非核素標(biāo)記檢測(cè)端粒酶活性的研究_第1頁(yè)
非核素標(biāo)記檢測(cè)端粒酶活性的研究_第2頁(yè)
非核素標(biāo)記檢測(cè)端粒酶活性的研究_第3頁(yè)
全文預(yù)覽已結(jié)束

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡(jiǎn)介

1、非核素標(biāo)記檢測(cè)端粒酶活性的研究         Kim1于1994年借助PCR技術(shù)建立了靈敏的端粒酶檢測(cè)端粒重復(fù)片段擴(kuò)增(telomerase repeat amplification protocol,TRAP)。我們對(duì)Kim的方法加以改進(jìn),建立了簡(jiǎn)便、非同位素的銀染檢測(cè)法,檢測(cè)了腦瘤、腸癌、食管癌中端粒酶的活性。 一、材料與方法 1.總蛋白提取:         Kim1于1994年借助PCR技術(shù)建立了靈敏的端粒酶檢測(cè)端粒重復(fù)片段擴(kuò)

2、增(telomerase repeat amplification protocol,TRAP)。我們對(duì)Kim的方法加以改進(jìn),建立了簡(jiǎn)便、非同位素的銀染檢測(cè)法,檢測(cè)了腦瘤、腸癌、食管癌中端粒酶的活性。 一、材料與方法 1.總蛋白提?。菏中g(shù)后取下的活組織,液氮保存。(1)100 ml提取液中含10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5);1 mmol/L MgCl2;1 mmol/L EGTA,0.5 mmol/L -巰基乙醇;0.5% CHAPS,體積分?jǐn)?shù)為10%的甘油。(2)組織中提取總蛋白:取約30 mg組織用無菌眼科手術(shù)剪盡量剪碎,加入200 l提取液,冰浴30 min后,4

3、1 600 g離心20 min。吸取上清約150 l待測(cè)。 2.TRAP反應(yīng):(1)引物及稀釋:RNA模板逆轉(zhuǎn)錄引物TS:5-AATCCGTCGAGCAGAGTT-318mer,MW=5 524,濃度為0.541 g/L。PCR引物CX:5-CCTTACCCTTACCCTTACCC TAA324mer,MW=7 104,濃度為0.688 g/L。(2)PCR擴(kuò)增:將Kim1的方法改進(jìn)為:50 l PCR液含20 mmol/L Tris-HCl (pH8.3);1.5 mmol/L MgCl2;63 mmol/L KCl;0.005%Tween-20;1 mmol/L EGTA;200 mmol

4、/L dNTP;0.1 gT4 g32 蛋白;0.1 g/L牛血清白蛋白;0.1 g TS引物;2 U Taqase;0.51.0 mg總蛋白。25 20 min,加入0.1 g CX引物。94預(yù)變性5 min,9430 s50 s7290 s 30個(gè)循壞,72延伸10 min。 3.電泳:12%非變性聚丙烯酰胺凝膠,取10 l PCR產(chǎn)物,加2 l 6×Lodding buffer,150 V恒壓2 h。 4.銀染:(1)固定:膠在10%冰乙酸中,洗1次。(2)銀染:0.2%AgNO3 300 ml,加入0.5 ml甲醛,染色10 min,洗1次。(3)顯色:3%Na2CO3 30

5、0 ml,加甲醛0.5 ml,顯色至清晰。(4)終止:10%冰乙酸300 ml,終止顯色。 二、結(jié)果 用非核素TRAP-銀染端粒酶活性檢測(cè)法45例手術(shù)標(biāo)本,腦腫瘤陽性率為70.58%(12/17),腸癌陽性率為84.62%(11/13),食管癌陽性率為90%(9/10),食管癌旁組織陽性率為90%(4/5),用2種方法對(duì)15例標(biāo)本對(duì)比檢測(cè),TRAP-ELISA法檢出9例陽性,TRAP-銀染法檢出9例陽性 ,結(jié)果一致。 三、討論 端粒酶活性檢測(cè)常用Kim1的TRAP法,在PCR過程中摻入同位素標(biāo)記-32P dGTP/dCTP,產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳,放射自顯影顯示相差6個(gè)核苷酸的DNA ladd

6、er條帶,以判斷端粒酶活性。該方法敏感,已被國(guó)際上多家實(shí)驗(yàn)室采用,但由于核素,造成檢測(cè)周期長(zhǎng)(約7周),污染環(huán)境,要求有特殊而專一的實(shí)驗(yàn)室,使其 廣泛應(yīng)用受到限制。為此,我們對(duì)Kim1的方法進(jìn)行改進(jìn),建立了不需加入核素,直接進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物電泳后硝酸銀染色,顯示DNA梯狀電泳帶的方法。同時(shí)應(yīng)用保靈曼公司的TRAP-ELISA端粒酶活性半定量法,對(duì)照檢測(cè)。兩種方法對(duì)比檢測(cè)結(jié)果一致。說明我們的方法同樣敏感、準(zhǔn)確,且簡(jiǎn)便易推廣。 端粒是真核細(xì)胞染色體末端的“帽子”,由多拷貝串聯(lián)的6核苷酸5TTAGGG3重復(fù)序列和特異蛋白質(zhì)結(jié)合構(gòu)成,具有維持染色體末端穩(wěn)定和遺傳信息不丟失的功能。按照DNA復(fù)

7、制模型,DNA復(fù)制1次,母鏈5端就有1段DNA無法拷貝到子鏈中去,將造成DNA鏈愈來愈短,遺傳信息丟失。真核生物線性DNA分子靠末端6核苷酸多拷貝序列(既端粒)和端粒酶的激活,保證遺傳信息復(fù)制時(shí)的完全性。細(xì)胞生命周期有限 ,染色體端粒隨細(xì)胞的分裂不斷丟失,當(dāng)端粒長(zhǎng)度減小到一定臨界值(24 kb)時(shí),細(xì)胞即趨向衰老、死亡。端粒被認(rèn)為是細(xì)胞有絲分裂的“生物鐘”2。有報(bào)道癌細(xì)胞和培養(yǎng)的永生化細(xì)胞有較短的端粒長(zhǎng)度和較強(qiáng)的端粒酶活性,正常體細(xì)胞檢測(cè)不到端粒酶活性,而生殖細(xì)胞、胚胎細(xì)胞有端粒酶表達(dá),可見端粒酶催化合成端粒的重復(fù)片段添加到端粒,對(duì)維持細(xì)胞端粒的動(dòng)態(tài)平衡、保證細(xì)胞的分裂能力起重要作用3,4。我們檢測(cè)17例腦腫瘤中有13例腦膠質(zhì)瘤、10例端粒酶陽性,其中惡性程度低的星形細(xì)胞瘤級(jí)標(biāo)本中端粒酶陽性率為40%(2/5),而低分化的惡性星形細(xì)胞瘤和級(jí)端粒酶陽性率為100%(8/8

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁(yè)內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 人人文庫(kù)網(wǎng)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評(píng)論

0/150

提交評(píng)論