中藥有效成分及其類似物對(duì)乙酰膽堿酯酶

1、中藥有效成分及其類似物對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制作用研究鮑雅丹 馬 林*基金項(xiàng)目：中山大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院第三屆創(chuàng)新化學(xué)實(shí)驗(yàn)基金項(xiàng)目（批準(zhǔn)號(hào)：02002）資助第一作者：鮑雅丹（1980年出生），女，中山大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院材料化學(xué)專業(yè)99級(jí)指導(dǎo)教師：馬林 Email：cesmal中山大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院有機(jī)化學(xué)研究所，廣州 51027摘要 本研究對(duì)從中藥提取的有效成分及合成的一系列類似物進(jìn)行了抑制乙酰膽堿酯酶的活性測試.發(fā)現(xiàn)具有苯環(huán)或共軛結(jié)構(gòu)的化合物對(duì)乙酰膽堿酯酶有顯著的抑制作用，特別是吲哚喹啉化合物19c的抑制效果最好(IC50=4.8M)，可以作為治療阿爾茨海默氏病的先導(dǎo)藥物。關(guān)鍵詞 乙酰膽堿酯酶 抑

2、制劑 IC50 動(dòng)力學(xué)阿爾茨海默氏病(Alzheimers disease, AD)是常見的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，發(fā)病率較高。主要臨床表現(xiàn)為記憶、智力和識(shí)別功能的不同程度的減退或喪失,目前臨床上用于改善AD患者認(rèn)知障礙的藥物主要是乙酰膽堿酯酶抑制劑。在大規(guī)模、多中心、雙盲和安慰劑的對(duì)照試驗(yàn)中,這類化合物對(duì)AD病人認(rèn)知能力及生活質(zhì)量均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著改善。美國Warner lamber 公司開發(fā)的他克林(tacrine)1是一種乙酰膽堿酯酶的非競爭性抑制劑,1993年經(jīng)FDA批準(zhǔn)上市, 成為第一個(gè)用于治療AD的ACh E劑類藥物。此后又有數(shù)種ACh E抑制劑經(jīng)FDA批準(zhǔn)上市或進(jìn)入臨床試驗(yàn), 如

3、Velnactine、Amiridine等。但它們均有不同程度的毒副作用, 這些毒副作用嚴(yán)重影響了它們在臨床上的應(yīng)用, 這使得有必要開發(fā)療效高毒副作用更小的ACh E抑制劑。乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase, ACh E, EC3 . 1 . 1 . 7. )的主要生理功能為通過快速水解神經(jīng)傳遞介質(zhì)乙酰膽堿（ACh），中止膽堿能突觸中的脈沖傳遞，故 ACh E又稱乙酰膽堿水解酶 (acetylcholine hydrolase)2。CH3COOCH2CH2N+(CH3)3+ACh E CH3CO-ACh E + HOCH2CH2N+ (CH3)3 CH3COO-+H+AC

4、h E 為了篩選出高效、低毒的ACh E抑制劑，我們參考各種ACh E抑制劑的結(jié)構(gòu)類型，研究了從中藥山芝麻和筋骨草分離出的有效成分及其類似物對(duì)ACh E的抑制作用。1 實(shí)驗(yàn)部分1.1 材料與儀器乙酰膽堿酯酶 (Acetylcholinesterase,ACh E, EC3 .1.1.7.)、硫代乙酰膽堿 (Acetylthiocholine)、5, 5 -二硫代雙 (2 -硝基苯甲酸 ) (DTNB)購于Sigma公司；其它試劑為分析純試劑，未經(jīng)進(jìn)一步純化。主要測試儀器：UV-2501PC 型紫外光譜儀、Orion Model 720A型pH計(jì)、Gunt w28 恒溫水浴鍋。1.2方法1.2.

