非核素標(biāo)記檢測(cè)端粒酶活性的研究

1、非核素標(biāo)記檢測(cè)端粒酶活性的研究         Kim1于1994年借助PCR技術(shù)建立了靈敏的端粒酶檢測(cè)端粒重復(fù)片段擴(kuò)增(telomerase repeat amplification protocol，TRAP)。我們對(duì)Kim的方法加以改進(jìn)，建立了簡(jiǎn)便、非同位素的銀染檢測(cè)法，檢測(cè)了腦瘤、腸癌、食管癌中端粒酶的活性。 一、材料與方法 1.總蛋白提取：         Kim1于1994年借助PCR技術(shù)建立了靈敏的端粒酶檢測(cè)端粒重復(fù)片段擴(kuò)

2、增(telomerase repeat amplification protocol，TRAP)。我們對(duì)Kim的方法加以改進(jìn)，建立了簡(jiǎn)便、非同位素的銀染檢測(cè)法，檢測(cè)了腦瘤、腸癌、食管癌中端粒酶的活性。 一、材料與方法 1.總蛋白提?。菏中g(shù)后取下的活組織，液氮保存。(1)100 ml提取液中含10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)；1 mmol/L MgCl2；1 mmol/L EGTA,0.5 mmol/L -巰基乙醇；0.5% CHAPS，體積分?jǐn)?shù)為10%的甘油。(2)組織中提取總蛋白：取約30 mg組織用無菌眼科手術(shù)剪盡量剪碎，加入200 l提取液，冰浴30 min后，4

3、1 600 g離心20 min。吸取上清約150 l待測(cè)。 2.TRAP反應(yīng)：(1)引物及稀釋：RNA模板逆轉(zhuǎn)錄引物TS：5-AATCCGTCGAGCAGAGTT-318mer，MW=5 524，濃度為0.541 g/L。PCR引物CX：5-CCTTACCCTTACCCTTACCC TAA324mer,MW=7 104,濃度為0.688 g/L。(2)PCR擴(kuò)增：將Kim1的方法改進(jìn)為：50 l PCR液含20 mmol/L Tris-HCl (pH8.3);1.5 mmol/L MgCl2;63 mmol/L KCl;0.005%Tween-20;1 mmol/L EGTA;200 mmol

4、/L dNTP;0.1 gT4 g32 蛋白;0.1 g/L牛血清白蛋白;0.1 g TS引物;2 U Taqase;0.51.0 mg總蛋白。25 20 min，加入0.1 g CX引物。94預(yù)變性5 min，9430 s50 s7290 s 30個(gè)循壞，72延伸10 min。 3.電泳:12%非變性聚丙烯酰胺凝膠，取10 l PCR產(chǎn)物，加2 l 6×Lodding buffer,150 V恒壓2 h。 4.銀染:(1)固定：膠在10%冰乙酸中，洗1次。(2)銀染：0.2%AgNO3 300 ml，加入0.5 ml甲醛，染色10 min，洗1次。(3)顯色：3%Na2CO3 30

5、0 ml,加甲醛0.5 ml，顯色至清晰。(4)終止：10%冰乙酸300 ml，終止顯色。 二、結(jié)果 用非核素TRAP-銀染端粒酶活性檢測(cè)法45例手術(shù)標(biāo)本，腦腫瘤陽性率為70.58%(12/17)，腸癌陽性率為84.62%(11/13)，食管癌陽性率為90%(9/10)，食管癌旁組織陽性率為90%(4/5)，用2種方法對(duì)15例標(biāo)本對(duì)比檢測(cè)，TRAP-ELISA法檢出9例陽性，TRAP-銀染法檢出9例陽性 ，結(jié)果一致。 三、討論 端粒酶活性檢測(cè)常用Kim1的TRAP法，在PCR過程中摻入同位素標(biāo)記-32P dGTP/dCTP，產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳，放射自顯影顯示相差6個(gè)核苷酸的DNA ladd

6、er條帶，以判斷端粒酶活性。該方法敏感，已被國(guó)際上多家實(shí)驗(yàn)室采用，但由于核素，造成檢測(cè)周期長(zhǎng)(約7周)，污染環(huán)境，要求有特殊而專一的實(shí)驗(yàn)室，使其 廣泛應(yīng)用受到限制。為此，我們對(duì)Kim1的方法進(jìn)行改進(jìn)，建立了不需加入核素，直接進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物電泳后硝酸銀染色，顯示DNA梯狀電泳帶的方法。同時(shí)應(yīng)用保靈曼公司的TRAP-ELISA端粒酶活性半定量法，對(duì)照檢測(cè)。兩種方法對(duì)比檢測(cè)結(jié)果一致。說明我們的方法同樣敏感、準(zhǔn)確，且簡(jiǎn)便易推廣。 端粒是真核細(xì)胞染色體末端的“帽子”，由多拷貝串聯(lián)的6核苷酸5TTAGGG3重復(fù)序列和特異蛋白質(zhì)結(jié)合構(gòu)成，具有維持染色體末端穩(wěn)定和遺傳信息不丟失的功能。按照DNA復(fù)

7、制模型，DNA復(fù)制1次，母鏈5端就有1段DNA無法拷貝到子鏈中去，將造成DNA鏈愈來愈短，遺傳信息丟失。真核生物線性DNA分子靠末端6核苷酸多拷貝序列(既端粒)和端粒酶的激活，保證遺傳信息復(fù)制時(shí)的完全性。細(xì)胞生命周期有限 ，染色體端粒隨細(xì)胞的分裂不斷丟失，當(dāng)端粒長(zhǎng)度減小到一定臨界值(24 kb)時(shí)，細(xì)胞即趨向衰老、死亡。端粒被認(rèn)為是細(xì)胞有絲分裂的“生物鐘”2。有報(bào)道癌細(xì)胞和培養(yǎng)的永生化細(xì)胞有較短的端粒長(zhǎng)度和較強(qiáng)的端粒酶活性，正常體細(xì)胞檢測(cè)不到端粒酶活性，而生殖細(xì)胞、胚胎細(xì)胞有端粒酶表達(dá)，可見端粒酶催化合成端粒的重復(fù)片段添加到端粒，對(duì)維持細(xì)胞端粒的動(dòng)態(tài)平衡、保證細(xì)胞的分裂能力起重要作用3，4。我們檢測(cè)17例腦腫瘤中有13例腦膠質(zhì)瘤、10例端粒酶陽性，其中惡性程度低的星形細(xì)胞瘤級(jí)標(biāo)本中端粒酶陽性率為40%(2/5)，而低分化的惡性星形細(xì)胞瘤和級(jí)端粒酶陽性率為100%(8/8