實(shí)驗(yàn)40植物組織中過(guò)氧化氫含量及過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定

1、實(shí)驗(yàn)40植物組織中過(guò)氧化氫含量及過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定植物在逆境下或衰老時(shí)，由于體內(nèi)活性氧代謝加強(qiáng)而使H2O2發(fā)生累積。H2O2可以直接或間接地氧化細(xì)胞內(nèi)核酸，蛋白質(zhì)等生物大分子，并使細(xì)胞膜遭受損害，從而加速細(xì)胞的衰 老和解體。過(guò)氧化氫酶可以清除H2O2,是植物體內(nèi)重要的酶促防御系統(tǒng)之一。因此，植物組織中H2O2含量和過(guò)氧化氫酶活性與植物的抗逆性密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)用分光光度法測(cè)定過(guò) 氧化氫含量，利用高錳酸鉀滴定法和紫外吸收法測(cè)定過(guò)氧化氫酶活性。一、過(guò)氧化氫含量的測(cè)定【原理】H2O2與硫酸鈦（或氯化鈦）生成過(guò)氧化物一鈦復(fù)合物黃色沉淀，可被H2 SO4溶解后，在415nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定。在一定范圍內(nèi)，其

2、顏色深淺與H2O2濃度呈線性關(guān)系。【儀器和用具】研缽；移液管 0.2ml X 2支，5ml X 1支；容量瓶10ml X 7個(gè)，離心管5ml X 8支；離心 機(jī)；分光光度計(jì)?！驹噭?00卩mol/L H2O2丙酮試劑：取 30%分析純H2O2 57卩l(xiāng)，溶于100ml，再稀釋100倍;2mol/L硫酸；5% （W/V ）硫酸鈦；丙酮；濃氨水。【方法】1制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：取10ml離心管7支，順序編號(hào)，并按表 40-1加入試劑。表40-1測(cè)定H2O2濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線配置表試劑（ml）離心管號(hào)1234567100 卩 mol/L H2O200.10.20.40.60.81.04 'C下預(yù)冷丙酮1

3、.00.90.80.60.40.205%硫酸鈦0.10.10.10.10.10.10.1濃氨水0.20.20.20.20.20.20.23000r/min離心10min，棄去上清夜，留沉淀2mol硫酸5.05.05.05.05.05.05.0待沉淀完全溶解后，將其小心轉(zhuǎn)入 10ml容量瓶中，并用蒸餾水少量多次沖洗離心管， 將洗滌液合并后定容至10ml刻度，415nm波長(zhǎng)下比色。2樣品提取和測(cè)定：（1）稱取新鮮植物組織 25g （視H2O2含量多少而定），按材料與提 取劑1 : 1的比例加入4C下預(yù)冷的丙酮和少許石英砂研磨成勻漿后，轉(zhuǎn)入離心管3000 r/min下離心10min，棄去殘?jiān)?，上清?/p>

4、即為樣品提取液。（2）用移液管吸取樣品提取液1ml，按表35-1加入5%硫酸鈦和濃氨水，待沉淀形成后3000rpm/min離心10min，棄去上清液。沉淀用丙酮反復(fù)洗滌35次，直到去除植物色素。（3）向洗滌后的沉淀中加入 2mol硫酸5ml,待 完全溶解后，與標(biāo)準(zhǔn)曲線同樣的方法定容并比色。3結(jié)果計(jì)算：C Vt植物組織中H2O2含量（卩mol/g Fw）= FW Vl式中 C 標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品中H2O2濃度（卩mol）;Vt樣品提取液總體積（ml）;V1測(cè)定時(shí)用樣品提取液體積（ml）;FW植物組織鮮重（g）。二、過(guò)氧化氫酶的活性測(cè)定高錳酸鉀滴定法【原理】過(guò)氧化氫酶（CAT）屬于血紅蛋白酶，含有

5、鐵，它能催化過(guò)氧化氫分解為水和分子氧， 在此過(guò)程中起傳遞電子的作用，過(guò)氧化氫則既是氧化劑又是還原劑。2eR（Fe+2）+H；O2=R（Fe+3+OH）2eI IR（Fe+3OH）2+H2O2=R（Fe+2）2+2H2O+O2據(jù)此，可根據(jù)H2O2的消耗量或O2的生成量測(cè)定該酶活力大小。在反應(yīng)系統(tǒng)中加入一定 量（反應(yīng)過(guò)量）的 H2O2溶液，經(jīng)酶促反應(yīng)后，用標(biāo)準(zhǔn)高錳酸鉀溶液（在酸性條件下）滴定 多余的出025H2O2+2KMnO 4+4H2SO4 5O2+2KHSO 4+8H2O+2MnSO 4即可求出消耗的 H2O2的量?！緝x器和用具】研缽；三角瓶50ml X 4;酸式滴定管（10ml）;恒溫水浴

