酶化醇解在燃料制造和油處理中的應(yīng)用

1、酶化醇解在燃料制造和油處理中的應(yīng)用摘要生物燃料（脂肪酸甲酯FAMEs）能夠把廢棄的含有一個(gè)脂酶的食用油采用甲基化生產(chǎn)制得，迄今為止被報(bào)道的是在反應(yīng)系統(tǒng)中甲基化程度過低，而且無(wú)酶活性脂酶催化劑不能夠被重復(fù)使用。我們需要澄清的問題是，不溶于甲醇的原因是脂酶的鈍性不能被活化?；谶@一結(jié)果，我們使用不活動(dòng)的假絲酵母屬脂酶逐步發(fā)展成為甲基化體系。全部甲基化是對(duì)來自于廢棄油的生物燃料生產(chǎn)中最有效的部分，此過程可分為兩步：第一步反應(yīng)，處理1/3摩爾質(zhì)量甲醇的化學(xué)數(shù)量，第二步反應(yīng)是，通過增加2/3摩爾質(zhì)量甲醇來反應(yīng)。如果無(wú)活性的輸送物被一個(gè)推動(dòng)反應(yīng)的攪動(dòng)破壞，第三步反應(yīng)將會(huì)發(fā)生作用：第一步的基體是廢棄油和1/

2、3摩爾等量的甲醇，第二步是第一步的流出液和1/3摩爾等量的甲醇，反應(yīng)第三步是第二步的流出液和1/3摩爾等量的甲醇，反應(yīng)在兩個(gè)反應(yīng)體系中廢棄油轉(zhuǎn)化為生物燃料的轉(zhuǎn)化率大于90%，而且脂酶催化劑在一百天之內(nèi)活性不會(huì)消失，這種步驟化的醇解可以被成功應(yīng)用于金槍魚油的醇解。1 介紹環(huán)境污染意識(shí)的增強(qiáng)引發(fā)了零放射物的構(gòu)思和廢棄食用油的全部回收利用的想法，作為一個(gè)世界范圍的社會(huì)問題引起相當(dāng)?shù)淖⒁?。在日本，每年排?00000t廢氣食用油，估計(jì)有一半用作動(dòng)物飼料潤(rùn)濕油和噴漆，剩下的則被排入環(huán)境中。因此，從廢棄使用油中制取生物燃料（脂肪酸甲酯FAMEs）被認(rèn)為是減少和重新回收廢棄油的重要一步。在這一方面，日本的幾

3、個(gè)當(dāng)?shù)卣_始從家庭中收集使用過的廢棄油并且將其轉(zhuǎn)化為供應(yīng)公共交通的生物能源。目前，工業(yè)生產(chǎn)生物燃料通過堿性催化劑甲基化廢棄油來實(shí)現(xiàn)。產(chǎn)物中包括副產(chǎn)物、甘油、堿性催化劑、處理過后的廢棄油等。由此可見，產(chǎn)生的堿水對(duì)環(huán)境產(chǎn)生的多方面影響，而在脂酶催化反應(yīng)中，廢棄油的酶化醇解不產(chǎn)生廢棄物，所以用脂酶來制造生物燃料成為一種必然需求。2 迄今為止有關(guān)酶化醇解的報(bào)道 脂酶不僅被用來水解，而且被用在非水介質(zhì)酯化作用中，脂酶的甘油三酯的甲基化被認(rèn)為是從廢棄食用油中提取生物燃料的一個(gè)最有效的方法。在我們開始研究酶化生物燃料的生產(chǎn)之前，酶化醇解的方法已經(jīng)被報(bào)道。對(duì)于含20水分的長(zhǎng)鏈脂肪醇，使用無(wú)活性的Rhizop

4、us delemar和Rhizomucor miehei的脂肪催化醇解。因?yàn)橹笇?duì)多不飽和脂肪酸的作用弱，金槍魚油和月桂醇反應(yīng)中提出的醇化脂肪酸乙酯，除了多不飽和脂肪酸乙酯轉(zhuǎn)化，還使得乙酯部分含有豐富的（PAFAEE）。魚油的乙醇分解也使其富含多不飽和脂肪酸。當(dāng)沙丁魚和金槍魚油使用了自由的假單細(xì)胞細(xì)菌脂肪酶的乙醇，經(jīng)過一定化學(xué)計(jì)量的醇化的之后，脂肪酸（除了多不飽和脂肪酸以外）轉(zhuǎn)化成乙脂。因此，在甘油脂部分富含二十二碳六烯酸(DHA)和eicosapentaenoic acid（EPA）。除了上述的醇解外，非選擇性的甘油三酯甲基化也被報(bào)道。非活性的假絲酵母屬酯酶和1.7摩爾等量乙醇被用來醇化多不