5、1 抑制劑的制備：全合成化合物19 (a-j) 由本實(shí)驗(yàn)室周金林博士提供；化合物1-18由郭新東博士提供從中藥山芝麻和筋骨草中分離的有效成分，結(jié)構(gòu)如下： 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 181.2.2 化合物對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制活性測定取5支1.5 mL分別裝有840 m L 0.1 M pH 8.0磷酸鹽緩沖溶液的梨型管，依次加入0，5，10，20，35，50 m L 1.0 mM的樣品DMSO溶液，并用DMSO補(bǔ)齊至總體積為890 m L。分別加入50m L 4 mg/mL 5, 5-二硫代雙 (2 -硝基苯甲酸 )和10 mL乙酰膽堿酯

6、酶溶液（0.1mg/ml），并在37保溫15 min。立即加入50L2 mg/mL硫代乙酰膽堿溶液，搖勻后測其在= 412 nm處的A值(An)。參比用0.1 M pH 8.0磷酸鹽緩沖溶液。以未加樣品所測得的Acontrol值作為100個(gè)活力單位：相對(duì)酶活力(An /Acontrol)100然后以酶的相對(duì)活力對(duì)抑制劑濃度作圖，根據(jù)抑制曲線求得各種化合物的IC50值（抑制酶活力50時(shí)的抑制劑濃度）。1.2.3 乙酰膽堿酯酶的抑制動(dòng)力學(xué)測定取5支1.5 mL分別裝有840，855，865，880，885 mL 0.1 M pH 8.0磷酸鹽緩沖溶液的梨型管，加入一定量的樣品溶液，并用DMSO補(bǔ)齊

7、至總體積的5。分別加入50 mL 4 mg/mL 5, 5 -二硫代雙 (2 -硝基苯甲酸 )和10 mL乙酰膽堿酯酶溶液，并在37保溫15 min。立即分別加入50，35，25，10，5 mL2 mg/mL硫代乙酰膽堿溶液，搖勻后測其在=412 nm處的時(shí)間掃描曲線。曲線的斜率即為反應(yīng)的初速度V，然后以1/V對(duì)1/S作圖，以不加抑制劑的為控制線。2 結(jié)果與討論2.1 吲哚喹啉生物堿衍生物對(duì)ACh E的抑制活性表1 吲哚喹啉衍生物對(duì)ACh E的抑制IC50值CompoundXnRIC50(mM)pH=7pH=819aNH2N(CH3)2384219bO2N(CH3)27389.519cNH3N

8、(CH3)24.841.519dO3N(CH3)2576819eNH223.72919fO2202219gNH2OH213019hO2OH5376.5CompoundXnRIC50(mM)pH=7pH=819iNH-4623519jO-58163從他克林等化合物的結(jié)構(gòu)可以看出，它是一種喹啉衍生物，具有三環(huán)結(jié)構(gòu)，而我們所合成的吲哚喹啉衍生物在結(jié)構(gòu)上與他可林有許多相似之處，為此我們研究了它們對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制活性，結(jié)果見表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，吲哚喹啉類衍生物（19a-19j）對(duì)乙酰膽堿酯酶均有明顯的抑制作用，化合物19c的抑制效果最好(IC50=4.8 mM) 。五元環(huán)上X原子為NH的抑制效果比O

9、好，原因是NH可增加環(huán)的共軛性，使四個(gè)環(huán)在一個(gè)平面上；而O使環(huán)面不在同一個(gè)平面上，增加了空間位阻，對(duì)酶的抑制作用降低。化合物19c比19a側(cè)鏈上多了一個(gè)碳原子，抑制酶效果增強(qiáng)，說明碳鏈的長短對(duì)抑制活性起作用。另外，抑制劑側(cè)鏈上有親脂性的陽離子頭能更好的被酶的作用位點(diǎn)吸附而較好地抑制酶的活性，化合物19b，19e的抑制活性都沒有19c好可能是由于19b的羥基不易以正離子形式存在，而19e苯酚不是脂肪族側(cè)鏈，且位阻較大，也沒有陽離子頭，較難產(chǎn)生抑制作用。此外，該系列化合物的pKa值都在8左右。pH7時(shí)化合物以鹽的形式存在，環(huán)上的N帶正電荷；pH=8時(shí)化合物沒有成鹽，不能很好抑制酶的活性?？梢钥吹缴?/p>

