微生物 基因工程菌

1、基因工程菌2大腸桿菌3被選為基因工程菌的原因常見(jiàn)易得，易于培養(yǎng)質(zhì)粒為常用運(yùn)載體代謝迅速, 經(jīng)濟(jì)高效基因工程菌的通性基因工程菌的通性4作為表達(dá)外源基因受體菌的優(yōu)劣比較劣勢(shì)缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)霉素優(yōu)勢(shì)基因克隆表達(dá)系統(tǒng)完善全基因組測(cè)序，共有4405個(gè)開(kāi)放型閱讀框架繁殖迅速、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、操作方便、遺傳穩(wěn)定被美國(guó)FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物工程菌高密度發(fā)酵工藝自重組DNA技術(shù)產(chǎn)生以來(lái)，許多在臨床上具有重要治療價(jià)值的蛋白藥物通過(guò)攜帶有目的基因的大腸桿菌成功地在實(shí)驗(yàn)室和工廠得以生產(chǎn)。利用基因重組

2、技術(shù)構(gòu)建的基因工程菌的發(fā)酵工藝不同于傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝，生物工程菌發(fā)酵的目的是希望能狄得大量的外源基因產(chǎn)物，盡可能減少宿主細(xì)胞本身蛋白的污染。外源基因的高水平表達(dá)不僅涉及宿主、載體和目的基因二者之間的相互關(guān)系，而且與其所處環(huán)境條件息息相關(guān)，因此僅按傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝生產(chǎn)生物制品是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，需要對(duì)影響外源基因表達(dá)的因素進(jìn)行分析，探索出適合外源基因表達(dá)的發(fā)酵工藝。高密度、高產(chǎn)率和高濃度培養(yǎng)是近幾年發(fā)酵工業(yè)的目標(biāo)和方向。對(duì)于大腸桿菌，尤其是重組大腸桿菌的發(fā)酵來(lái)講，實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵，可相應(yīng)的縮小生物反應(yīng)器的體積和降低生物量的分離費(fèi)用，從而降低生產(chǎn)成本，達(dá)到提高生產(chǎn)效率的目的。通過(guò)對(duì)基因工程菌(RRhPI-pQ

3、E40 E.coli M15)發(fā)酵條件的優(yōu)化，可以看出搖床轉(zhuǎn)速與補(bǔ)料方式對(duì)發(fā)酵結(jié)果影響最大.搖床轉(zhuǎn)速與發(fā)酵過(guò)程中氧氣的供給有很大的關(guān)系。大腸桿菌的生長(zhǎng)代謝需要氧氣的參與，溶解氧濃度對(duì)菌體的生長(zhǎng)及重組產(chǎn)物的影響很大，溶解氧的濃度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響大腸桿菌的代謝，使后期生長(zhǎng)變得極為緩慢，而且會(huì)降低重組蛋白的表達(dá)量.菌體在進(jìn)行大量的增殖過(guò)程中，消耗氧進(jìn)行氧化分解代謝，因而飽和氧的及時(shí)供給非常重要。隨著發(fā)酵的進(jìn)行菌體的細(xì)胞密度迅速增加，溶解氧的濃度因不斷被菌體消耗而降低，細(xì)胞的生長(zhǎng)開(kāi)始減慢，ST值下降，尤其在發(fā)酵后期，下降幅度更大。在高密度發(fā)酵后期，由于菌體密度的擴(kuò)增，耗氧量極大，發(fā)酵罐的各項(xiàng)物理參數(shù)

4、均不能滿足對(duì)氧的供給，結(jié)果導(dǎo)致外源蛋白的表達(dá)量很低。所以維持較高水平的溶氧濃度能提高帶有重組質(zhì)粒的大腸桿菌的生長(zhǎng)繁殖，有利于外源基因的重組蛋白的表達(dá)。一般的高密度發(fā)酵的通風(fēng)速度達(dá)到18L/min ( 20L發(fā)酵罐)，攪拌速度達(dá)到500rpm以上，往往還需要供給純氧，需保持60%以上的溶氧飽和度，這樣才能提高帶有重組質(zhì)粒細(xì)胞的生長(zhǎng)，利于外源蛋白產(chǎn)物的形成。需要注意的是，要考慮通風(fēng)速度和攪拌速度的增加對(duì)泡沫的產(chǎn)生和發(fā)酵液粘稠度的影響，需要在培養(yǎng)基中加入適宜的消泡劑。6酵母菌7酵母菌在工程菌中的應(yīng)用單細(xì)胞真核生物的酵母菌具有比較完備的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的加工修飾能力。釀酒酵母（Saccha