5、飽和脂肪酸油。因?yàn)檫@種酯酶和飽和脂肪酸對(duì)多不飽和脂肪酸的作用一樣強(qiáng)，油被轉(zhuǎn)化到對(duì)應(yīng)的脂肪酸乙脂上，既使多不飽和脂肪酸中弱活性的脂酶能夠有效的醇解魚油，如果反應(yīng)在一個(gè)有機(jī)溶劑中發(fā)生，在正己烷試劑中使用固定的R.miemei脂酶將沙丁魚和金槍魚油中加入1.3摩爾等量的乙醇醇解，將使90的魚油轉(zhuǎn)化為醇化脂肪酸乙脂。尼爾森et al.首先將甲基甘油三酯的酶化醇解作為生產(chǎn)生物燃料的最終產(chǎn)物。在正己烷試劑中，當(dāng)油和脂肪的醇化與甲醇、乙醇用固定的R.miehei 脂酶，則95的甲基甘油三酯將轉(zhuǎn)化成為對(duì)應(yīng)的甲（乙）酯。在缺乏有機(jī)溶劑的條件下，即使在相似條件中，牛脂甲醇分解的產(chǎn)量只有65。同時(shí)，如將長(zhǎng)鏈醇在有機(jī)

6、自由溶劑系統(tǒng)中作為基體則可增加牛脂的醇化，加入異丙醇反應(yīng)中可達(dá)到90的轉(zhuǎn)化率，而加入異丁醇和2丁醇則可達(dá)到95%的轉(zhuǎn)化率。除此之外，據(jù)報(bào)道，加入甲醇、乙脂固定的C.antarctica 脂酶適合作為醇化甲基甘油三酯的催化劑。先前的報(bào)道可以被總結(jié)如下：（1）加入長(zhǎng)鏈脂肪醇的脂酶醇解的甲基甘油三脂的效率要高于加入甲醇、乙醇的效率。（2）在有機(jī)溶劑中使用甲醇、乙醇的醇解甲基甘油三酯的效率要高于不使用有機(jī)溶劑的。（3）雖然固定的脂酶被用來作為催化劑，但是酶制劑卻不能重復(fù)使用，一個(gè)有機(jī)溶劑系統(tǒng)并不適合從廢棄油中生產(chǎn)生物燃料，因?yàn)榇嬖谥ㄎｋU(xiǎn)和溶液更換的難度。因此，我們的目標(biāo)就是發(fā)展一個(gè)無(wú)溶劑系統(tǒng)，可以

7、保證甲基甘油三酯的轉(zhuǎn)化率大于90。并且催化酶可以長(zhǎng)時(shí)間使用。3 生物燃料的酶制法3.1 不能溶解于甲醇的脂酶的失活大體上，當(dāng)基體彼此互溶，脂酶具有效催化能力。我們第一個(gè)實(shí)驗(yàn)是調(diào)查菜油中脂肪醇的溶解性（一個(gè)大豆和油菜籽油的混合油）。含碳個(gè)數(shù)大于3的脂肪醇，在一個(gè)化學(xué)質(zhì)量單位的脂肪醇能完全溶解于油，而在甲醇和乙醇中的溶解性分別為1/2、1/3。不可忽略的溶解性，至今的報(bào)道中單位化學(xué)質(zhì)量醇化甲基甘油三酯大于單位化學(xué)質(zhì)量的甲醇或乙醇。我們現(xiàn)在意識(shí)到蛋白質(zhì)基本上不能在短鏈醇中存在，例如甲醇和乙醇，因此我們假設(shè)，甲醇（乙醇）分解率過低，通過與油中存在不溶的甲醇相接觸導(dǎo)致脂酶失活。事實(shí)上，使用固定的C.an

