuò)散到固相表面 蛋白從溶液中分離出來 蛋白吸附到固相上 蛋白重排到最低能態(tài)13吸附過程吸附過程溶液中的蛋白蛋白轉(zhuǎn)移到表面區(qū)域吸附蛋白在表面重排14多位點結(jié)合多位點結(jié)合只有1個位點的結(jié)合是可逆的多位點結(jié)合使得蛋白穩(wěn)定在固相表面，即使其中的每個單位點都是可逆的15影響蛋白結(jié)合的因素影響蛋白結(jié)合的因素 蛋白緩沖液 使用的膜 蛋白自身 應(yīng)用體系 16蛋白緩沖液蛋白緩沖液v沒有通用的緩沖液，不同的系統(tǒng)必須分別優(yōu)化。v作用：提供適合的PH, 改善親水性, 增溶性,提高穩(wěn)定性v定律: “蛋白在緩沖液中越不穩(wěn)定，蛋白結(jié)

4、合力越蛋白在緩沖液中越不穩(wěn)定，蛋白結(jié)合力越強(qiáng)強(qiáng)”17緩沖液的優(yōu)化緩沖液的優(yōu)化v離子強(qiáng)度 對于蛋白從溶液中脫離出來很重要，少量的離子強(qiáng)度，蛋白難以從溶液中脫離沉淀出來，過量的的離子強(qiáng)度，溶液配制中就已會出現(xiàn)沉淀。vpH 蛋白在等電點最不穩(wěn)定v沉淀劑 通常用醇降低蛋白的穩(wěn)定性，也可潤濕膜，減少膜帶有的靜電，利于結(jié)合包被。v鹽 通常不會影響 對某些蛋白，兩性離子的鹽類有助于蛋白結(jié)合 減少信號強(qiáng)度，消假陽18v糖：對包被蛋白的穩(wěn)定性有重要作用，減緩老化速度，也可以增加親水力。v惰性蛋白：對消除假陽有重要作用v表面活性劑：增加親水力，也可增色。19緩沖液的基本成分緩沖液的基本成分各種緩沖系: Tris-

5、HCl, PB, CB等鹽類：NaCl糖：蔗糖，海藻糖等表面活性劑：Tween20，Triton x-100等惰性蛋白：Casein等防腐劑 ：疊氮鈉，卡松等20推薦的起始緩沖液推薦的起始緩沖液v10mM Phosphate pH 7.0 3% Ethanol21“潛水艇潛水艇” 效應(yīng)效應(yīng)v表面活性劑處理過的膜在使用時的常見問題v因為使用的表面活性劑是水溶性的v噴膜時這些表面活性劑被“沖走”了22反應(yīng)動力學(xué)v流速增加,反應(yīng)速率減低v流速增加,檢測時間縮短v流速增加,靈敏度降低v流速增加,試劑用量增加v流速增加,背景降低v距離增加,流速降低v孔徑增加,蛋白結(jié)合量減少23二、二、和金子墊相關(guān)的配方

6、和原理和金子墊相關(guān)的配方和原理v和金子墊相關(guān)的工藝和配方有：1）標(biāo)記工藝；2）金標(biāo)稀釋液3）金墊處理液24標(biāo)記工藝標(biāo)記工藝v膠體金：一般指金的水溶液，又稱金溶膠。膠體金：一般指金的水溶液，又稱金溶膠。-金以微小的粒子分散在水中所形成的金溶金以微小的粒子分散在水中所形成的金溶膠。膠。其中分散的金顆粒直徑一般在其中分散的金顆粒直徑一般在1100nm之間，之間，為負(fù)電荷分布。為負(fù)電荷分布。25高質(zhì)量結(jié)合物高質(zhì)量結(jié)合物v單個分散的顆粒 v圓形顆粒v很少聚集這樣得到的膠體穩(wěn)定性和重復(fù)性好Cluster free, high quality gold reagentClustered, poor qual