10、表中所有化合物都在pH7的酸堿體系中有更好的抑制效果。 由以上討論，我們可得出以下幾個(gè)影響抑制劑抑制活性的因素：（1）分子中心存在一個(gè)吲哚喹啉的共軛環(huán)；（2）側(cè)鏈上存在一個(gè)親脂性陽離子頭；（3）脂肪族側(cè)鏈大于兩個(gè)C原子；（4）合適的體系pH值。2.2 中藥有效成分（化合物1-18）對(duì)ACh E的活性抑制由表2可以看出，五環(huán)三萜類化合物4、5、6和7具有較好的活性，與這些化合物的大分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，其中化合物5的抑制活性最好(IC50=13.2 mM)，可能由于它的大分子結(jié)構(gòu)容易和酶的活性部位結(jié)合。其次是化合物10整個(gè)分子形成了大共軛結(jié)構(gòu)，具有很好的活性(IC50=23.8 mM)。合成的醌類化合物

11、和中間體對(duì)ACh E的抑制活性都比較差，或者是沒有活性，或者是由于化合物分子太小，不能與乙酰膽堿酯酶發(fā)生結(jié)合，因而不能有效抑制酶的活性；而同樣是萘醌結(jié)構(gòu)的化合物具有較好的活性，可能是化合物12中含一個(gè)二氫呋喃環(huán)，使分子形成三環(huán)的平面結(jié)構(gòu)，擴(kuò)大了分子的面積能與乙酰膽堿酯酶內(nèi)的多個(gè)位點(diǎn)作用，而有較好的活性；甾醇8和甾醇糖甙9沒有共軛結(jié)構(gòu)，對(duì)ACh E沒有抑制作用。表2 中藥有效成分對(duì)ACh E抑制的IC50值CompoundIC50(mM)CompoundIC50(mM)1169.6777.82160.48No3No9No463.513170.8513.217162.7655.614140.812

12、28.315No1023.816No1149.618No No表示沒活性2.3 乙酰膽堿酯酶的抑制動(dòng)力學(xué)研究為了研究這些化合物對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制動(dòng)力學(xué)行為，我們選取了化合物19c、19f、19g、19i、5、10、17和13進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)不同濃度的抑制劑和底物存在下所測得的數(shù)據(jù)繪制的Lineweaver-Burk曲線見圖1。 圖1 化合物與乙酰膽堿酯酶反應(yīng)的Lineweaver-Burk圖數(shù)據(jù)表明化合物19g、19i、10對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制為混和型抑制劑；化合物19c、19f、13、17為非競爭性抑制劑，與酶的調(diào)控部位結(jié)合；大分子化合物5為競爭性抑制劑進(jìn)入酶的活性中心發(fā)生抑制作用。以上的結(jié)

13、果表明化合物19c的抑制效果最好（IC50=4.8mM），可以作為先導(dǎo)化合物；而化合物5（IC50=13.2mM）與目前臨床用的抑制劑他克林（IC50=13.0mM）具有類似的抑制效果；由于齊敦果酸型的五環(huán)三萜類化合物具有消炎、增強(qiáng)免疫、抑制血小板降集、降糖以及治療急性黃膽型肝炎和慢性病毒肝炎的作用12，我們可以將它作為具有多種功能的藥物來開發(fā)。其次是具有苯環(huán)和共軛的萘醌類化合物12（IC50=28.3mM）和10（IC50=23.8mM）及吲哚喹啉衍生物，它們也有較好的抑制活性，可以將它們作為先導(dǎo)化合物，在分子中引入帶正電荷基團(tuán)如氨/胺基，增強(qiáng)分子與ACh E的作用，提高它們的抑制效果。致謝

14、 本研究是在馬林教授，郭新東和周金林兩位博士的悉心指導(dǎo)和幫助下完成的，他們對(duì)科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽B(tài)度和孜孜不倦的精神使我受益菲淺，在此對(duì)他們表示衷心的感謝。同時(shí)還要感謝化工學(xué)院創(chuàng)新基金對(duì)本研究提供的資助。參 考 文 獻(xiàn)1 Bartus B T, Dean R l, Pontecorvo M J, et al. The cholinergic hypothesis: a historical over view, currentpers pective, and future directions. Ann. N.Y. Acad. Sci., 1985, 444: 3322 Sussmann J L.,

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