8、tarctica脂酶使得小于1/3摩爾等量的甲醇完全消耗在甲醇分解的菜油中,但是通過添加大于1/2摩爾等量的甲醇,則甲醇分解明顯減少（如圖1）。除此以外，所減少的活性不能存儲(chǔ)在1/3摩爾等量的甲醇中，在與不溶于油的甲醇接觸中將導(dǎo)致固定脂酶發(fā)生不可逆性失活。 圖 1 圖 23.2 菜籽油的甲醇分解的步驟由甲醇轉(zhuǎn)化的相應(yīng)的脂肪酸甲脂，固定C.antarctica脂酶的情況下，一個(gè)單位化學(xué)質(zhì)量的甲醇能完成反應(yīng)生成生物燃料由甘油三酸酯轉(zhuǎn)化。然而，通過加入大于1/3摩爾等量質(zhì)量的甲醇會(huì)使其活性喪失，并且甲基化停止。因此，我們?cè)噲D將甲基化的菜油分三步加入1/3摩爾等量的甲醇。第一步，甲基化是在30混合油、

9、1/3摩爾等質(zhì)量的甲醇和4的固定脂酶的混合反應(yīng)，7個(gè)小時(shí)后油的轉(zhuǎn)化率達(dá)到33.1，緊接下來的第二個(gè)步驟1/3摩爾等量甲醇可使轉(zhuǎn)化率在10小時(shí)后達(dá)到66.4，第三個(gè)步驟是1/3摩爾等量的甲醇被加入后，需要24小時(shí)，并且反應(yīng)繼續(xù)（總共48小時(shí)），轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到97.3（如圖2）。經(jīng)過這三步的甲基化被有效并且近似將油完全轉(zhuǎn)化。在甘油三酸酯中甲醇的溶解度很低，但是甲醇在脂肪酸甲酯中的溶解度很高。第一步反應(yīng)可以加入甘油脂，33的脂肪酸甲酯和2/3摩爾質(zhì)量的甲醇，防止全部脂肪酸被混合反應(yīng)全部溶解，發(fā)現(xiàn)在混合甘油酯、脂肪酸甲酯和一定質(zhì)量甲酯混合液中，固定脂酶的活性不失活。這個(gè)發(fā)現(xiàn)直接使得甘油三酸酯的兩步甲基

10、化取得成功。圖2顯示了一個(gè)典型的時(shí)間過程，第一步甲基化在混合油中開始是在30，1/3摩爾等量的甲醇和4wt固定脂酶，在這種情況下，轉(zhuǎn)化率可以7小時(shí)達(dá)到33.2，然后在第10小時(shí)時(shí)加入剩下2/3摩爾質(zhì)量的甲醇油轉(zhuǎn)化為相應(yīng)脂肪酸甲酯轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到96.8（總共34小時(shí)）。通過調(diào)查，對(duì)穩(wěn)定的有活性脂酶進(jìn)行準(zhǔn)備，二步和三步甲基化被重復(fù)進(jìn)行，三步甲基化的步驟如下：第一步反應(yīng)是發(fā)生在30的菜油，1/3摩爾質(zhì)量的甲醇和4wt的固定脂酶組成的混合液中。第二個(gè)和第三個(gè)1/3摩爾質(zhì)量甲醇別在第10小時(shí)和第24小時(shí)時(shí)添加，并且第三步反應(yīng)需要繼續(xù)進(jìn)行24小時(shí)（總共48小時(shí)）。同時(shí)，兩步甲基化反應(yīng)和三步甲基化反應(yīng)是在許

11、多相同條件下進(jìn)行的。在12小時(shí)時(shí)添加2/3摩爾質(zhì)量的甲醇，這個(gè)反應(yīng)還要繼續(xù)24個(gè)小時(shí)（總共36小時(shí)）。這兩個(gè)反應(yīng)后的脂酶再轉(zhuǎn)移到第一步反應(yīng)中的油或甲醇混和液中循環(huán)利用，超過95的轉(zhuǎn)變?cè)谌襟E甲基化反應(yīng)中需經(jīng)歷52個(gè)周期（104天）或者在兩步驟甲基化反應(yīng)70個(gè)周期405天，這剩下的甘油酯并非全部轉(zhuǎn)化為甲基甘油三酯，而是一部分轉(zhuǎn)化。除此之外，F(xiàn)FA含量少于0.25。結(jié)論是同時(shí)水解過程可以忽略。這些結(jié)果指出C.antarctica脂酶能夠使用100多天并且不明顯失活。除此以外，在相同的可耐性條件下兩部甲基化生產(chǎn)率增加了25。3.3 甲醇分解作用下蔬菜油的流動(dòng)性 當(dāng)生物燃料在工業(yè)生產(chǎn)中通過兩步反應(yīng)得到