7、ity gold reagent26膠體金的生產(chǎn)膠體金的生產(chǎn)v膠體金的形成是還原HAuCl4.vHAuCL4 + e- Au0v還原劑越強(qiáng)，得到的金顆粒越小v生產(chǎn) 40nm診斷用金顆粒一般用檸檬酸三鈉27膠體金顆粒的形成膠體金顆粒的形成28膠體金的生產(chǎn)膠體金的生產(chǎn)v2種重要步驟 直接形成 分步形成v大多數(shù)人用分步形成 比較容易控制顆粒大小，CV也比較小 能夠生產(chǎn)出大顆粒膠體金29顆粒大小對膠體的影響顆粒大小對膠體的影響30蛋白標(biāo)記原理蛋白標(biāo)記原理v蛋白質(zhì)在等電點或稍偏堿的情況下，依靠靜電蛋白質(zhì)在等電點或稍偏堿的情況下，依靠靜電引力或疏水力或共價鍵，被牢固地吸附于膠體引力或疏水力或共價鍵，被牢固

8、地吸附于膠體金顆粒表。由于蛋白質(zhì)分子牢固地結(jié)合在金顆金顆粒表。由于蛋白質(zhì)分子牢固地結(jié)合在金顆粒表面，形成一個蛋白層，從而阻止了膠體金粒表面，形成一個蛋白層，從而阻止了膠體金顆粒的相互接觸，使該膠聯(lián)溶液較為穩(wěn)定。顆粒的相互接觸，使該膠聯(lián)溶液較為穩(wěn)定。31要點要點v蛋白的預(yù)處理v使用低濃度和正確的pH值，確保最小的聚集v合適的蛋白量（可通過鹽滴定進(jìn)行評價）v攪拌速度、容器的潔凈程度、離心的速度32鹽滴定鹽滴定v鹽滴定不能衡量蛋白單層的形成v鹽滴定只能代表鹽溶液中多少量的蛋白可以使膠體金穩(wěn)定vpH和時間都會有影響33蛋白邦定作用力蛋白邦定作用力 電荷作用力（靜電作用力） 疏水力 共價鍵3435金標(biāo)稀

9、釋液金標(biāo)稀釋液v合適的離子種類和強(qiáng)度，0.2M左右，常用有磷酸鹽等。 v大分子物質(zhì)作為膠體金干燥后均勻散布的骨架，常用大分子物質(zhì)如PEG4000，PEG20000，PVP 。v小分子物質(zhì)對蛋白活性保護(hù)， 蛋白儲存常用的甘油、蔗糖、海藻糖、各類低聚糖等，對產(chǎn)品的儲存穩(wěn)定性有幫助。36v惰性蛋白，它是保護(hù)目的蛋白的活性，也維持膠體金的膠體穩(wěn)定，它們是消除非特異性的封閉物質(zhì)，也起著有分散膠體金顆粒的骨架作用。常用有BSA 、OVA、Casein。v表面活性劑，具有增加親水性，促進(jìn)結(jié)合等作用。常用的有Tween-20，Tritonx-100。37評價金標(biāo)稀釋液的參數(shù)評價金標(biāo)稀釋液的參數(shù)v金子釋放程度及

10、速度。v金標(biāo)液穩(wěn)定性。v靈敏度、特異性38結(jié)合物釋放墊的原理結(jié)合物釋放墊的原理v什么是結(jié)合物釋放墊? 孔徑開放 快速層析 低蛋白結(jié)合力 理想的親水性v傳統(tǒng)材料是包被PVA的玻纖39典型結(jié)合物釋放墊材料的構(gòu)意圖典型結(jié)合物釋放墊材料的構(gòu)意圖玻纖高分子PVA外殼40側(cè)向?qū)游鲋薪Y(jié)合物釋放墊的原理側(cè)向?qū)游鲋薪Y(jié)合物釋放墊的原理v做什么用 (理論上)？ 讓結(jié)合物完好無損的干燥 加樣后讓結(jié)合物快速釋放v實際應(yīng)用中 側(cè)向?qū)游鲋薪Y(jié)合物釋放墊可能遇到的問題比其它任何組分都多 41標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合物釋放墊的性能標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合物釋放墊的性能v45秒內(nèi)釋放出約 70% 的結(jié)合物v但是墊上保留的結(jié)合物降低了靈敏度，因為: 較少的結(jié)合物到