6、；容量瓶 25ml X 1?！驹噭?0% H2SO4; 0.2mol/L 磷酸緩沖液 pH7.8;0.1mol/L高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液：稱取KMnO 4 （AR ） 3.1605g，用新煮沸冷卻蒸餾水配制成1000ml，用0.1mol/L草酸溶液標(biāo)定；0.1mol/L H 2O2：市售 30% H2O2大約等于 17.6mol/L，取 30% H 2O2溶液 5.68ml，稀釋至 1000ml，用標(biāo)準(zhǔn)0.1mol/ KMnO 4溶液（在酸性條件下）進(jìn)行標(biāo)定；0.1mol/L草酸：稱取優(yōu)級(jí)純 H2C2O4 2H2O 12.607g，用蒸餾水溶解后，定容至 1L?！痉椒ā?. 酶液提取取小麥葉片2.5

7、g加入pH7.8的磷酸緩沖溶液少量，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移至 25ml容量瓶中，用該緩沖液沖洗研缽，并將沖洗液轉(zhuǎn)入容量瓶中，用同一緩沖液定容， 4000rpm離心15min，上清液即為過(guò)氧化氫酶的粗提液。2. 取50ml三角瓶4個(gè)（兩個(gè)測(cè)定兩個(gè)對(duì)照），測(cè)定瓶中加入酶液 2.5ml，對(duì)照瓶中加入 煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H 2O2，同時(shí)計(jì)時(shí)，于 30C恒溫水浴中保溫 10min , 立即加入 10% H2SO4 2.5ml。3. 用 0.1mol/L KMn O 4標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定 H2O2,至出現(xiàn)粉紅色（在30min內(nèi)不消失）為終點(diǎn)。4. 結(jié)果計(jì)算：酶活性用每克鮮重樣品

8、1min內(nèi)分解H2O2的毫克數(shù)表示：（A B） Vt 1.7酶活（mgH 202/gFW min）=FW V1 t式中 A 對(duì)照KMnO 4滴定毫升數(shù)；B 酶反應(yīng)后KMnO4滴定毫升數(shù)；Vt酶液總量（ml）;V1反應(yīng)所用酶液量（ml）;W 樣品鮮重（g）；1.7 1ml 0.1mol/L 的 KMnO4相當(dāng)于 1.7mg H2O2?！咀⒁狻克肒MnO4溶液及H2O2溶液臨用前要經(jīng)過(guò)重新標(biāo)定。三、過(guò)氧化氫酶的活性測(cè)定紫外吸收法【原理】H2O2在240nm波長(zhǎng)下有強(qiáng)烈吸收，過(guò)氧化氫酶能分解過(guò)氧化氫， 使反應(yīng)溶液吸光度（A 240） 隨反應(yīng)時(shí)間而降低。根據(jù)測(cè)量吸光率的變化速度即可測(cè)出過(guò)氧化氫酶的活

9、性?！緝x器與用具】紫外分光光度計(jì)；離心機(jī)；研缽； 250ml容量瓶1個(gè)；0.5ml刻度吸管2支，2ml刻度 吸管1支；10ml試管3支；恒溫水??；【試劑】0.2mol/L pH7.8磷酸緩沖液（內(nèi)含 1%聚乙烯吡咯烷酮）；0.1mol/L H 2O2 （用 0.1mol/L 高錳酸鉀標(biāo)定）。【方法】1. 酶液提?。悍Q取新鮮小麥葉片或其它植物組織0.5g置研缽中，加入 23ml 4C下預(yù)冷的pH7.0磷酸緩沖液和少量石英砂研磨成勻漿后，轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中，并用緩沖液沖洗研缽數(shù)次，合并沖洗液，并定容到刻度。混合均勻?qū)⒘科恐?C冰箱中靜置10min，取上部澄清液在4000rpm下離心15min，上

10、清液即為過(guò)氧化氫酶粗提液。5C下保存?zhèn)溆谩?. 測(cè)定：取10ml試管3支，其中2支為樣品測(cè)定管，1支為空白管，按表 40-2順序加 入試劑。表40-2紫外吸收法測(cè)定H2O2樣品液配置表管號(hào)S1S2S3粗酶液（ml）0.00.20.2pH7.8 磷酸(ml)1.51.51.5蒸餾水（ml）1.01.01.025C預(yù)熱后，逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2,每加完一管立即記時(shí)，并迅速倒入石英 比色杯中，240nm下測(cè)定吸光度，每隔1min讀數(shù)1次，共測(cè)4min，待3支管全部測(cè)定完后, 按下式計(jì)算酶活性。3. 結(jié)果計(jì)算：以1min內(nèi)A240減少0.1的酶量為1個(gè)酶活單位（u）。A240 VT過(guò)氧化氫酶活性（u/gFW/min）= °V1 t FW （AsiAs2）式中A 24° = As°2As°加入煮死酶液的對(duì)照管吸光值；Asi, As2樣品管吸光值;