12、，一個(gè)反應(yīng)者被用作推動(dòng)者。然而，在一個(gè)較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)，使酶載體分解的物資力量被允許在固定的酶中使用。因此，我們?cè)噲D使用一個(gè)兩步的連續(xù)流動(dòng)性反應(yīng)作用于固定的C.antarctica脂酶。這種脂酶和植物油、1/3摩爾質(zhì)量的甲醇混合不會(huì)被鈍化，但是與第一步的流出液和2/3摩爾質(zhì)量的甲醇混合會(huì)產(chǎn)生明顯的鈍化。如先前所做，在第二步反應(yīng)中，添加的2/3摩爾質(zhì)量甲醇不能使脂酶失活。這種差異或許可以通過甲醇分解作用和甘油的副產(chǎn)物的影響來解釋。因?yàn)樗母唣べ|(zhì)相當(dāng)于許多甘油停留在反應(yīng)的底部。甘油擾亂了脂酶分子，并且在反應(yīng)效率反方面逐漸減少，不反應(yīng)的甲醇卻逐漸增多。甲醇通過反應(yīng)轉(zhuǎn)移到了甘油層，并且甲醇在甘油層中的高聚集

13、還引起脂酶的失活。同時(shí)，在兩步反應(yīng)中，一定量的甲醇被混合后，被固定的載體覆蓋在甘油上。因此，兩步反應(yīng)的脂酶不能被甲醇鈍化。 因?yàn)樵诘蜐舛鹊募状贾蠧.antarctica脂酶不能被鈍化，我們?cè)噲D通過三步驟的菜籽油甲酯分解作用來實(shí)現(xiàn)，這個(gè)反應(yīng)在30的（15mm80mm）的反應(yīng)器中加入3g的固定酶反應(yīng)，菜籽油和1/3摩爾等量的甲醇混合物以持續(xù)的流速（60mol/h）進(jìn)入第一反應(yīng)器內(nèi)（33轉(zhuǎn)變）流出液被允許除去甘油，第二個(gè)1/3摩爾質(zhì)量的甲醇被添加到甘油流出液，并且混合物被以固定的流速（6.0mol/h，轉(zhuǎn)化60）混合到第二反應(yīng)器。最后一步在甘油流出液和1/3摩爾等量的甲醇中反應(yīng)流速為(轉(zhuǎn)化，93)。

14、這三步反應(yīng)持續(xù)100天，但是脂酶活性幾乎沒有減弱。最后的產(chǎn)物脂肪酸甘油甲酯的流速略低于前面一系列的反應(yīng)，但是FFA的含量?jī)H為0.2，這剩下的主要部分是乙酸甘油。這些結(jié)果顯示固定的C.antarctica脂酶并不僅僅在第一步中有較高的效率而且在第三步中有較高的效率。 3.4 從廢棄的食用油中生產(chǎn)生物燃料 我們的目標(biāo)是通過酶化使廢棄食用油轉(zhuǎn)化為生物燃料，因?yàn)橛胁襟E地醇解能有效的使菜籽油轉(zhuǎn)化為其相應(yīng)的FAMEs，我們的下一個(gè)目標(biāo)就是從廢棄食用油中生產(chǎn)生物燃料。 在廢棄油的甲醇分解作用中水的作用 新鮮的菜籽油和廢棄的菜籽油之間最主要的差異就在于其中水分和自由脂肪酸含量的不同。廢棄食用油中含有1980P

15、Pm水、2.5%的自由脂肪酸和4.6%的乙酸甘油。我們明白大于500PPm水分將減少甘油三酯的甲基化，但是并不影響反應(yīng)的平衡。因此，我們首先研究水在廢棄油甲基化中的影響。當(dāng)植物油在1/3mol甲醇中甲基化時(shí)在1小時(shí)和7小時(shí)中的轉(zhuǎn)化率分別是90%和33.2%（如圖2）。即使甲醇分解作用被脂肪轉(zhuǎn)移到一個(gè)新鮮的基體之內(nèi)重復(fù)時(shí)，轉(zhuǎn)化率也不會(huì)發(fā)生改變。 廢棄油的醇解作用同樣被重復(fù)（如圖3），在第一周期中，1小時(shí)后的轉(zhuǎn)化比植物油甲醇分解作用慢，這種轉(zhuǎn)化重復(fù)出現(xiàn)頻率增加；在第二、第三、第五周期中轉(zhuǎn)化在一個(gè)小時(shí)后開始；轉(zhuǎn)化率分別為3.0%、8.3%、10.7%。這些結(jié)果表明在反應(yīng)周期中如果有少量水存在的條件下