5、romyces.Cerevisiae）在分子遺傳學(xué)方面被人們的認(rèn)識(shí)最早，也是最先作為外源基因表達(dá)的酵母宿主。1981年釀酒酵母表達(dá)了第一個(gè)外源基因-干擾素基因，隨后又有一系列外源基因在該系統(tǒng)得到表達(dá)干擾素和胰島素雖然已經(jīng)利用釀酒酵母大量生產(chǎn)并被廣泛應(yīng)用，當(dāng)利用釀酒酵母制備時(shí)，實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果很令人鼓舞，但由實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)展到工業(yè)規(guī)模時(shí)，其產(chǎn)量迅速下降。原因是培養(yǎng)基中維特質(zhì)粒高拷貝數(shù)的選擇壓力消失質(zhì)粒變得不穩(wěn)定，拷貝數(shù)下降?？截悢?shù)是高效表達(dá)的必備因素，因此拷貝數(shù)下降，也直接導(dǎo)致外源基因表達(dá)量的下降。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)室用培養(yǎng)基成分復(fù)雜且昂貴，當(dāng)采用工業(yè)規(guī)模能夠接受的培養(yǎng)基時(shí)，導(dǎo)致了產(chǎn)量的下降。為克服釀酒酵母的局限

6、，1983年美國(guó)Wegner等人最先發(fā)展了以甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母（methylotrophic yeast）為代表的第二代酵母表達(dá)系統(tǒng)。甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母包括：Pichia、Candida等以Pichia.pastoris（畢赤巴斯德酵母）為宿主的外源基因表達(dá)系統(tǒng)近年來(lái)發(fā)展最為迅速，應(yīng)用也最為廣泛。酵母菌作為基因工程菌的優(yōu)勢(shì)1.酵母菌是最成熟的真核生物表達(dá)系統(tǒng)2.全基因組測(cè)序，基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理比較清楚，遺傳操作簡(jiǎn)單3.具有原核生物無(wú)法比擬的真核蛋白翻譯后加工系統(tǒng)4.大規(guī)模發(fā)酵歷史悠久，技術(shù)成熟，工藝簡(jiǎn)單，成本低廉。5.能將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中6.不含有特異性的病毒，不產(chǎn)內(nèi)毒素9傳統(tǒng)酵母轉(zhuǎn)化系統(tǒng)

7、先使纖維素酶基因與表達(dá)載體相結(jié)合，再將重組體轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞內(nèi)形成轉(zhuǎn)化子，表達(dá)目的基因，從而產(chǎn)生纖維素酶蛋白，這是傳統(tǒng)酵母轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。目前有 2種方法可以使酵母細(xì)胞攝取外源 DNA ，即原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和完整細(xì)胞轉(zhuǎn)化。現(xiàn)在采用較多的是完整細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法，該方法是1983年發(fā)展起來(lái)的。此方法雖然要用Li離子處理細(xì)胞，但和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法相比，則比較簡(jiǎn)單，在篩選轉(zhuǎn)化子時(shí)，不必進(jìn)行細(xì)胞壁再生，而且Li離子處理完整酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率比原生質(zhì)體的高。但必須用聚乙二醇處理轉(zhuǎn)化細(xì)胞，否則轉(zhuǎn)化率會(huì)大幅度下降。11酵母表面展示系統(tǒng)酵母表面展示系統(tǒng)的類型目前，最常見(jiàn)的酵母表面展示表達(dá)系統(tǒng)包括: 凝集素展示表達(dá)凝集素展示表達(dá)和

8、絮凝素絮凝素展示表達(dá)展示表達(dá)。凝集素展示表達(dá)系統(tǒng)是將外源基因與酵母編碼凝集素C端編碼序列(含GPI錨定信號(hào)序列)連接后插入質(zhì)粒載體的信號(hào)肽下游， 融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)后， 信號(hào)肽引導(dǎo)嵌合蛋白向細(xì)胞外分泌， 由于融合蛋白C末端存在含GPI錨定信號(hào)的凝集素多肽序列，可將蛋白錨定在酵母細(xì)胞壁中，從而將蛋白分子展示表達(dá)在酵母細(xì)胞表面。絮凝素展示表達(dá)系統(tǒng)利用絮凝素基因與外源蛋白融合，并將融合蛋白展露表達(dá)在細(xì)胞表面，此系統(tǒng)又包括兩個(gè)子系統(tǒng): GPI錨定系統(tǒng)和絮凝結(jié)構(gòu)域錨定系統(tǒng)。GPI錨定系統(tǒng)是利用絮凝素Flo1p的C末端含有的GPI信號(hào)錨定外源蛋白，此系統(tǒng)與凝集素展示相似; 絮凝結(jié)構(gòu)域錨定系統(tǒng)是利用Flo1p