11、達(dá)捕獲線 較少的抗原到達(dá)捕獲線v在側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)中 靈敏度要好 線條CV值一般在 15-20%42儲存于儲存于 20oC時結(jié)合物釋放率時結(jié)合物釋放率43金墊處理液金墊處理液v作用：增加親水性作用：增加親水性, 促進(jìn)復(fù)溶促進(jìn)復(fù)溶, 保持穩(wěn)定性保持穩(wěn)定性v基本成分：基本成分： 1）緩沖系統(tǒng)：磷酸，碳酸，硼酸，）緩沖系統(tǒng)：磷酸，碳酸，硼酸，Tris,生物緩沖液生物緩沖液等。等。 2）表面活性劑：）表面活性劑：Tween-20，Tritonx-100等。等。 3）大分子物質(zhì)：）大分子物質(zhì)：PEG4000，PEG20000，PVP，PVA 4）惰性蛋白：）惰性蛋白：BSA 、OVA、Casein。 5）小

12、分子保護(hù)物質(zhì)：糖類物質(zhì)，如蔗糖，海藻糖等。）小分子保護(hù)物質(zhì)：糖類物質(zhì)，如蔗糖，海藻糖等。 44結(jié)合物釋放常見問題結(jié)合物釋放常見問題v釋放不充分v釋放慢v釋放墊再次濕潤困難45釋放不充分釋放不充分v結(jié)合物綁定到釋放墊上了 用聚合物和表面活性劑封閉釋放墊v在儲存過程中，結(jié)合物發(fā)生聚集 控制封閉劑的用量 控制溶液的離子強(qiáng)度46釋放慢釋放慢v您的釋放墊是怎樣封閉的? 是否加了親水試劑？ 是否用了大量的蛋白? 是否用了大量的糖?v試紙條各組分之間接觸緊密么?47釋放墊再次濕潤困難釋放墊再次濕潤困難v您使用的是哪一種釋放墊? 是親水的么?v您是怎樣封閉釋放墊的?48三、和樣品墊相關(guān)的配方和原理v作用：改變

13、樣本PH, 調(diào)節(jié)爬速, 控制金標(biāo)釋放，抑制非特異性吸附,降低背景v基本成分： 1）緩沖系統(tǒng)：磷酸，碳酸，硼酸，）緩沖系統(tǒng)：磷酸，碳酸，硼酸，Tris,生物緩沖液等。生物緩沖液等。 2）表面活性劑：）表面活性劑：Tween-20，Tritonx-100等。等。 3）大分子聚合物質(zhì)：）大分子聚合物質(zhì)：PEG4000，PEG20000，PVP，PVA 4）惰性蛋白：）惰性蛋白：BSA 、OVA、Casein。 5）生物物質(zhì)：鼠）生物物質(zhì)：鼠IGg，抗紅細(xì)胞抗體等。，抗紅細(xì)胞抗體等。49v血清類樣品墊注意爬速，背景，靈敏度的達(dá)到和假陽的消除。v全血類樣品墊1）必須能夠去除紅細(xì)胞！2）還需具備下列功能

14、不能造成溶血 不能干擾樣品 分離必須快速高效 必須能夠分離一定范圍內(nèi)的不同血樣量 靈敏度的達(dá)到和假陽的消除50v尿液類樣品墊注意交叉反應(yīng)的消除。51影響抗原抗體反應(yīng)的外部因素影響抗原抗體反應(yīng)的外部因素v電解質(zhì) 抗原與抗體發(fā)生結(jié)合后，由親水膠體變?yōu)槭杷z體的過程中須有電解質(zhì)參與才能進(jìn)一步使抗原抗體復(fù)合物表面失去電荷，水化層破壞，復(fù)合物相互靠攏聚集，形成大塊的凝集或沉淀。若無電解質(zhì)參加，則不出現(xiàn)可見反應(yīng)。為了促使沉淀物或凝集物的形成，常用O.85氯化鈉或各種緩沖液作抗原及抗體的稀釋液及反應(yīng)液。但電解質(zhì)的濃度不宜過高，否則會出現(xiàn)鹽析現(xiàn)象。52v酸堿度 蛋白質(zhì)具有兩性電離性質(zhì)，因此每種蛋白質(zhì)都有固定的