16、醇解作用也會(huì)被停止，這些水則會(huì)被除去。 圖 3 圖 4 廢棄油醇解作用速率加快的原因可以被解釋為以下幾個(gè)方面：水通過醇解作用首先進(jìn)入甘油層，因?yàn)橹挥兴慌懦龃冀庾饔皿w系之后，反應(yīng)的速度才能漸漸增加。事實(shí)上，在FAMEs層的水含量減少到500PPm，并且5個(gè)周期后甘油層變?yōu)?.7%。當(dāng)33%廢棄油被轉(zhuǎn)化為FAMES，則甘油的含量在這個(gè)反應(yīng)中可被計(jì)算出為3.9%。在油層中水的含量減少到1480PPm（等于1980-500），如果水分轉(zhuǎn)移到甘油層，這個(gè)含量將會(huì)變?yōu)?.2%，這個(gè)和前面一個(gè)一致。這些結(jié)果表明在固定的脂酶中被吸附的水對(duì)于重復(fù)反應(yīng)能達(dá)到持續(xù)的作用，并且含水量不會(huì)因醇解作用而發(fā)生改變。 廢油

17、甲醇分解作用的三步驟 固定的C.antarctica脂酶對(duì)于廢棄油和菜籽油的三個(gè)步驟和5個(gè)周期起著重要的作用，就如圖4所示的那樣在這兩種油間發(fā)生的第一步和第二步醇解作用過程中沒有存在明顯的差異，并且在第一步和第二步反應(yīng)之后，F(xiàn)AME的含量分別達(dá)到34%和36%。然而廢棄油在第三步醇解作用之后其轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到90.4%，而菜籽油的轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到95.9%。這種差異可以被歸結(jié)為廢棄油中被氧化的脂肪酸化合物。一般來說，當(dāng)菜籽油被用作煎炸時(shí)，一些脂肪酸通過氧化作用可以轉(zhuǎn)化為過氧化物，乙醛、聚合物等。因?yàn)檫@些脂酶不能識(shí)別這些混合氧化物，而且廢棄油的轉(zhuǎn)化率僅僅減少了一點(diǎn)。另外，自由脂肪酸在第三步反應(yīng)后的含

18、量（0.3%）低于在廢棄油中的含量（2.5%），說明自由脂肪酸的醇解產(chǎn)物發(fā)生在油的醇解作用之后。 為了證明脂酶的穩(wěn)定性，這三步醇解作用反應(yīng)重復(fù)發(fā)生并轉(zhuǎn)化為新的物質(zhì)。第一步，10小時(shí)；第二步，14小時(shí)；第三步，24小時(shí)。在50個(gè)周期后（100天）后這種轉(zhuǎn)變并沒有明顯減少，表明在廢棄油中的污染并沒有明顯影響脂酶的穩(wěn)定性。 圖 53.5粗油中提取生物燃料 廢棄食用油是制造生物燃料的合適的材料，而且粗食用油也是合適的材料。因此我們?cè)噲D從大豆粗油中提取生物燃料（細(xì)節(jié)就在以下的報(bào)告中）。但是使用固定的C.antarctica脂酶的甲醇分解作用不能使粗油制成相應(yīng)的FAMEs。在可食用油的精練過程中，抽出的下

19、一個(gè)步驟是提純。因此，我們通過對(duì)粗大豆油的甲醇分解作用的三個(gè)步驟來實(shí)現(xiàn)。與精練油的醇解作用相比較每個(gè)步驟的反應(yīng)速度是其的一半，在三個(gè)步驟中其轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到多于90%，并且固定的脂酶可以使用多于20個(gè)周期（50天）。大豆樹膠的主要組成部分是磷脂（PLs），并且每增加1%的大豆磷脂在精練大豆油中就可以限制醇解作用。此外，已經(jīng)在被應(yīng)用與大豆粗油醇解作用的固定的脂酶中提取的磷脂體積比為2：1。這些結(jié)果都表明了磷脂在固定的載體周圍跳躍并且干擾有基體的脂酶的交互作用。因此這種油被用來做為剩余食用油的基體。4 使用自由脂酶的TAGs的甲醇分解作用 就先前所敘述，Dr.Haraldsson et al。報(bào)道魚