9、的中間絮凝功能結(jié)構(gòu)域與外源蛋白融合，通過(guò)絮凝功能結(jié)構(gòu)域識(shí)別酵母細(xì)胞壁中的甘露聚糖鏈并非共價(jià)作用誘導(dǎo)細(xì)胞粘附、聚集成可逆性絮狀物。酵母表面展示與酶技術(shù)酶的固定化是指借助物理或者化學(xué)方法將酶固定于特殊的相，使得酶與整體流體分開(kāi)，但是仍然能夠進(jìn)行底物和效應(yīng)物分子交換并發(fā)揮其催化效能的一種技術(shù)。與游離酶相比，固定化酶提高了酶的穩(wěn)定性，并使酶能夠反復(fù)回收利用。但是，傳統(tǒng)的固定化方法也會(huì)產(chǎn)生一些不利因素，例如由于增加固定化操作，導(dǎo)致酶固定化過(guò)程中的活性收率損失；另外由于固定化操作需用載體，因而增加了載體成本費(fèi)和固定化操作費(fèi)用。酵母表面展示與酶技術(shù)利用表面展示技術(shù)將具有催化活性的酶展示于酵母等微生物細(xì)胞表面

10、就形成了全細(xì)胞催化劑，與傳統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)酶和外分泌酶不同，表面展示的酶以共價(jià)或非共價(jià)方式固定于細(xì)胞外表面，這種獨(dú)特的空間定位使其相對(duì)自由酶而言有許多優(yōu)良的特性，如溫度、有機(jī)溶劑穩(wěn)定性、可多次重復(fù)使用等，這些特點(diǎn)與傳統(tǒng)的固定化酶技術(shù)相似，但無(wú)需額外的蛋白純化和固定的操作，有著良好的應(yīng)用前景。Katsumi利用凝集素系統(tǒng)將來(lái)源于產(chǎn)黃菌屬的 OPH 展示于酵母細(xì)胞表面，細(xì)胞熒光強(qiáng)度測(cè)量表明每個(gè)細(xì)胞表面可以展示 1.410 4 個(gè) OPH 分子，酵母展示系統(tǒng)OPH酶活性較大腸桿菌冰晶核蛋白展示的酶活性更高，為有機(jī)磷化合物的脫毒提供了一種有效的生物催化劑。表面展示與酒精發(fā)酵傳統(tǒng)的酒精發(fā)酵是以淀粉質(zhì)谷物或糖蜜

11、為原料。隨著燃料酒精需求的日益增長(zhǎng)，以天然纖維素類資源生產(chǎn)酒精的研究也日益受到人們重視。由于纖維素類物質(zhì)是自然界中一種潛在的可再生資源，對(duì)解決未來(lái)能源問(wèn)題有著巨大的潛力，因此，天然纖維素酒精發(fā)酵具有重要意義。Fujita 等成功地將三種纖維素水解酶同時(shí)展示在釀酒酵母表面，從而構(gòu)建了能夠增效和按順序降解纖維素的全細(xì)胞生物催化劑。酵母表面展示系統(tǒng)與新藥篩選 將未知功能的目的基因產(chǎn)物或特定病理過(guò)程相關(guān)蛋白產(chǎn)物展示在酵母表面，對(duì)cDNA 表達(dá)文庫(kù)或突變體庫(kù)進(jìn)行篩選，能發(fā)現(xiàn)與這些未知功能的基因產(chǎn)物或病理過(guò)程相關(guān)產(chǎn)物發(fā)生相互作用的物質(zhì)，有助于對(duì)未知基因功能的研究，并能發(fā)現(xiàn)一些藥物作用的新靶點(diǎn)，或篩選到治療