15、等電點?？乖贵w反應(yīng)必須在合適的pH環(huán)境中進(jìn)行，pH過高或過低都將影響抗原與抗體的理化性質(zhì)?？乖贵w反應(yīng)一般在pH為69進(jìn)行。53v溫度 抗原抗體反應(yīng)必須在合適的溫度中進(jìn)行，一般以1540為宜，最適反應(yīng)溫度為37。某些特殊的抗原抗體反應(yīng)，對溫度有一些特殊的要求，例如冷凝集素在4左右與紅細(xì)胞結(jié)合最好，20以上反而解離。54v反應(yīng)時間反應(yīng)時間越長，抗原抗體反應(yīng)越充分，顯色也越深。所有調(diào)整輔料的思路都可從抗原抗體反應(yīng)的影響因素和輔料的成分性質(zhì)進(jìn)行考慮和設(shè)計。55四、相關(guān)問題四、相關(guān)問題v假陽問題v假陰問題v穩(wěn)定性問題v上樣問題56（一）假陽問題（一）假陽問題v未標(biāo)記上的金顆粒（裸金）v電荷作用v疏水

16、作用v硫醇類物質(zhì)的存在（S-H鍵起作用）v抗原抗體作用（內(nèi)源性物質(zhì)）v抗凝劑和防腐劑的影響v其他原因57未標(biāo)記上的金顆粒（裸金）未標(biāo)記上的金顆粒（裸金）v裸金聚集，周圍具有大量的負(fù)電荷，當(dāng)樣本爬過金墊，裸金隨著向上跑，在T線位置只要碰到帶有正電荷的蛋白，即發(fā)生反應(yīng)，形成假陽線條。v解決方法：檢查標(biāo)記過程，BSA封閉58電荷作用電荷作用v膠體金顆粒帶有負(fù)電荷，當(dāng)遇上帶有正電荷的蛋白，易發(fā)生非特異性結(jié)合反應(yīng)，導(dǎo)致假陽。反應(yīng)環(huán)境為酸性時，已發(fā)生此類結(jié)合。v解決方法：改變pH和鹽度59疏水作用疏水作用v抗原抗體結(jié)合以及和膠體金結(jié)合都需要用到疏水作用力，當(dāng)反應(yīng)環(huán)境中存在疏水物質(zhì)時，易和膠體金或抗原抗體通

17、過疏水作用力結(jié)合，產(chǎn)生假陽結(jié)果，如標(biāo)本里的一些脂肪，細(xì)胞碎片，細(xì)菌等等。v解決方法：用表面活性劑或親水聚合物進(jìn)行處理。60抗原抗體作用抗原抗體作用v此類作用是指標(biāo)本里面含有能和標(biāo)記材料/包被材料發(fā)生免疫反應(yīng)的非目標(biāo)物的其他物質(zhì)導(dǎo)致的假陽結(jié)果。常見的有毒品的交叉反應(yīng)，如KET試劑檢測美沙酮標(biāo)本，呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，就是美沙酮和KET材料發(fā)生了交叉反應(yīng)；又有SG試劑中的抗鼠抗體反應(yīng)等等。解決方法：在樣品墊或金子墊或硝酸纖維素膜上加入相應(yīng)的抗體，將這類物質(zhì)在T線前消除掉。61在血清檢測中的具體非特異性反應(yīng)物在血清檢測中的具體非特異性反應(yīng)物質(zhì)質(zhì)v大約40%的人血清標(biāo)本中含有非特異干擾物質(zhì)，可以不同程度影響檢