20、油的醇解必須使用大量的Pseudomonas脂酶（大約占混合質(zhì)量的10%）。我們假設(shè)必須要運(yùn)用大量的脂酶。因此，如果失活的酶被去除掉，那么僅僅需要少量的就可以達(dá)到很高的效率。Prof.Fukuda，Kobe大學(xué)的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在含有10%-30%的水反應(yīng)混合物中使用自由的Rhizopus oryzae脂酶通過三步反應(yīng)可以使80-90%的大豆油轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的FAMEs。這些結(jié)果表明脂酶的失活是由于甲醇被水稀釋的緣故。這個(gè)反應(yīng)包含了大量的水，但是TLC分析表明了大量的自由脂肪酸在反應(yīng)的早期階段被發(fā)現(xiàn)但是在反應(yīng)結(jié)束的時(shí)候含量卻非常低。這表明大豆油連同它的醇解作用中發(fā)生了一個(gè)水解的事實(shí)。然而，脂酶強(qiáng)烈的作用于

21、甲醇催化自由脂肪酸的酯化作用和FAME的弱的水解作用，在反應(yīng)結(jié)束的時(shí)候自由脂肪酸的含量降低。在這個(gè)研究的影響下，我們使用固定的C.antarctica脂酶在水存在的條件下發(fā)生TAGs的醇解作用。5 醇解在油處理過程中的應(yīng)用5.1魚油的所含有的酶解分解的乙醇。UFAs有各種不同的生理學(xué)的功能，而且被由于各種不同的區(qū)域。日本環(huán)保署在1991年的時(shí)候就把甲脂作為動(dòng)脈硬化和yperlipemia的治療。二十二碳六烯酸的生理學(xué)方面的作用已受到環(huán)保署的重視，已證明在大腦和細(xì)胞膜的發(fā)育方面有重要的生理作用。除此之外，二十二碳六烯酸能加快嬰兒大腦的發(fā)育。因?yàn)檫@些理由，十二碳六烯酸的甲酯現(xiàn)在被認(rèn)為可以當(dāng)作一種藥

22、品可以使用，目前迫切的需要掌握他的提取方法。 5.2金槍魚油醇解作用的步驟化我們首先研究乙醇使固定C.antarctica脂酶的失活。這種酶在2/3mol質(zhì)量的乙醇存在時(shí)也可以使其失活。為了避免這種失活，第一步醇解作用是在40的混合金槍魚油，1/3mol質(zhì)量的乙醇，使用4wt%的固定脂酶的條件下進(jìn)行。這個(gè)反應(yīng)完全消耗乙醇需要10個(gè)小時(shí)，有33%的金槍魚油轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的乙酯。在第一步反應(yīng)中總的脂肪酸消耗完之前存在2/3mol質(zhì)量的乙醇可以使脂酶避免失活?；谶@些結(jié)果，兩步和三步金槍魚油的乙醇分解作用反應(yīng)條件的不同可以被列舉在以下內(nèi)容。兩步反應(yīng)：第一步在10克金槍魚油在40，1/3mol質(zhì)量乙醇，4

23、wt%固定的脂酶條件下保持12小時(shí)；第二步增加2/3mol質(zhì)量的乙醇下進(jìn)行36個(gè)小時(shí)（總共為48小時(shí)）。三步反應(yīng)：第一步反應(yīng)兩步反應(yīng)的第一步一樣；第二步反應(yīng)和第三步反應(yīng)分別在12小時(shí)和24小時(shí)后添加1/3mol質(zhì)量的乙醇，并且第三步反應(yīng)持續(xù)24小時(shí)（總共48小時(shí)）。通過調(diào)查酶的穩(wěn)定性，在新的基體中第二步和第三步反應(yīng)可以重復(fù)進(jìn)行。這些結(jié)果如圖6所示。兩步反應(yīng)的醇解作用的轉(zhuǎn)變到第37個(gè)周期才開始減少，并且迅速的減少。然而，三步反應(yīng)的轉(zhuǎn)化可以維持到第54個(gè)周期（108天）。5.3兩步醇解作用中的脂酶的失活 在表6中描述的三步反應(yīng)，這個(gè)固定脂肪酶的活性在使用了54個(gè)周期之后其最初活性降低了32%。這也表現(xiàn)出一些乙醇仍然存在于第一步反應(yīng)中。從這個(gè)結(jié)果