12、疾病的新藥先導(dǎo)化合物。Visintin 等將酵母表面展示技術(shù)與酵母雙雜交技術(shù)相結(jié)合，將抗體的scFv 片斷連接到轉(zhuǎn)錄因子VP16 的激活結(jié)構(gòu)域( AD) 上， 將抗原連接到LexA的結(jié)合結(jié)構(gòu)域( DB) 上，以His3和LacZ 為報(bào)告基因， 建立抗原抗體相互作用的展示方法。當(dāng)抗原- 抗體發(fā)生相互作用時(shí)，AD 和DB 的結(jié)合將啟動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá)，可通過(guò)營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基進(jìn)行檢測(cè)。這種方法從scFv 突變體展示庫(kù)中將有可能篩選到抗原特異的抗體，為疫苗及抗體類藥物的研制提供良好的平臺(tái)。酵母細(xì)胞表面展示與生物吸附環(huán)境污染物的生物修復(fù)是以酶促降解或生物吸附為基礎(chǔ)的，例如微生物對(duì)重金屬的吸附就包括兩種途徑:

13、 ( 1) 與細(xì)胞表面復(fù)合物結(jié)合，( 2) 逐漸吸收在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行消化。然而通過(guò)胞內(nèi)消化降解有毒物質(zhì)必須使細(xì)胞內(nèi)酶，蛋白質(zhì)或污染物跨越細(xì)胞膜這一屏障，比較緩慢及效率低而且不可重復(fù)利用利用表面展示技術(shù)能較好地解決這一問(wèn)題，吸附蛋白直接展示在細(xì)胞表面，不僅使吸附過(guò)程快捷高效還可以利用回復(fù)劑如EDTA 對(duì)其進(jìn)行處理使之不斷重復(fù)利用。蘇云金芽孢桿菌蘇云金芽孢桿菌殺蟲(chóng)原理產(chǎn)生芽孢時(shí)產(chǎn)生伴孢晶體由幾種晶體蛋白即-2內(nèi)毒素組成-2內(nèi)毒素分為Cry和Cyt兩類：Cry活體條件下只對(duì)雙翅目幼蟲(chóng)有毒,離體條件下具廣譜性;Cry分為4種,CryI對(duì)鱗翅目幼蟲(chóng)有毒, CryII對(duì)鱗翅目和雙翅目均有毒,CryIII對(duì)鞘翅

14、目有毒,CryIV對(duì)雙翅目有毒。20蘇云金芽孢桿菌基因改造作物優(yōu)點(diǎn)蘇云金芽孢桿菌基因改造作物有如下優(yōu)點(diǎn)：殺蟲(chóng)毒素釋放量大，足以殺滅害蟲(chóng)植物產(chǎn)生的毒素不會(huì)釋放到外界，只有植食害蟲(chóng)才會(huì)進(jìn)食死亡產(chǎn)生毒素可由組織特異性啟動(dòng)子調(diào)控抗蟲(chóng)性是依據(jù)孟德?tīng)柕倪z傳規(guī)律進(jìn)行穩(wěn)定遺傳毒素基因可裝載在葉綠體基因中，因此排除了通過(guò)花粉傳播的途徑天然蘇云金芽孢桿菌作為殺蟲(chóng)菌的缺陷蘇云金芽孢桿菌存在的殺蟲(chóng)譜窄、持效期短等缺陷。嚴(yán)重影響了蘇云金芽孢桿菌的實(shí)際應(yīng)用。但與轉(zhuǎn)基因植物相比，基因重組微生物具有研究快速、生產(chǎn)方便、應(yīng)用靈活、害蟲(chóng)不易產(chǎn)生抗性等諸多優(yōu)點(diǎn)。從自然界篩選新的蘇云金芽孢桿菌菌株利用分子生物學(xué)的技術(shù)鑒定和克隆具有新殺蟲(chóng)特性的殺蟲(chóng)晶體蛋白基因利用基因重組結(jié)合轉(zhuǎn)移等基因工程的手段構(gòu)建新的或具有多重殺蟲(chóng)功效的蘇云金芽孢桿菌工程菌目前國(guó)內(nèi)外對(duì)蘇云金芽孢桿菌工程菌的改造主要集中在：擴(kuò)大殺蟲(chóng)范圍增強(qiáng)持效性植物內(nèi)生性在水體中提高活性改善土壤中的活性提高毒力等23農(nóng)藥真菌24真菌能作為昆蟲(chóng)農(nóng)藥的理論依據(jù)真菌是昆蟲(chóng)病原微生物中最大的一個(gè)類群，已發(fā)現(xiàn)約有1000 種自然條件下全部病死昆蟲(chóng)中約60% 因真菌致病而亡與病毒、細(xì)菌通過(guò)胃毒殺蟲(chóng)的途徑不同, 真菌主要通過(guò)昆蟲(chóng)體壁侵染昆蟲(chóng), 可侵染刺吸式口器的昆蟲(chóng)和處于非取食期的昆蟲(chóng)卵和蛹等真菌侵染和致病機(jī)制復(fù)