18、測結(jié)果。常見的干擾物質(zhì)有：類風(fēng)濕因子、補體、嗜異性抗體、嗜靶抗原自身抗體、醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠Ig(s)抗體、交叉反應(yīng)物質(zhì)和其他物質(zhì)等。62v 類風(fēng)濕因子 人血清中IgM、IgG型類風(fēng)濕因子(RF)可以與ELISA系統(tǒng)中的捕獲抗體及酶標(biāo)記二抗的FC段直接結(jié)合，從而導(dǎo)致假陽性。解決該情況的辦法是：(1)用F(ab)2替代完整的IgG；(2)標(biāo)本用預(yù)先熱變性(63，10min)IgG的固相吸附劑處理(將熱變性IgG加入到標(biāo)本稀釋液中同樣有效)；(3)檢測抗原時，可以用2-巰基乙醇等加入到標(biāo)本稀釋液中，使RF降解。63v補體 如果在包被和標(biāo)記過程中，使用的抗體的FC段的補體Clq分子結(jié)合位點被暴露出來，

19、從而易使Clq可以將補體和抗體二者連接起來，造成假陽性現(xiàn)象。解決的方法是：(1)用EDTA稀釋標(biāo)本；(2)用53、10min加熱血清使Clq滅活。64v嗜異性抗體人類血清中含有能與嚙齒類動物(如鼠等)Ig(s)結(jié)合的天然嗜異性抗體，易和包被和標(biāo)記的抗體產(chǎn)生反應(yīng)，能造成假陽性。解決的辦法是：可在標(biāo)本稀釋液中加入過量的動物Ig(s)，但加入量不足或亞類不同時無效。65v醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠Ig(s)抗體（嗜異性抗體的一種）臨床開展的用鼠源性CD3等克隆抗體治療，用放射性同位素標(biāo)記鼠源性抗體的影像診斷及靶向治療等新技術(shù)，均有可能使些病人體內(nèi)產(chǎn)生抗鼠抗體；另外，被鼠等嚙齒類動物咬傷的病人體內(nèi)也可以產(chǎn)生抗鼠

20、Ig(s)抗體。解決的方法是：測定抗原時，在標(biāo)本中加入足量的正常鼠Ig(s)，從而克服由于上述原因造成的假陽性。66例子：Sg采用了雙抗體夾心的方法進(jìn)行檢測，包被材料和標(biāo)記材料都是單克隆抗體，屬于鼠IGg類別，由于人體經(jīng)常和動物打交道，體內(nèi)易產(chǎn)生嗜異性抗體，如抗鼠抗體，抗?？贵w等等，這類嗜異性抗體極易導(dǎo)致假陽反應(yīng)的產(chǎn)生。67為了消除嗜異性抗體的影響，可通過在樣品墊中加入正常的動物血清或純化的鼠IGg，又或者在膜上噴有鼠IGg A線，金子中加有正常的動物血清或純化的鼠IGg等等方式將嗜異性抗體排斥在T線前，消除這方面的假陽。68v 嗜靶抗原的自身抗體抗甲狀腺球蛋白、抗胰島素等嗜靶抗原的自身抗體，有時能與靶抗原結(jié)合形成復(fù)合物，在ELISA方法中均可干擾抗原抗體測定結(jié)果。解決的辦法是：測定前需用理化方法將其解離后再測定。69v交叉反應(yīng)物質(zhì)類地高辛、類AFP樣物質(zhì)等，是與靶抗原有交叉反應(yīng)的物質(zhì)。在用多抗測定抗原時對測定結(jié)果影響不大，但在用單克隆抗體測定抗原時，如果交叉抗原測定簇正好是所用單克隆抗體相對的靶決定簇時，也會出現(xiàn)假陽性結(jié)果。70抗凝劑和防腐劑的影響抗凝劑和防腐劑的影響v抗凝劑(如肝素、EDTA、枸櫞酸鈉)，防腐劑(如NaN3)